全 文 ： 药理药化
收稿日期:2008-08-22;　修订日期:2008-11-06
基金项目:国家自然科学基金(No.30660060)
作者简介:葛郁芝(1950-),男(汉族),江西高安人 ,现任江西省心血管病研
究所教授,博士生导师 ,博士学位 ,主要从事心律失常与心理生理研究工作.
中药甘松挥发油对 HEK细胞 Nav1.5电流电压
及电导电压的影响
葛郁芝1, 2 ,吴志婷 1 ,胡朗吉1 , YehJayZ2
(1.江西省人民医院 ·江西省心血管病研究所 ,江西 南昌　330006;
　2.美国西北大学医学院 ,美国芝加哥　60611)
摘要:目的 应用膜片钳技术研究 HEK细胞 Nav1.5电流电压依赖性 Na+电流失活与激活曲线 , 甘松挥发油对电流 -电压
关系(I-V),电导 -电压关系(G-V)曲线的影响 , 以及对快 Na+通道失活(H-I)的影响。方法 应用膜片钳技术研究
HEK细胞 Nav1.5电压依赖性 Na+电流失活曲线 , I-V和 H-I曲线。结果 正常自然依赖性失活曲线向超极化移位, 移动速
度 10min内是 4mV。甘松挥发油能降低 I-V曲线 Na电流的峰电位, 但不能改变其 Na电位(ENa)从内流向外流的反转电
位的方向。G-V曲线明显向超极化方面移动 , Vg
1/2 =(-59.8±4.22)mV是对照自然失活曲线;Vg1/2 =(-58.8±5.69)mV是 10 PPM甘松挥发油;Vg
1/2=(-68.0±4.36)mV是药物被洗脱后失活曲线(P<0.01, n=6)。在除去自然移动值后
10 PPM甘松挥发油的 Na电位失活作用明显。甘松挥发油应用前 , 应用 10PPM甘松挥发油以及药物洗脱后 H-I曲线与
自然失活曲线比较 ,校正自然失活因素后 10PPM甘松挥发油实际移动 Vg
1/2是(18.0±4.50)mV(P<0.01, n=5), 洗脱 40min后接近对照状态。结论 甘松挥发油对 I-V, G-V曲线有向超极化移位的影响。对快 Na+通道有加速失活与抑制激活的
作用 , 然而电压依赖性 Na失活是可逆性的。这一作用奠定了甘松挥发油抗心律失常的作用机制。
关键词:甘松挥发油;　HEK细胞;　Nav1.5;　膜片钳
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)01-0001-02
TheEffectsoftheVolatileOilofNardostachychinesisBatalonNa+CurrentoftheCardi-
acSodiumChannelsofRatsandNav1.5inHEKCels
GEYu-zhi1, 2 ,WUZhi-ting1 , HULang-ji1 ,JayZYeh2
(1.JiangxiProvincialPeoplesHospital, JiangxiCardiovascularDiseaseResearchInstitute, Nanchang, 330006,
China;2.NorthwesternMedicalUniversity, ChicagoILUSA60611)
Abstract:ObjectiveToinvestigatetheefectsoftraditionalChinesemedicinevolatileoilofNardostachyChinesisBatal(TCM-
VONCB)onthecurvesofcurrent-voltagerelationship(I-V), conductance-voltagerelationship(G-V)andfastNachannel
inactivation(H-I)ofvoltage-dependentinNav1.5channelsinhumanembryonickidney(HEK)cels.MethodsThewhole-
celpatch-clamptechniqueandHEKcelswereemployedtoresearchtheefectsofTCMVONCBonthecurvesofI-V, G-V
andH-Iofvoltage-dependentcurrentinNav1.5 channels.ResultsTCMVONCBreducedthepeakofNacurentintheI-V
curve, butcouldchangeitsNa(ENa)reversalpotentialdirectionfromwithinflowstooutsideG-Vcurvemovetothehyper-
polarization, Vg1/2 =(-59.8±4.22)mVwascontrolcurve;Vg1/2 =(-58.8 ± 5.69)mVwas10 PPMTCMVONCBcurve;Vg1/2 =(-68.0 ±4.36)mVwasforwashoutcurve(P<0.01, n=6).10ppmTCMVONCBhassignificanteffectsonthecur-rentofNav1.5afterremovingthenaturalmovementinthevalue, theVg1/2 after10 pmmTCMVONCBwasVg1/2 =18.04.5 mV(P<0.01, n=5)comparingthecontrol, after40 minofwashout, thevalueofVg1/2removebackandclosetothestateofcon-
trol.ConclusionTCMVONCBhastheefectsofhyper-polarizingshiftonthecurvesofI-VandG-VandNachanneltoac-
celeratefasterdeactivationandinhibitactivation, butvoltage-dependentNainactivationisreversible.Thisroleisbasicanti-
arrhythmicmechanismsfortheTCMVONCB.
