全 文 ：书收稿日期:2012-06-19; 修订日期:2012-10-22
基金项目:国家自然基金资助 ( No． 30660060) ;
江西省自然科学基金( No． 2010GZY0082) ;
江西省卫生厅重大科技计划项目( No． 20084001)
作者简介:刘艳阳( 1968-) ，女( 汉族) ，江西宁岗人，现任江西省人民医院
主治医师，学士学位，主要从事心脏电生理研究工作．
* 通讯作者简介:葛郁芝( 1950-) ，男( 汉族) ，江西高安人，现任江西省人
民医院教授，主任医师，博士研究生导师，博士学位，主要从事心内科临
床、心电生理研究工作．
中药甘松挥发油对 HEK细胞
Nav 1． 5 电流频率依赖性阻滞的影响
刘艳阳1，葛郁芝1，2* ，Jay Z． Yeh2
(1．江西省人民医院·江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006;
2． Northwestern Medical University Department of Pharmacology Chicago IL USA 60611)
摘要:目的 研究中药甘松挥发油对 HEK细胞 Nav1． 5 电流频率依赖性阻滞的影响。方法 用 Nav1． 5 细胞，采取膜片钳
技术直接记录甘松挥发油( VONCB) 对 HEK细胞 Nav1． 5 电流频率依赖性阻滞。结果 VONCB 对 HEK 细胞表达的鼠心
肌 Na +通道的具有阻滞作用。5 ppm VONCB在 － 100 mV电压钳制下，导致 20%Na +电流抑制，静息状态产生轻微阻滞;
VONCB对 Na +通道抑制随刺激频率增加( 1 ～ 20 Hz) 而增加，产生明显的 Na +通道频率依赖性阻滞。结论 VONCB 对
HEK细胞表达的 Nav1． 5 通道的具有频率依性阻滞作用，VONCB 对 Na
+通道抑制随刺激频率增加( 1 ～ 20 Hz) 而增加。
关键词:HEK细胞; Nav1． 5; 膜片钳; 甘松挥发油; 频率依赖性阻滞
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2013． 01． 007
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2013) 01-0015-02
The effects of Volatile Oil of Nardostachys Chinesis Batal ( VONCB) on frequency － de-
pendant block of Na + channels ( Nav1． 5) in human embryonic kidney ( HEK) cells
LUI Yan-yang1，GE Yu-zhi1，2* ，Jay Z． Yeh2
( 1． Jiangxi Provincial People＇s Hospital，Jiangxi Cardiovascular Disease Ｒesearch Institute，Nanchang，330006，
China; 2． Northwestern Medical University Department of Pharmacology Chicago IL USA 60611，China)
Abstract: Objective To verify the effects of Volatile Oil of Nardostachys Chinesis Batal ( VONCB) on frequency － dependant
block of Na + channels ( Nav1． 5) in human embryonic kidney ( HEK) cells． Methods This experiment employed patch － clamp
technique，VONCB and Nav1． 5 in HEK． Ｒesults 1． VONCB 5ppm ，at holding potential － 100mV，the interval 30s，decreed 20%
amplitude of sodium current，it is resting block． 2． VONCB 5ppm showed frequency － dependant block of sodium channel ( Nav1．
5) in HEK by increasing frequency from 1 to 20 Hz． Conclusion The results suggested that VONCB showed frequency － depend-
ant block of Nav1． 5 in HEK by increasing frequency from 1 to 20 Hz．
Key words: HEK cells; Nav1． 5; Patch － clamp; VONCB; Frequency － dependence block
中药甘松挥发油通过影响细胞钠电流来抗心律失常的研究
已经有不少报道［1，2］。多数抗心律失常药主要通过阻滞心肌细
胞钠电流来抑制异位激动和传导而达到抗心律失常的目的。现
已证实阻滞分两种，即静息阻滞(resting block)和相位阻滞(pha-
sic block) ，后者也称为频率依赖性阻滞，该阻滞发生在细胞除极
相，可致单纯直接阻滞(此时 Na +电流失活除外) ，而发生在两次
