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HEK细胞 Nav1.5电流对甘松挥发油浓度及电压依赖性阻滞＊
葛郁芝 1, 2＊ ,吴志婷1 , 张淑华 1 ,盛国太 1 , YehJayZ2
(1江西省人民医院 /江西省心血管病研究所 ,南昌　330006;2 DepartmentofMolecularPharmacologyandBiologi-
cal, NorthwesternMedicalUniversityChicagoILUSA　60611)
　　摘　要　目的:研究甘松挥发油对人肾胚胎(HEK)细胞 Nav1.5电流的影响。方法:应用细胞膜片钳技术研究甘松挥发油对
鼠 cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞(HEK)表达的 Nav1.5细胞离子通道电流的影响。结果:发现甘松挥发油对 Na电流
的阻滞作用受挥发油浓度影响 ,量 -效反应量呈S曲线型 , 电压钳制影响表现为膜电位越低(电位上移)阻滞作用越强。结论:甘
松挥发油对钠电位有明显阻滞作用 ,其作用随剂量增加而增加 , 随膜电位降低而作用加强。提示临床可用于因心肌缺血导致膜电
位降低而诱发的心律失常。
　　关键词　甘松挥发油;HEK细胞;Nav1.5;膜片钳
　　实验与临床证明 ,目前临床广泛使用的抗心律失常中成药
(稳心颗粒等), 其中主要组成药物甘松具有良好的抗心律失
常作用 [ 1～ 3] 。以往一般电生理研究方法发现 , 甘松乙醇或水的
提取液具有拮抗氯化钡诱发大鼠心律失常的作用 , 对氯仿和肾
上腺素诱发的家兔心律失常也有拮抗作用 , 并能延长家兔离体
心房的不应期。然而 , 其确切的细胞电生理 、电药理机制及药物
直接作用靶点尚不清楚 [ 1] 。
　　以往的研究均是在心肌细胞中所得到的资料 , 由于正常的
心肌细胞存在钠 、钾 、钙等多种离子通道 , 要真正了解单纯的某
种离子通道的作用和影响 ,就得借助一些药物或化学的方法去
阻断其他的离子通道 , 这些方法虽然部分达到研究者的目的 ,
但却存在有时阻断不完全 ,以及阻断剂本身对细胞的正常生理
代谢带来影响 , 使之得到的结果准确程度受到争议 [ 4～ 6] 。近年
来克隆了一种心肌纯钠通道细胞-HEK细胞 Nav1.5, 这种细胞
的产生是用大鼠心肌钠通道 cDNA密码子序列 ,在人体肾胚胎
细胞上表达而产生的一种新型克隆细胞(humanembryonickid-
ney, HEK)[ 4 , 6] 。这种纯钠通道细胞的使用 , 不但使得膜片钳实
验中操作的难度大大降低 ,更使得实验得出的结果更准确。本
文旨在应用不同浓度的甘松挥发油对 HEK细胞 Nav1.5在不同
钳位电压下影响以及与心律失常发生有关的重要特性。
1　材料与方法
1.1　试验药物 　甘松挥发油的提取及稀释参照已报道的方
法 [ 7] ,称取阴干后的甘松样品 ,按药典一部甲法进行水蒸馏 ,经
6小时后停止加热 ,静置过夜 ,待油水相分离后得浅绿色油状液
体。用双向溶剂二甲基亚砜 , 按比例进行稀释。
1.2　细胞　 HEK细胞 Nav1.5是用鼠cDNA编码组成的纯钠通
道在人胚胎肾细胞(HEK)上表达而致的一种仅有纯钠通道的细
胞 , 由美国西北大学药理分子生物学系 YehJayZ.教授提供。
1.3 　仪器　 膜片钳放大器 Axopatch200Bmplifier/pClamp9/
Digidatapack1322A, (美国 Axon公司),精密微操纵器 MX7600/
RMotorizedManipulator/MC1000eControler/Amplifierheadstage
mount(美国 SD公司),荧光倒置显微镜(重庆光电仪器有限公
司), 03-D型玻璃微电极拉制仪(武汉东山新技术应用研究所),
MPS多通道快速微量加药系统(华科大仪博生命科学仪器有限
公司)。
1.4　方法
1.4.1　全细胞膜片钳记录溶液与试剂配制　正常台氏液成分:
NaCl140mM;KCl5.4mM;CaCl2 1.8mM;MgCl2 0.5mM;HEPES
5.0mM;Dextrose5.5mM;NaH2PO4 0.4mM;pH用 NaOH调至 7.
