全 文 ：毛绞股蓝皂甙对体外培养小鼠脑皮层神经元损伤的保护作用
霍海如　王天佑 1　于澍仁　肖培根
(中国协和医科大学、中国医学科学院药用植物研究所 ,北京　 100094)
1997-01-16收稿 , 1997-10-17修回
1北京神经外科研究所 ,北京　 100050
作者简介:霍海如 ,女 , 36岁 ,博士 ,现从事博士后工作 ;
肖培根 ,男 , 64岁 ,教授 ,博士生导师 ,中国工程院院士
中国图书分类号　 R 284. 1; R 971
摘要　目的　研究毛绞股蓝皂甙 ( SGP )对谷氨酸 ( Glu)介导
的神经毒作用及缺糖缺氧损害的保护作用。方法　体外培养
小鼠脑皮层神经元 ,测定孵育液中乳酸脱氢酶 ( LDH)的含
量。 结果　 SGP 2, 10 mg· L- 1可拮抗 Glu介导的神经毒作
用 ,使 LDH漏出减少 ,细胞死亡率降低。结论　 SGP可拮抗
Glu介导的神经毒作用 ,对皮层神经元缺糖缺氧致损伤亦具
有保护作用。
关键词　毛绞股蓝 ;大脑皮层神经元 ;谷氨酸 ;缺血
　 　毛 绞股 蓝皂甙 ( saponins of gyno stemma
pubescens, SGP)是本所化学室首次从毛绞股蓝
[gynostemma pubescens ( g agnep. ) C. Y. Wu ]植物
中提取分离出的活性成分。 研究发现其中皂甙含量
高于绞股蓝〔 1〕。本实验采取体外神经元培养方法 ,以
神经元形态、培养液中乳酸脱氢酶 ( lactate dehydro-
henase, LDH)活性变化为指标 ,观察了 SGP对谷
氨酸 ( g lutama te, Glu)及缺糖缺氧导致的大脑皮层
神经元损伤的保护作用。
1　材料
昆明种孕小鼠 (孕期 15～ 18 d) ,由中国医学科
学院动物研究所提供 ,合格证号: 医动字第 01—
3002号 ; SGP为淡黄色粉末 ,由本所化学室提供 ; L-
多聚赖氨酸 (分子质量大于 30 ku ) , 5-氟 -2′-脱氧尿
嘧啶 ,尿嘧啶 ,犬尿烯酸 ( kynurenic acid, K A) ,
Glu,中国科学院上海生物化学研究所产品 ;甘氨酸
(g lycine, Gly )为北京化工厂产品 ; M EM培养基为
Gibco公司产品 ;荧光染料 Hoechst 33342和磺化丙
啶 ( PI)由北京神经外科研究所馈赠 ;其它试剂均为
市售分析纯。 B5060EK /C02型二氧化碳培养箱 ,德
国产品 ; JJT-IA型超净工作台 ,北京半导体设备一
厂产品 ; Olympus T041型相差倒置显微镜、 Olym-
pus BH2 -RFL型荧光显微镜 ,均为日本产品 ; 24孔
培养板 ,美国 Caster公司产品 ; 7230型分光光度计 ,
上海分析仪器厂产品。
2　方法
2. 1　小鼠大脑皮层神经细胞培养　综合文献〔 2, 3〕方
法进行实验。 妊娠 15～ 18 d的昆明种小鼠 ,常规酒
精和碘酒消毒后 ,分离大脑皮层 ,切成 1 mm3的小
块 ,经 0. 25%胰酶在 37℃消化 10 min,轻轻吹打使
组织分散成单细胞悬液 ,经 200目的金属网过滤。调
整细胞密度为 109细胞· L- 1 ,接种于 24孔培养板
中 (培养板预先用 10 mg· L- 1的多聚赖氨酸浸泡过
夜 )。将细胞置于 37℃ , 0. 05 CO2和 0. 95空气的培
养箱中开放培养。 培养 24～ 72 h时 ,在培养基中加
入 5-氟-2′-脱氧尿嘧啶 ( 10μmo l· L- 1 )和尿嘧啶
( 10μmol· L- 1 )作用 24 h ,以抑制非神经细胞的增
殖。 以后每周换液 2次。
2. 2　 Glu损伤神经细胞的保护作用〔 3, 4〕　在神经细
胞培养的 d 9～ 11,吸去原培养液 ,实验组用无
Mg2+ Earle液冲洗后 ,加入 Glu 500μmo l· L- 1 (内
含 Gly 50μmol· L- 1 ,用无 Mg2+ Earle氏液配制 ,
p H 7. 4)处理 15 min,去除 Glu后 ,加定量的 MEM,
18～ 24 h后测定 LDH。 正常对照组除不用 Glu(用
无 Mg2+ Earle氏液代替 )处理外 ,其余处理同实验
组。KA 500μmol· L- 1 , SGP 2, 10 mg· L- 1分别在