除极间歇期则非简单的阻滞作用。研究发现此期间钠电位阻滞
随时间的变化钠电位而逐渐恢复，而钠电位(holding potential)高
低对钠电流阻滞敏感性也不同［1 ～ 3］。分离心肌细胞测定钠通道
功能不得不用许多药物来阻断钠通道或其它通道，另外药物的使
用也影响结果可靠性，同时也增加了操作的复杂性。HEK Nav
1． 5是指用鼠 cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞(HEK)
上表达而致的一种仅有纯钠通道的细胞［6 ～ 8］。本文旨在找出
VONCB对 HEK细胞 Nav1． 5 电流频率依赖性阻滞的影响。
1 材料与方法
1． 1 HEK细胞 Nav1． 5 用鼠 cDNA编码组成的纯钠通道在人胚
胎肾细胞(HEK)上表达而致的一种仅有纯钠通道的细胞［4 ～ 6］
Nav1． 5(由美国西北大学药理分子生物学系 Yeh Jay Z． 教授提
供)。
1． 2 药物及试剂 中药甘松挥发油已有报道［1，2］，甘松挥发油经
称取阴干后的甘松样品 1 000 g，按《中国药典》(一部)甲法进行
水蒸馏提取，经 6 h后停止加热，静置过夜，油水相分离后得浅绿
色油状液体，用双向溶剂二甲基亚砜，按 1∶ 200 的比例进行稀
释。
1． 3 膜片钳记录使用的仪器与设备 膜片钳放大器 Axon /USA
(Axopatch 200B mplifier /pClamp9 /Digidata pack1322A) ，精密微操
纵器 SD /USA(MX7600 /Ｒ Motorized Manipulator /MC 1000e Con-
troller /Amplifier headstage mount) ，荧光倒置显微镜，03 － D 型玻
璃微电极拉制仪，MPS多通道快速微量加药系统，防震台，玻璃电
极管经微电极拉制仪二步法拉制电极拉制成尖端 1 ～ 1． 5 μm 的
电极，电极充灌内液，入水阻抗为 1 ～ 2MΩ［6，7］。
1． 4 膜片钳记录程序与方法 数控恒温槽在电压钳制模式下，根
据钳制电位的不同，分别测量 Na +离子通道电流。用滴管吸数滴
细胞保存液或用附有细胞的载薄片加入灌流槽中，放置在倒置显
微镜工作台上，用含 100%饱和氧细胞外液以灌流装置灌流，选
择纹理清晰，表面无颗粒，无收缩的细胞作为实验对象。使电极
尖端移向细胞表面，再进行封接，当阻抗达到 1GΩ 以上，补偿快
电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式，调节慢电容补偿和串联
·51·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 1 时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 1 期
书电阻补偿以减少瞬时充放电流和钳制电位误差。膜片钳放大器
与计算机相连，信号发放和采集均由软件完成并存储在硬盘内，
供测量和分析用［6，7］。
1． 5 膜片钳记录溶液 记录外部溶液(External Solution) :NaCl
130 mM，CaCl2 2mM，CsCl 5mM，MgCl2 1． 2mM，HEPES 10mM，Glu-
cose 5 mM，at PH 7． 4 adjusted with CsOH。记录内部溶液(Internal
Solution) :． aspartic acid 50 mM，CsCl 60mM，Na2ATP 5mM，EGTA
11mM，HEPES 10 mM，CaCl2 1mM，and MgCl2 1mM，at pH 7． 2 ad-
justed with CsOH［4 ～ 7］。
2 结果
用 Nav1． 5 细胞用于 VONCB 研究。见图 1:VONCB 对 HEK
细胞表达的鼠心肌 Na +通道的阻滞作用。图 1A:刺激频率低(1 /
30 s) ，VONCB 对静息状态产生轻微阻滞;图 1B、C 和 D:呈现明
显的 Na +通道频率依赖性阻滞。这些特性是许多 Ib类抗心律失
常药的 Na +通道的标志性作用。
HEK细胞表达 Nav1． 5(鼠 cDNA 基因密码组成的心肌细胞 Na + 通
道) ，应用全细胞膜皮钳记录 Na +电流。
A =5ppm VONCB 在 － 100mV电压钳制下，导致 20% Na +电流抑制，
由于应用除极脉冲刺激间隔 30s，因此属通道静息状态下产生阻滞。
B = VONCB 频率依赖性阻滞:VONCB对 Na +通道抑制随刺激频率增
加(1 ～ 10Hz)而增加。
C =频率依赖性阻滞时相表:阻滞的发生随除极频率增加而加速。
D = VONCB 阻滞随刺激频率增加而提高。在 20 次刺激后，频率达到
10Hz，对照组(黑高柱)钠电流并不降低，而当 VONCB浓度达 5 ppm VON-
CB时，Na +电流呈现频率依赖性降低(灰低柱)
图 1 HEK细胞表达的 Nav1． 5 通道的频率依赖性阻滞
3 讨论
VONCB 通过影响细胞钠电流来抗心律失常的研究已经有不
少报道［3 ～ 5］，本研究应用 HEK 细胞 Nav1． 5 研究 VONCB 的静息
及相位阻滞国内未见报道［9，10］。HEK Nav1． 5 是指用鼠 cDNA 编
码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞(HEK)上表达，而致的一种
仅有纯钠通道的细胞，该种细胞是当前国际上流行使用的纯钠通