Keywords:VolatileoilofNardostachyChinesisBatal;　Nav1.5;　Whole-cel;　 Patch-clampHEKcells
　　实验与临床证明 ,目前被广泛使用的抗心律失常中成药(稳
心颗粒等)中的主要有效成分甘松具有良好的抗心律失常作
用 [ 1～ 3] 。以往一般电生理研究方法发现 , 甘松乙醇或水的提取液
具有拮抗氯化钡诱发大鼠心律失常的作用 ,对氯仿和肾上腺素诱
发的家兔心律失常也有拮抗作用 ,并能延长家兔离体心房的不应
期。然而 , 其确切的细胞电生理 、电药理机制及药物直接作用靶
点尚不清楚 [ 1, 3] 。为今后进一步对甘松有效成分挥发油深入研
究 , 本实验除应用膜片钳技术和大鼠心肌细胞外还应用 HEK细
胞 Nav1.5, 这种细胞是利用大鼠 cDNA密码编程心肌钠通道密
码子序列 , 在人体肾胚胎细胞上表达而产生的一种新型克隆细胞
(humanembryonickidney, HEK)[ 4 ～ 6] 。克隆的 HEK细胞 Nav1.5心肌纯钠通道不但使得膜片钳实验中操作的难度大大降低 ,还使
得实验得出的结果更准确 ,大大促进了该领域的研究工作。本实
验在应用细胞膜片钳技术对 Nav1.5单纯钠通道的研究 ,通过 I-V和 H-I曲线的测定及电压依赖性等实验 ,探索甘松挥发油抗
心律失常作用的靶点及其详细的细胞电生理 、电药理的机制 , 同
时也为今后深入研究奠定基础。
1　材料与方法
1.1　甘松挥发油提取及稀释 参照已报道的方法 [ 7] , 称取阴干
后的甘松样品 ,按《中国药典 》(Ⅰ 部)甲法进行水蒸馏 ,经 6 h后
停止加热 ,静置过夜 , 油水相分离后得浅绿色油状液体。用双向
溶剂二甲基亚砜 ,按比例进行稀释。
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.1 时珍国医国药 2009年第 20卷第 1期
1.2　HEK细胞 Nav1.5 用鼠 cDNA编码组成的纯钠通道在人胚
胎肾细胞(HEK)上表达而致的一种仅有纯钠通道的细胞 , 由美
国西北大学药理分子生物学系 YehJayZ.教授提供。
1.3　全细胞膜片钳记录
1.3.1　膜片钳记录使用的仪器与设备 膜片钳放大器 Axon/USA
(Axopatch200Bmplifier/pClamp9/Digidatapack1322A), 精密微操
纵器 SD/USA(MX7600/RMotorizedManipulator/MC1000eControl-
ler/Amplifierheadstagemount), 荧光倒置显微镜 , 03-D型玻璃微
电极拉制仪, MPS多通道快速微量加药系统 ,入水阻抗为 1 ～ 2MO。
1.3.2　膜片钳记录程序与方法 数控恒温槽在电压钳制模式下 ,
根据钳制电位的不同 ,分别测量 Na+离子通道电流。当阻抗达到
1GO以上 ,补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记录模式 , 调节
慢电容补偿和串联电阻补偿以减少瞬时充放电流和钳制电位误
差。膜片钳放大器与计算机相连 , 信号发放和采集均由软件完成
并存储在硬盘内 , 供测量和分析用。
1.3.3　膜片钳记录溶液与试剂 正常台氏液成分:NaCl140 mM;
KCl5.4mM;CaCl
2
1.8mM;MgCl
2
0.5 mM;HEPES5.0 mM;Dex-
trose5.5 mM;NaH
2
PO
4
0.4 mM;pH用 NaOH调至 7.40。无钙台
氏液(MITRA/MORAD为正常台氏液中不加 CaCl
2
);NaCl135
mM;KCl5.4 mM;MgCl
2
1.0Mm;HEPES10mM;Detrose11 mM;
NaH2PO4 0.33mM;pH用 NaOH调至 7.30。记录外部溶液(Ex-ternalSolution):NaCl25 mM;MgCl2 1.2 mM;HEPES20 mM;D-glucose11 mM;CsCl5mM;CoCl2 1.0 mM;Tetramethylammoniumchloride115mM。记录内部溶液(InternalSolution):CsF145 mM;
