全 文 ：稳心颗粒甘松提取物对大鼠心室肌细胞钠电流
和瞬时外向钾电流激活动力学的影响
刘元伟　郭继鸿　张萍　李继文　李春
[摘要 ] 　目的　研究步长稳心颗粒中甘松提取物对大鼠心室肌细胞钠电流(INa)、瞬时外向钾电流(Ito)激活动力学
的影响。方法　采用全细胞膜片钳技术 , 研究 10 g/L甘松提取物对急性分离的成年大鼠心室肌细胞 INa、Ito激活动力
学的影响。结果　①10 g/L甘松提取物使大鼠心室肌细胞 INa峰值(INa, max)从 -58.96±2.71pA/pF降至 -31.66±1.
29 pA/pF(n=5, P<0.01);②10g/L甘松提取物使 Ito峰值(Ito, max)由 3.40±1.52 pA/pF降到 1.43±0.64 pA/pF(n
=7, P<0.05)。 10g/L甘松提取物对 INa和Ito的抑制率分别达 38.2%和 57.9%。结论　10g/L甘松提取物对大鼠
心室肌细胞 INa、Ito具有显著抑制作用。
[关键词 ] 　心血管病学;甘松;全细胞膜片钳;钠电流;瞬时外向钾电流
中图分类号　R331.3+8　　文献标识码　A　　文章编号　1007-2659(2009)06-0533-03
作者单位:北京大学人民医院心脏电生理室(北京 100044)
作者简介:刘元伟(1976-),男(汉族),山东临沂人 ,医学博士 ,主要
从事心脏电生理基础与临床研究。
通讯作者:张萍
Theeffectsofnardostachyschinensisbatalextractonthesodiumcurrentandtransientoutwardpotassiumcurrent
ofratventricularmyocytes.LIUYuan-wei, GUOJi-hong, ZHANGPing, LIJi-wen, LIChun.DepartmentofCardiacE-
lectrophysiology, People′sHospital, PekingUniversity, Beijing100044, China
Correspondingauthor:ZHANGPing
[ Abstract] 　Objective　Tostudytheeffectsofnardostachyschinensisbatalextract(NcBe)ontheactivationkineticsofrat
cardiacsodiumchannelsandtransientoutwardpotassiumchannels.　Methods　Wholecelclamptechniquewasusedtoin-
vestigatetheeffectsofNcBeonsodiumcurent(INa), transientoutwardpotassiumchannelsoftheacutelydissociatedadult
ratventricularmyocytes.　Results　NcBeat10 g/LdecreasedpeakINa(INamax)from-58.96±2.71pA/pFto-31.66
±1.29 pA/pF(n=5, P<0.01), inhibitedpeakIto, maxfrom3.40±1.52 pA/pFto1.43 ±0.64 pA/pF(n=7, P<0.
05).Theinhibitionrateswere38.2%, 57.9%, respetively.　Conclusions　NcBesignificantlyblocksINaandIItoofrat
ventricularmyocytes.[ ChineseJournalofCardiacPacingandElectrophysiology, 2009, 23(6):533-535]
[ Keywords] 　Cardiology;NardostachyschinensisBatal;Wholecellpatchclamp;Sodiumcurrent;Transientoutward
potassiumcurrent
　　甘松主要生长于海拔 3 000 ～ 4 500米的高山草
原地带 ,在我国主要分布于甘肃 、青海 、四川 、云南西
北部等地。甘松提取物取自败酱科植物甘松(nar-
dostachyschinensisbatal)或匙叶甘松(nardostachys
jatamansiDC.)的干燥根及根茎 ,其化学成分相当
复杂[ 1, 2] ,包括酮 、醇 、醚 、酸等类物质。甘松在临床
上具有理气止痛 ,开郁醒脾之功效。甘松是步长稳
心颗粒中的重要成分之一 。稳心颗粒的动物实验和
临床应用表明甘松具有较好的抗心律失常作
用 [ 3, 4] ,但目前尚不清楚其抗心律失常的确切电生
理机制 。笔者通过全细胞膜片钳技术 ,研究甘松提
取物对急性分离 SD大鼠单个心室肌细胞钠电流
(INa)和瞬时外向钾电流(Ito)激活动力学的影响 ,探
讨其抗心律失常的离子机制 。
1　材料与方法
1.1　溶液及试剂
1.1.1　分离心肌的溶液　 ①无 Ca2+灌流液(mmol/L):
NaCl130、KCl5.4、牛磺酸 20、丙酮酸钠 5、肌酐 5、 MgCl2 5、