Glu处理前 1 h、处理的同时以及处理后的 10～ 24 h
加入。
2. 3　对缺糖缺氧损伤的保护作用　参考文献〔 5, 6〕方
法制备缺糖缺氧模型。缺糖缺氧组样品在加入无糖
Earle液后 ,放入密闭罐中 (内含 5%的没食子酸 ) ,
充以 0. 95 N2和 0. 05 CO2　 5～ 10 min。对照组及缺
糖缺氧组放入培养箱中继续培养 , 3 h后取出 ,测定
LDH。 SGP 2, 10 mg· L- 1在缺糖缺氧处理前 1 h及
处理过程中均加入。
2. 4　神经细胞损伤程度的评价
2. 4. 1　酶学方法〔 3, 7〕　在测定培养液或孵育液中的
LDH后 ,置培养细胞于- 20℃冰箱中超过 3 h,冻融
后以同法测定总 LDH。细胞损伤程度以培养细胞的
LDH和总 LDH活力的百分比 ( LDH% )表示。
2. 4. 2　形态学方法　 Glu作用 24 h后 ,室温下将
培养细胞的盖玻片用荧光染料 Hoechst 33342(终浓
度 10μmol· L- 1 )和 PI(终浓度 100 mg· L- 1 )进行
染色。 15 min后取出盖玻片 ,在荧光显微镜下计数
·120· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　 1998 Apr; 14( 2): 120～ 2
多于 500个细胞 ,计算 PI染色细胞的百分比 ,即细
胞死亡率 (% )。实验均设重复样品 ,各种条件下均重
复 2～ 3次。
3　结果
3. 1　细胞形态　接种的神经细胞最初呈圆型 , 1～ 2
h后几乎全部细胞贴附于多聚赖氨酸处理过的培养
板壁或小盖玻片上 ,呈分散状。 此后 ,细胞伸出细丝
状带有分枝的突起 , 5～ 6 d后即形成网络状结构。
相差显微镜下观察 ,胞体呈强烈折光 ,核不可见。观
察结果与文献报道〔8〕一致。
3. 2　对 Glu介导的神经毒性的保护作用　小鼠大
脑皮层神经细胞暴露于 Glu 500μmo l· L- 1后 ,细胞
的死亡率明显升高 ,培养液中 LDH漏出明显增多。
SGP 2, 10 mg· L- 1对 Glu介导的神经毒性有保护
作用 ,但作用弱于 KA(表 1)。
表 1　SGP对 Glu介导的神经毒性的影响 ( x-± s )
　组　　别 例数 LDH /% 细胞死亡率 /%
对照组 10 　 33. 8± 7. 1 　 24. 4± 6. 9
Glu 10 64. 1± 13. 8* * 50. 3± 7. 0*
KA( 500μm ol· L- 1) 8 46. 6± 13. 4# 33. 6± 5. 4#
SGP( 2 mg· L- 1 ) 8 51. 8± 3. 9# 40. 0± 7. 5
　　 ( 10 mg· L- 1 ) 8 49. 7± 7. 7# 37. 6± 7. 0# #
　　与对照组比较 ,* P < 0. 05, * * P < 0. 01;与 Glu组比较 , # P <
0. 05,# # P < 0. 01
3. 3　对神经细胞缺糖缺氧的保护作用　缺糖缺氧
3 h后可造成小鼠大脑皮层细胞损伤 , LDH漏出增
多。 SGP 2 mg· L- 1对神经细胞的缺糖缺氧损害具
有直接保护。 结果见表 2。
表 2　SGP对缺糖缺氧损伤神经细胞 LDH漏出的影响 (x-± s ,n= 8)
组别 剂量 /mg· L- 1 LDH/%
对照组 24. 2± 4. 3　
缺糖缺氧组 49. 5± 10. 5* *
SGP 2 35. 9± 3. 7# #
10 41. 7± 5. 0　
　　与对照组比较 ,* * P < 0. 01;与缺糖缺氧组比较 , # # P < 0. 01
4　讨论
离体培养神经细胞可按实验设计要求控制神经
元生长条件与环境 ,直接观察细胞形态和生化改变 ,
更清楚地了解药物或化学物质对神经元的损害或保
护作用 ,并可避免在体研究诸多复杂因素的影响 ,故
离体神经细胞培养的方法已成为神经学科研究的有
力手段。
体外培养的细胞不依赖血液供应 ,不会造成真
正的缺血 ,本研究参照文献采取同时缺氧和缺糖的
方法模拟缺血。膜通透性变化是细胞损害的共同特
性。 LDH是无氧酵解过程中的一个关键酶 ,广泛存
在于各组织细胞的胞浆中。 LDH的化学和生物性质
十分稳定 ,通常情况下 ,神经细胞的漏出很少 ,而受