NaF5.6mM;HEPES5 mM;用 CsOH1M调 pH至 7.2±0.02。
2　结果
2.1　 正常随时间电压依赖性失活 S曲线向超极化移位 , 从回归
线上表明 , 移动速度 10 min内是 4 mV,这一正常对照自然失活 ,
在计算甘松挥发油时予应以考虑和扣除(图 1)。
图 1　电压依赖性 Na+电位失活与激活曲线具有自然
时间依赖性失活移动
　　顶部小图 a描述了应用一对双脉冲刺激诱发 Na+电流激活
与失活曲线 , 刺激程序为每 150 ms从钳置电位 -140, -80到 0
mV,步长 -10 mV, 取 10 min时间点绘图。图 b.则从钳置电位
-140, -100, 0 mV步长 -10 mV, 取 40 min时间点绘图。图 A:
以钳置电位 -140的函数标化为 1着点绘图 ,这种稳定的快钠失
活以中点和斜率为特点的 “S”曲线。曲线在一个时间常数向超
极化方向移动。 图 B:以中间点时间为函数(实心圈), 从每 10
min4mV作一回归线。 尽管在中点发生移动 , 但斜率围绕 7.0
mve-fold维持不变 , 同样类似变化也发生在电压依赖性激活的
中点(V1/2)见图 B.空心圈。
2.2　 甘松挥发油能降低 Na电流的峰电位 , 但不能改变其 Na
电位(ENa)从内流向外流的反转电位的方向。本文 Na峰电位的
降低是通过电压依赖性对除极反应的导电增加来评价。钠电导
(GNa)是通过 Em除以峰电流获得 , INa则通过 Em-ENa求得。
所得结果按半对数绘表而取得电流 -电压(I-V)关系 , 电导 -
电压关系(G-V)(见图 2)
G-V曲线明显向超极化方面移动 , Vg1 /2=(-59.8±4.22)mV是对照自然失活曲线;Vg1/2 =(-58.8 ±5.69)mV是 10PPM甘松挥发油;Vg1/2 =(-68.0 ±4.36 )mV是药物被洗脱后(P<0.01, n=6)。在图 2C.小插图上显示了在药物被洗脱后 ,
Vg1/2返回到自然移动的预期值 , 因此 , 在除去自然移动值后 , 插
图可见 10PPM甘松挥发油的作用明显(实心方形是 10 PPM, 空
心是对照)。
图 2　甘松挥发油对 I-V, G-V曲线的影响
图 A:为一原始 I-V曲线电流图 , 15 ms除极脉冲从 -100
到 +60mV,步长为 10mV, 钳置电位为 -140mV。图 B:显示电流
-电压(I-V)关系曲线 , 记录 Na电流峰电位(INa)按除极每步功能作点(Em)计算点作 I-V曲线。图 C:10PPM甘松挥发油不
能改变 7 mV对照反转电位(ENa)。按 GNa=INa/(Em-ENa)公
式计算 , 按电压功能电导数据(Em)绘制对数表 ,以获得电导 -
电压(G-V)关系。从 G-V曲线中点电位(Vg1/2)看 , 在 10 min, 20 min, 及 30 min冲洗后 , 电位分别是:-60mV, -56.4 mV,
-67mV。斜率是 5, 8, 5.2 mV/e-fold钠导增加。 图 2 C是对
照自然时间移动所显示 Vg1/2改变。
2.3　 应用甘松挥发油应用前 , 应用 10 PPM甘松挥发油以及药
物洗脱后与自然失活曲线比较(图 3B), 校正自然失活因素后 10
PPM甘松挥发油实际移动 Vg1/2是(18.0 ±4.50)mv(n=5), 洗
脱 40min后能接近对照状态 , 因此甘松挥发油电压依赖性 Na失
活是可逆性的。
图 3　甘松挥发油对快 Na+通道失活的
影响与自然时间依赖性失活对比
图 A:原始快 Na通道失活图(H-I曲线图), 由除极脉冲 -
140 mV到 0mV,步长 10mV。图 B:按方程 Itest/Imax=1/{1 +
exp[ (V-V1/2)/k] }, 参数 V1/2 =-83 mV, k=7为对照资料(空