NaH2PO4 1、HEPES10、Glucose10, PH用 NaOH调至 7.30;②
含 750 μmol/LCa2+的灌流液为无 Ca2+灌流液加 750 μmol/
LCa2+;③含 EGTA的无 Ca2+的灌流液为无 Ca2+灌流液加
3.3 μmol/LEGTA;④胶原酶酶解液为无 Ca2+灌流液加 100
μmol/LCa2++0.3mg/mLⅡ型胶原酶。
1.1.2　记录电流的溶液　Ito灌流液(mmol/L):无 Ca2+灌流
液 0.1 mmol/LCaCl2 +0.5 mmol/LCdCl2。 Ito电极内液
(mmol/L):KCl130、HEPES5、K2ATP5、MgCl2 5、EGTA 10、
·533·　中国心脏起搏与心电生理杂志 2009年第 23卷第 6期　
磷酸肌酸 5,用 KOH调 pH至 7.30。 INa灌流液(mmol/L):氯
化胆碱 80、NaCl60、KCl5、CsCl10、CaCl2 0.1、4-氨基吡啶(4-
AP)5、 MgCl2 5、HEPES10、Glucose10, pH用 NaOH调至 7.30。
INa电极内液(mmol/L):CsCl120、NaCl10、CaCl2 1、MgCl2 2、
EGTA11、HEPES10、Na2ATP2, CsOH调 pH至 7.20。
1.1.3　试剂　KCl、牛磺酸 、肌酐 、氯化胆碱 、CsOH、BaCl
2
、
CdCl2 、K2ATP、Na2ATP为 Sigma试剂;Ⅱ型胶原酶为 Gibco
试剂;HEPES、EGTA、CsCl为 Amresco试剂;其他为国产分析
纯。所用甘松提取物由步长公司提供 ,滤器过滤后 , 用电极
外液配成 10g/L浓度。
1.2　SD大鼠心室肌细胞的分离　参考文献 [ 5]的方法并略
作改进 , 通过 Langen-Dorff灌流装置 , 使用 Ⅱ型胶原酶酶解
法分离心肌细胞。简要过程如下 , 选择 200 ～ 250 g的健康
雄性 SD大鼠。 50 mg/kg戊巴比妥腹腔麻醉后脱颈致死。
迅速打开胸腔 , 剥脱心包 , 左手持住心脏 , 稍向外拉 , 在主动
脉第一分叉处剪断 ,迅速置于含 750μmol/LCa2+的 4℃灌流
液中 , 稍加揉捏挤出心内血液。将心脏固定于 Langen-Dorf
灌流上后 , 打开蠕动泵 ,经主动脉逆行灌流(水温 36℃, 2ml/
min),开始灌流含 750 μmol/LCa2+的灌流液 1 min, 心脏搏
动排出冠状动脉内血液。然后灌流含 EGTA的无 Ca2+灌流
液 5 min, 使心脏停搏 ,细胞基质解离。然后灌流含 0.3 mg/
mlⅡ型胶原酶(Gibco)的灌流液 10 ～ 15min。当心脏开始变
软 , 再用无 Ca2+灌流液灌流 3 min,冲洗胶原酶。剪下心室 ,
在无 Ca2+灌流液中匀浆。通过 100目细胞筛除去组织块 ,
室温静置 1 h后 ,梯度复钙。
1.3　全细胞膜片钳记录　使用膜片钳放大器(EPC-10, HE-
KA)的全细胞模式记录全细胞膜电流 [ 8] 。通过 Pulse+Puls-
efit8.74软件采集与分析数据。从烧杯底部取一滴细胞加
到体积约 400μl灌流槽内 , 静置 10 ～ 15 min细胞贴壁后 , 无
Ca2+灌流液冲洗死细胞及碎屑。然后分别以加甘松 10 g/L
前后的 INa灌流液和 Ito灌流液持续灌流。灌流 5 min后首先
记录无甘松时的电流 , 然后以含 10 g/L甘松灌流液灌流 5
min后在同一细胞进行加甘松后的电流记录。带芯玻璃毛
坯(正天易公司)经微电极拉制仪二步法拉制成尖端为 1 ～
1.5 μm的电极 , 电极充灌内液后电极阻抗为 1.5 ～ 3 MΨ。
挑选边缘整齐 , 横纹清晰 , 表面无颗粒 、无空泡 、无收缩的细
胞进行实验。进行液接电位补偿后 , 调节三维操纵器(MP-
285, Suter)使电极尖端移向细胞表面 , 稍加负压 , 当阻抗达
到 1 GΨ以上 , 补偿快电容 , 吸破细胞膜形成全细胞记录模
式后 , 调节慢电容补偿和串联电阻补偿(补偿≥70%)以减
少电容电流和钳制电位误差。信号采集的采样频率 20kHz,
低通滤波 4kHz。所有实验均在室温下进行(22 ～ 25℃)。 Ito
的幅值为其峰值与刺激结束稳态值的差值。电流强度除以
相应膜电容得到电流密度。以测试电压为横坐标 ,相应电压
的电流密度为纵坐标作图即得 Ito电流-电压(I-V)曲线 , 其
代表了离子通道的激活特性。
1.4　统计学方法　使用 Pulse+Pulsefit8.74(HEKA)软件记
录和分析膜电流。所有数据均以 x±s表示。使用 Graphpad
prism 4绘制 I-V曲线 , 甘松作用前后的比较采用配对 t检
验 ,以 P<0.05为差异有显著性。
2　结果
2.1　10 g/L甘松提取物对 INa的影响　在低钠环境
下记录 INa,灌流液中的 CsCl及 4-AP可以抑制钾电
流 , 0.2 mmol/LCd2+抑制钙电流 ,排除干扰。细胞
破膜后钳制于 -120 mV,指令电压从 -80 mV去极
化至 +60 mV,阶跃 10 mV,步长 30 ms,刺激频率 0.