40。无钙台氏液 (MITRA/MORAD为 正常台氏液中 不加
CaCl2);NaCl135mM;KCl5.4mM;MgCl2 1.0Mm;HEPES10mM;
Detrose11mM;NaH2PO4 0.33mM;PH用 NaOH调至 7.30。记录
外部溶液(ExternalSolution):NaCl25mM;MgCl2 1.2mM;HEPES
20mM;D-glucose11mM;CsCl5mM;CoCl2 1.0mM;Tetramethylam-
moniumchloride115mM。记录内部溶液(InternalSolution):CsF
145mM;NaF5.6mM;HEPES5mM;用 1MCsOH调 PH至 7.2±
0.02。
1.4.2　全细胞膜片钳记录程序与方法　数控恒温槽在电压钳
制模式下 ,根据钳制电位的不同 , 分别测量 Na+离子通道电流。
当阻抗达到 1GΨ以上 , 补偿快电容并吸破细胞膜形成全细胞记
录模式 ,调节慢电容补偿和串联电阻补偿以减少瞬时充放电流
和钳制电位误差。膜片钳放大器与计算机相连 , 信号发放和采
集均由软件完成并存储在硬盘内 ,供测量和分析用。
2　结果
30 中药药理与临床 2009;25(3)
＊ 国家自然科学基金资助 (No.30660060)
DOI :10.13412/j.cnki.zyy l.2009.03.020
　　浓度为 3ppm甘松挥发油作用于稳定对照的钠电流之后 ,
钠电流被控制 40%, 应用无药细胞外液冲洗后则可恢复到对照
组的 80%(图 1)。电压钳制在-140mv, 浓度为 10ppm甘松挥发
油对细胞的钠电流产生可逆性阻滞(图 2)。不同浓度甘松挥发
油膜电流有不同的作用效果 ,见量 -效反应曲线(图 3)。随电
压钳制状态不同(-90 ～ -140 mV), NEK细胞 Nav1.5电流频率
依赖性阻滞恢复时间曲线不同 , 从-140mv, -130mv, -120mv钠
内向电流逐步递减性降低 (-140mv降低 60%, -130mv降低
85%, -120mv降低 95%)。而电压为-90mv, -100mv则突然明
显降低 , 显示电压高低对电流频率依赖性阻滞恢复影响明显 ,
钳制电压低时影响更显著(图 4)。
图 1　钠通道电流的原始图
图 2　10ppm甘松挥发油对细胞钠电流的可逆性阻作用滞
a.为对照状态电图幅度。 b.为 10ppm甘松挥发油灌注状态下。 c.为无
药细胞外灌冲洗活动恢复状态。
图 3　A示不同浓度(3、10ppm甘松挥发油)膜电流状态 , B示在钳制电
压-80mv,由 Hil氏方程绘制的甘松挥发油量 -效应曲线。按 EC50值是
4.2ppm, Hil氏系数为 1.96。
3　讨论
　　影响离子通道的各种药物的药理机制很大程度上是借助
于膜片钳技术进行实验而直接得到结果的。心肌细胞存在多
图 4　Nav1.5电流频率依赖性阻滞恢复曲线
种离子通道 , 要研究单纯某种离子通道的作用和影响 , 就得借
助一些药物或化学的方法去阻断其他的离子通道 , 有时这些方
法存在阻断不完全 ,以及阻断剂本身对细胞的正常生理代谢带
来影响 , 其结果准确度尚存争议 [ 4～ 6] 。 HEKNav1.5是指用鼠
cDNA编码组成的纯钠通道在人胚胎肾细胞上表达而致的一种
仅有钠通道的细胞 ,该种细胞是当前国际上流行使用研究钠通
道的细胞 , 以代替以往通常使用的动物分离心肌细胞。HEK
Nav1.5细胞的使用是膜片钳技术与分子生物学基因重组技术
的结合 ,为准确研究一些抗心律失常药的确切电生理机制和开
发新药提供了新的可靠方法 [ 4 ～ 6] 。
　　本文试验发现 ,不同浓度的甘松挥发油在不同的电压钳制
状态下 , 不同浓度的甘松挥发油对 Na电流的阻滞作用受膜电
位影响 ,膜电位越低时(电位上移)阻滞作用越强。而量效反应
研究发现 ,当钳制电压在-80mV, EC50位值时 , 甘松挥发油浓度