心圈表示),参数 V1/2 =-110 mV, k=7为 10 ppm甘松挥发油资
料(实心三角形表示), 参数 V1/2=-102 mV, k=7.5为洗脱后 10min(空心方块形表示)。图 C:甘松挥发油对 V1/2改变(实心圈)的
影响与对照自然时间依赖性失活曲线比较(空心圈)。
3　讨 论
影响离子通道的各种药物的药理机制很大程度上是借助于
膜片钳技术进行实验而直接得到结果的 [ 4 ～ 6, 8 ～10] , 心肌细胞存
在多种离子通道 , 要研究单纯某种离子通道的作用和影响 ,就得
借助一些药物或化学的方法去阻断其他的离子通道 ,有时这些方
·2·
时珍国医国药 2009年第 20卷第 1期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.1　
法存在阻断不完全以及阻断剂本身对细胞的正常生理代谢带来
影响 , 其结果准确度尚存争议 [ 4 ～ 6] 。 HEKNav1.5是指用鼠 cD-NA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞上表达而致的一种仅
有钠通道的细胞 , 该种细胞是当前国际上流行使用研究钠通道的
细胞 , 以代替以往通常使用的动物分离心肌细胞 [ 4～ 6] 。 HEK
Nav1.5细胞的使用是膜片钳技术与分子生物学基因重组技术的
结合 , 为准确研究一些抗心律失常药的确切电生理机制和开发新
药提供了新的可靠方法 [ 4 ～ 6] 。 I-V和 H-I曲线试验不同药物
浓度在衡定作用下 , 测定不同电压钳置状态下激活与失活钠通道
的能力。 I-V曲线主要通过药物对离子电流抑制稳定在 50%左
右水平 , 此时逐渐增加电压钳置的数值 , 得出离子电流通道改变
对应值的曲线图 , 检测通道激活的能力 , 即:在曲线图上找出电压
钳置在什么数值水平时通道开放最多。 H-I曲线主要通过对不
同电压钳置状态下 , 离子通道开放的电流百分比来测定离子通道
的失活性 [ 4～ 8] 。
根据以往的资料和本实验证实电压依赖性 Na+电位失活与
激活曲线具有自然时间依赖性失活移动 ,这种稳定的快钠失活以
中点和斜率为特点的 “S”曲线。曲线在一个时间常数向超极化
方向移动。这一特性对测定每种药物对 Na+电位失活与激活曲
线具有十分重要意义 , 然后根据用药前后该数值的变化作出的
曲线 , 来判断药物对曲线移动的影响 , 在除去自然时间依赖性失
活曲线移动的因素影响下比较用药前后该数值的变化作出的曲
线 , 才具有实际意义。曲线左移为离子通道失活加强 , 反之则失
活减弱。试验发现 I-V和 H-I曲线 ,正常自然依赖性失活曲线
向超极化移位 , 移动速度 10 min内是 4 mV。甘松挥发油能降低
I-V曲线 Na电流的峰电位 , 但不能改变其 Na电位(ENa)从内
流向外流的反转电位的方向。 G-V曲线明显向超极化方面移
动。在除去自然移动值后 10 PPM甘松挥发油的作用明显。应
用甘松挥发油应用前 , 后及药物洗脱后 H-I曲线与自然失活曲
线比较 , 校正自然失活因素后 10 PPM甘松挥发油实际移动 Vg1/2
是(18.0±4.50)mV, 洗脱 40 min后接近对照状态。发现对快
Na+通道加速失活与抑制激活的作用 , 这一作用奠定了甘松挥
发油抗心律失常的作用机制。
近来研究发现甘松挥发油具有甘松有效浓缩成分主要含单
体成分:卡拉稀(Calarene占 29.44%)、■1(10)-土青木香烯酮
-2(■1(10)-Aristolenone-2占 16.57%)及甘松醇(Jatamansi-
nol占 8.8%)[ 7] ,约占所有化学成分的 60%。该研究对将来进一
步开发甘松挥发油单件抗心律失常制剂具有实际的意义。
参考文献:
[ 1 ] 　ZhangY, LuY, ZhangL, etal.Terpenoidsfromtherootsandrhizo-
mesofNardostachyschinensis[ J] .JNatProd, 2005 68:1131.