5Hz,可记录到快速激活 、快速失活的尖峰状内向电
流。 10 g/L甘松提取物明显抑制 INa(图 1)。 INa在
指令电压为 -70mV时开始激活 , -10 mV时达峰
值。对照组 、 10 g/L甘松提取物组钠电流峰值
(INa, max)分别为 -58.96 ±2.71pA/pF和 -31.66 ±
1.29pA/pF,与对照组相比 10 g/L甘松提取物灌流
组 INa峰值降低 38.2%,差异有显著性(n=5, P<0.
01)(图 2)。 I-V曲线显示 10 g/L浓度的甘松提取
物使不同钳制电压水平的 INa幅度减小(图 3)。
2.2　10 g/L甘松提取物对 Ito的影响　细胞外液加
0.03 mmol/L河豚毒 ,阻断钠通道 ,加 0.2 mmol/L
Cd2+阻断 L型钙通道 ,加 0.2 mmol/LBaCl2阻断内
向整流钾电流(IK1),排除对 Ito的干扰 。使用全细胞
电压钳技术 ,膜电位钳制于 -40 mV,指令电压从 -
30 mV到 100 mV,阶跃 10 mV,步长 300 ms,刺激频
率 0.2Hz, 记录 Ito。该电流可以被 2mmol/L4-AP
·534· 　稳心颗粒甘松提取物对大鼠心室肌细胞钠电流和瞬时外向钾电流激活动力学的影响　
图 3　 10g/L甘松对 INaI-V曲线的影响
阻断。 10 g/L甘松提取物使 Ito幅值明显下降(图
4)。从钳制电压 -40mV除极至 100 mV时 , 10 g/L
甘松提取物使 Ito幅值从 3.40±1.52pA/pF降到 1.43
±0.64 pA/pF(n=7, P<0.05),抑制率达 57.9%
(图 5)。Ito自 10 mV开始激活 ,随膜电位去极化程
度增加而增加(图 4, 5),以各脉冲下电流密度幅值
及相应的膜电位作图得到 Ito的 I-V曲线(图 6)。 10
g/L的甘松提取物使不同钳制电压水平的 Ito幅度减
小 , I-V曲线右移(图 6)。
3　讨论
笔者研究了 10g/L甘松对成年大鼠心室肌细胞
钠 、钾通道的作用。药物剂量参考了唐其柱等[ 7]对
兔心室肌的研究。结果发现在 10g/L浓度水平 ,甘
松能明显抑制钠电流 , 与在兔心室肌的结果一
致[ 7] 。钠电流是心室工作细胞 0期除极的介导电
流 ,抑制钠电流会降低除极速度 ,减弱可兴奋性 ,减
慢传导。具有类似 Ⅰ类抗心律失常药物的作用。实
验还发现该浓度的甘松能显著抑制 Ito电流 。Ito介导
1期复极 ,它的激活形成动作电位平台期前的切迹 ,
与 J波的发生相关 [ 8, 9] 。Ito在心脏的分布具有明显
异质性 ,主要分布于中外层 ,内层密度很低 ,而且右
室分布密度大于左室 [ 9] 。心内膜 Ito增强而中外层
减弱导致动作电位穹窿消失 ,动作电位跨膜离散增
大 ,易于发生 2相折返 ,诱发室性心动过速 、心室颤
动。阻断 Ito可使动作电位穹窿恢复 , ST段正常化 ,
防止室性心动过速 、心室颤动的发生 。甘松的显著
抑制 Ito的作用可能具有重要的抗心律失常价值 。
抗心律失常中草药与西药相比具有一定的优
势 ,如药效温和 、毒副作用轻微 ,但是中草药成分复
杂 ,药物批次间成分变异大 ,有效成分的含量难以控
制 ,作用机制难以解释。本实验为阐明甘松抗心律
失常机制提供了一些基础 。但是 ,还需要进一步深
入研究其纯化组成成分的独立的药理作用 ,为分离
提纯其有效成分 ,发现新型抗心律失常药物提供参
考。
参考文献
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与心电生理杂志 , 2008, 22(1):6 (2009-04-16收稿)
(李晓清编辑)
·535·　中国心脏起搏与心电生理杂志 2009年第 23卷第 6期