为 4.2ppm, Hill氏系数为 1.96。甘松有效成分挥发油对钠电位
有明显阻滞作用 , 不同浓度的甘松挥发油对 HEK细胞 Nav1.5
电流在不同钳位电压下对钠内流阻滞影响不同 , 其作用随剂量
增加而增加 ,随膜电位越低而作用加强 , 提示甘松挥发油对膜电
位越低时的 Na通道具有非常强的阻滞作用。提示临床可用于
因心肌缺血导致膜电位降低而诱发的心律失常。
　　近来研究发现甘松挥发油主要含单体成分:卡拉烯(Calare-
ne占 29.44%)、■1(10)-土青木香烯酮-2(■1(10)-Aristo-
lenone-2占 16.57%)及甘松醇(Jatamansinol占 8.8%)[ 7] , 约占
所有化学成分的 60%,该研究对将来进一步开发甘松挥发油单
件抗心律失常制剂具有实际的意义。
参考文献
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31中药药理与临床 2009;25(3)
BlockadeofcurrentofNav1.5inHEKcelsdependedbythevoltageandconcentrationof
volatileoilofNardostachyChinesisBatal
GeYuzhi1, 2 , WuZhiting1 , ZhangShuhua1 , ShengGuotai1 , JayZYeh2
(1 JiangxiProvincialPeoplesHospital/JiangxiCardiovascularDiseaseResearchInstitute, Nanchang　330006;2 NorthwesternMedicalUni-
versityDepartmentofMolecularPharmacologyandBiological, ChicagoILUSA　 60611 )
　　Objective:ToinvestigatetheefectsofvolatileoilofNardostachychinesisBatal(VONCB)oncurrentofNav1.5 channelsinhuman
embryonickidney(HEK)cels.Methods:VONCBextractedfromchinesemedicineNardostachyChinesisBatalastestingdrug.Nav1.5
channelsfromcDNAonencodingmousewiththecompositionofpuresodiumchannelsexpressioninHEKcels.Thewhole-celpatchclamp
recordingproceduresandmethodswasemployed.Results:TheresultsofthisstudywasfoundthattheefectsofblockofNacurrentdepended
ondiferentconcentrationsofVONCBandtheimpactofthelowermembranepotential(thepotentialshiftup), thestrongerblock.thevolume
-effectresponsewasScurvetype.Conclusion:TheVONCBhaspotentialroleofsignificantblockofsodiumcurrent, andthisroleisin-
creasedwiththedosageincreasedandtheactionstrengtheningwiththemembranepotentiallowing.Theresultssuggestthatthearrhythmiain-
ducedbymyocardialischemiacanbetreatedbyVONCB.