[ 2 ] 　LiN, MaKJ, WuXF, etal.EfectsofChineseherbsonmultipleion
channelsinisolatedventricularmyocytes.ChinMedJ, 2007, 120(12):
1068.
[ 3 ] 　葛郁芝 ,吴志婷 ,叶政助 ,等.甘松挥发油对心肌细胞内向电流的影
响 [ J] .心肺血管论坛 , 2005, 6:41.
[ 4 ] 　Shin, DJ, KimE, ParkSB, etal.AnovelmutationintheSCN5Agene
isassociatedwithBrugadasyndrome[ J] .LifeSciences, 2006, 10,
025.
[ 5 ] 　ChanceyJH, ShockettPE, OReilyJP.Relativeresistancetoslowinac-
tivationofhumancardiacNa+channelhNav1.5isreversedbylysine
orglutaminesubstitutionatV930inD2-S6[ J] .AmJPhysiolCel
Physiol, 2007, 293:C1895.
[ 6 ] 　 McNultyMM., DorothyA.Hanck.State-DependentMibefradil
BlockofNa+Channels[ J] .MolPharmacol, 2004, 66:1652.
[ 7 ] 　韩泳平 ,肖　丹 ,向永臣 , 等.甘松挥发油成分分析 [ J] .中药材杂
志 , 2000, 23(1):34.
[ 8 ] 　ClarksonCW, YehJZ.Evidencefortwocomponentsofsodiumchannel
blockbylidocaineinisolatedcardiacmyocytes[ J] .CirculationRe-
search.1988, 63:869.
[ 9 ] 　FolmerCH, TeneickRE, YehJZ.Sodiumcurrentkineticsincatatrial
myocytes[ J] .Jphysiol1987, 384:169.
[ 10]　BalserJB.Thecardiacsodiumchannel:gatingfunctionandmolecular
pharmacology[ J] .JMolCelCardio, 2001, l33:599.
收稿日期:2007-11-20;　修订日期:2008-01-29
基金项目:国家中医药管理局中医药科学技术研究专项(No.06-07JP);四川省青年基金科技项目(No.07ZQ026-011)
作者简介:焦　涛(1982-),男(满族),辽宁丹东人 ,现为西南民族大学少数民族药物研究所在读硕士研究生 ,主要从事民族药物研究工作.
＊通讯作者简介:刘　圆(1968-),女(汉族),重庆人 ,现任西南民族大学副教授 ,博士学位 ,主要从事少数民族药物的研究和教学工作.
民族药五爪金龙的生药学鉴定
焦　涛 , 刘　圆＊
(西南民族大学少数民族药物研究所 ,四川 成都　610041)
摘要:目的 对多民族常用的植物药五爪金龙进行生药学鉴定 ,为其鉴别及应用提供科学依据。 方法 采用原植物 、性
状 、显微 、薄层鉴别方法。结果 五爪金龙在原植物 、性状 、显微 、薄层色谱等方面具有专属性的特征。结论 通过原植物 、
性状 、显微 、薄层色谱图能够很好地鉴定五爪金龙。
关键词:五爪金龙;　显微鉴别;　薄层鉴别
中图分类号:R282.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)01-0003-02
PharmacognosticIdentificationofEthno-medicineIpomoeacairica(Linn.)Sweetvar.
cairica
JIAOTao, LIUYuan＊
(EthnicPharmaceuticalInstituteofSouthwestUniversityforNationalities, Chengdu610041 , China)
Abstract:ObjectiveToidentifyIpomoeacairica(Linn.)Sweetvar.cairicabyidentificationofpharmacognosy, andtopro-
videthescientificevidenceofidentificationandapplication.MethodsTheoriginalplantidentification, morphologicalandhisto-
logicalidentification, microscopicidentification, thinlayerchromatography(TLC)wereadopted.ResultsItisexclusiveinorigi-
nalplantmorphology, microscopiccharacteristics, thinlayerchromatography(TLC).ConclusionTheplantsofIpomoeacairica
(Linn.)Sweetvar.cairicacanbecompletelyidentifiedbythesemethods.
Keywords:Ipomoeacairica(Linn.)Sweetvar.cairica;　Microscopicidentification;　Thinlayerchromatography(TLC)
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2009VOL.20NO.1 时珍国医国药 2009年第 20卷第 1期