道细胞，以代替以往通常使用的动物心肌细胞分离，为了测定钠
通道功能而不得不用许多药物来阻断钠通道或其它通道，后者其
不利之处是操作复杂，药物使用而结果不甚可靠，HEK Nav1． 5 细
胞的使用是膜片钳技术与分子生物学基因重组技术的结合，为重
新研究以往用老方法研究的一些抗心律失常药和开发新药提供
了新的可靠方法［11，12］。
从图 1A 中可见 VONCB 5ppm 浓度对静息状态仅产生轻微
阻滞作用(仅 20%) ，这一点说明在正常静息电位状态下，(相当
于正常心肌细胞的静息电压) ，VONCB 的作用微弱，该结果证明
VONCB 在一般剂量下对正常心肌抑制作用很小。相反，随着心
搏频率增加(1 ～ 20 Hz) ，VONCB 对 Na +通道的抑制随频率增加
而增加(图 1B、C、D) ，从中可见 VONCB 对快速心律失常具有明
显的抑制作用。钠通道失活具有频率依赖性早在 1973 年 Stri-
charta［1］就已提出，随后多年努力证实，快钠失活不能仅用频率依
赖性阻滞电的缓慢恢复来解释而是药物的作用，根据我们已往的
实验［6，7］，频率依赖性阻滞的恢复受三种因素影响，即恢复时间，
细胞电位高低和是否有药物作用，低剂量的 VONCB 对静息状态
阻滞，证明此时细胞已处于完全恢复的静息状态，电压也处在正
常静息电压，而在高频率刺激状态下，细胞可能发生钠电流并未
完全恢复至正常状态，此时细胞对低剂量的 VONCB 就十分敏
感，是否这点能解释 VONCB 抗快速异位室性心律失常的机制，
主要通过抑制缺血缺氧的细胞所发生的异位激动和延缓传导等
而达到抗心律失常，有待我们进一步实验证明。因为本实验是用
HEK细胞 Nav1． 5 作为实验靶细胞，该细胞仅有一种纯钠通道，
因此实验无其它通道的干扰与影响。
参考文献:
［1］ 杨 涛，葛郁芝，罗 骏，等．甘松挥发油对大鼠心室肌细胞膜钠通
道的影响［J］．时珍国医国药，2010，21(2) :284．
［2］ 葛郁芝，吴志婷，胡朗吉，等．中药甘松挥发油对 HEK 细胞 Nav1． 5
电流电压及电导电压的影响［J］．时珍国医国药，2009，20(1) :1．
［3］ Yeh JZ，Teneick ＲE． Molecular and structural basis of resting and use －
dependent block of sodium current defined using disopyramide ana-
logues［J］． Biophys J，1987，51:123．
［4］ Clarkson CW，Yeh JZ． Evidence for two components of sodium channel
block by VONCB in isolated cardiac myocytes［J］． Circulation Ｒe-
search，1988，63:869．
［5］ Follmer CH，Teneick ＲE，Yeh JZ． Sodium current kinetics in cat atrial
myocytes［J］． J physiol，1987，384:169．
［6］ Megan M． McNulty，Dorothy A． Hanck． State － Dependent Mibefradil
Block of Na + Channels［J］． Mol Pharmacol，2004，66:1652．
［7］ Shin，D． － J． A novel mutation in the SCN5A gene is associated with
Brugada syndrome［J］． Life Sciences，2006，10:025．
［8］ Balser JＲ． The cardiac sodium channel:gating function and molecular
pharmacology［J］． J Mol Cell Cardiol，2001，33:559．
［9］ YZ Ge，JZ Yeh，Xilong Zhao． The effects of the volatile oil of Gansong
on the Cardiac Sodium Channels［J］． Clinical Cardiology，2005，28:33．
［10］ 刘冬生，葛郁芝．中药抗心律失常的心电生理研究近况［J］．中国心
血管病研究杂志，2004，2(9) :744．
［11］ Auld VJ，Goldin AL，Krafte Ds，Marshall J，Dunn JM，Catterall WA，
Lester HA，Davidson N，and Dunn ＲJ． A rat brain Na + channel alpha
subunit with novel gating properties［J］． Neuron，1988，1:449．
［12］ Ong BH，Tomaselli GF，Balser JＲ A structural rearrangement in the so-
dium channel pore linked to slow inactivation and use dependence［J］．
Gen Physiol，2000，116(5) :653．
·61·
时珍国医国药 2013 年第 24 卷第 1 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2013 VOL． 24 NO． 1