Keywords　 volatileoilofNardostachychinensis;humanembryonickidney(HEK)cels;Nav1.5 sodiumchannels;patch-clamp
夏天无总碱对家兔血液流变性及血小板聚集的影响
孟庆玉 1＊ , 戴　岳 2 ,林　海 1 ,夏玉凤 2
(1湖南医药工业研究所 ,长沙　410014;2中国药科大学中药学院 ,南京　210038)
　　摘　要　目的:探讨夏天无总碱对家兔血液流变性及血小板聚集的影响。方法:测定静脉注射夏天无总碱对家兔血黏度和血
小板聚集的影响。结果:夏天无总碱 0.1, 0.2, 0.4 mg/kg可显著降低家兔全血粘度 、红细胞压积和红细胞聚集指数 , 抑制二磷酸腺
苷(ADP)、花生四烯酸(AA)和胶原诱导的家兔血小板聚集。结论:夏天无总碱具有改善家兔血液流变性 ,抑制血小板聚集的作用。
　　关键词　夏天无总碱;血液流变性;血小板聚集
　　夏天无总碱(totalalkaloidsfromRhizomaCorydalisDecum-
beutis, TARCD)是从罂粟科植物伏生紫堇的干燥块茎中提取的
有效部位 , 研究发现其具有抗实验性脑缺血的作用 [ 1] , 对大鼠
全脑缺血模型 , 可明显降低大鼠脑指数和脑含水量;对大鼠局
灶性脑缺血 , 夏天无总碱可使大鼠脑梗塞灶明显缩小 , 脑梗塞
后动物的神经行为障碍明显减轻 , 血清超氧化物歧化酶活性明
显增强。本课题研究静脉注射 TARCD对正常家兔血液流变性
和血小板聚集的影响 ,以进一步探索其治疗缺血性脑病的作用
机理。
1　材料与方法
1.1　 试验药物　TARCD(夏天无总碱), 含量 82.7%, 由湖南
医药工业研究所提供 ,制成每支 2mg冻干粉针 ,批号 041001;注
射用赖氨匹林 , 安徽省丰原药业有限公司生产 , 批号 040821,每
支 0.9g;两药临用时用生理盐水配成所需浓度。 血塞通注射
液 , 昆明制药集团股份有限公司生产 , 批号 2004122103, 规格 0.
25g:5ml。
1.2　动物　雄性日本大耳白家兔 48只 , 体重 2.3±0.2 kg,中
南大学提供 , 生产许可证号 SCXK(湘)2005-0004。
1.3　 试剂　二磷酸腺苷(ADP), 上海丽珠东风生物技术有限
公司产品 , 批号 040610, 用生理盐水配成 1.0mmol/L的溶液 ,
4℃保存备用;花生四烯酸(AA):FlukaAG产品 , 临用时用 1.
0mol/LNaoH配制成钠盐 , 浓度为 5.0 g/L;胶原(100 μg/ml),
KOKEN公司产品。
1.4　仪器　Poch-100全自动动物血液分析仪(上海旭源医疗
器械公司), LBY-NJ2多功能血液凝聚仪 , (北京普力生公司);
LBY-N6A自清洗旋转式黏度汁(北京爱普生公司)。
1.5　方法
1.5.1 　对家兔血液流变性的影响　48只家兔随机分为对照
组 、夏天无总碱高 、中 、低剂量组 、赖氨匹林 ,血塞通共 6组 , 每组
8只。心脏采血 9 ml,其中 4 ml置于肝素干管中抗凝 , 于 LBY-
N6A自清洗旋转式黏度计测量家兔全血粘度 、血浆粘度 、红细
胞压积;1ml置肝素干管中抗凝 ,采用动物血液分析仪进行血小
板计数(余下 3 ml血用于家兔血小板聚集实验)。 自本次采血
第 2日起开始给药 , 对照组 iv0.9%氯化钠注射液 1.0ml/kg, 夏
天无总碱高中低三个剂量组分别 iv用 0.9%氯化钠注射液配制
成的相同体积不同浓度夏天无总碱 ,给药剂量分别为 0.4, 0.2,
0.1 mg/kg,赖氨匹林组iv45mg/kg, 血塞通组剂量为 40mg/kg,
以上各组均按所述剂量经耳沿静脉注射给药 , 每日一次 , 连续 5
天 ,末次给药后 30 min,再次取血测量家兔全血粘度 ,血浆粘度 、
红细胞压积 ,血常规检测血小板计数。
32 中药药理与临床 2009;25(3)