损伤的神经元漏出的 LDH则明显增加〔9〕 ,故检测
LDH的漏出量可反应细胞受损伤的程度。
Glu是中枢神经系统中含量最高的一种重要的
兴奋性氨基酸 ,在维持神经元正常信号传递过程中
起重要作用。 Glu大量释放后 ,激活 Glu受体 ,进而
导致一系列病理变化 ,最终导致神经细胞肿胀 ,代谢
紊乱而死亡。慢性神经元退行性疾病 (如 Alzheimer
病 )及脑缺血时的病理变化均与 Glu的神经毒作用
有关〔10, 11〕。广谱兴奋性氨基酸受体拮抗剂 KA500
μmol· L- 1可明显拮抗 Glu的神经毒作用。 SGP保
护 Glu介导的神经毒作用 ,并且对神经细胞的缺糖
缺氧损害亦具直接保护作用 ,提示本品对神经细胞
的保护作用是多方面的。 已研究证明 , SGP具有抗
衰老作用 (结果待发表 ) ,为 SGP用于老年性脑缺血
疾病提供了药理学依据。
　　 (本所化学室陈迪华教授 ,常琪、吕瑞绵副教授
提供毛绞股蓝皂甙 ,特此致谢! )
参考文献
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·121·中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　 1998 Apr; 14( 2)
强效 GnRH激动剂那法瑞林对兔
异位子宫内膜的抑制作用
李　娟　周美华 1　高允生　褚云鸿 1
(泰山医学院药理学教研室 ,泰安　 271000)
中国图书分类号　 R 711. 71; R 977. 1; R 984
摘要　目的　研究强效促性腺激素释放激素 ( g onadot ropin-
releasing ho rmone, GnRH)激动剂那法瑞林 ( nafarelin,
Naf)对兔异位子宫内膜的抑制作用。方法　以手术方法制备
兔异位子宫内膜模型后 ,将动物分为对照组、 Na f( 1, 3, 10μg
· kg- 1· d- 1各 1组 , sc )治疗组 ,丹那唑 ( dana zo l, Dan, 80
mg· kg- 1· d- 1 , ig )治疗组以及手术切除双侧卵巢组 ( bilat-
eral ov a riectomy , OVX )。 结果　 6 w k后发现 ,经 Naf治疗
的动物其异位内膜的体积明显减小 ,其中 3和 10μg· kg- 1
· d- 1剂量组的疗效与 OVX组相似。Dan尽管也能引起异位
内膜萎缩 ,但其疗效较 Na f 10μg· kg- 1· d- 1和 OVX有显
著差别。另外 , N af治疗组动物的血清雌二醇 ( estr adiol, E2 )
水平也明显下降。结论　 Naf可明显抑制兔异位子宫内膜的
生长 ,该作用与兔血清内 E2水平下降有关。
关键词　那法瑞林 ;丹那唑 ;子宫内膜异位症 ;雌二醇
　　子宫内膜异位症是指子宫内膜在子宫腔以外的
位置出现并生长 ,已知雌激素为异位内膜的生长所
1996-12-06收稿 , 1997-04-28修回
1上海医科大学基础医学院药理学教研室 ,上海　 200032
作者简介:李　娟 ,女 , 29岁 ,药理学硕士 ;
周美华 ,女 , 53岁 ,教授 ,博士生导师 ,从事生殖药理学
研究
必需〔 1〕。因此对该病的药物治疗其目的主要是抑制
下丘脑 -垂体-卵巢轴 ,减少卵巢激素的分泌或对抗
雌激素的作用 ,使异位生长的内膜组织萎缩乃至消
失。在这些药物中 , GnRH激动剂是最有前途的一类
药物 , Naf即为其中之一。 该药是由 D-萘基丙氨酸
取代了天然 GnRH第 6位上的甘氨酸得到的 ,其活
力约为天然 GnRH的 200倍〔2〕。 国外临床资料〔3, 4〕
表明 ,与治疗子宫内膜异位症的传统药物 Dan相
比 , Naf (长期大剂量应用 )具有强效、低毒、易为病
人接受的优点 ;其作用主要通过抑制下丘脑 -垂体-
卵巢轴 ,造成体内的低雌激素状态 ,引起异位内膜萎
缩。 但该药对卵巢是否有直接作用尚不清楚。
本研究采用兔异位子宫内膜模型 ,观察了不同
剂量的 Naf对异位内膜组织的抑制作用以及对血
清 E2水平的影响 ,并与 Dan进行了比较 ,以便更好
地指导临床用药。
1　材料
1. 1　动物　未孕健康♀新西兰大白兔 ( 3. 5 kg±
0. 5 kg ) ,由上海医科大学实验动物部提供。
1. 2　主要试剂　 Naf (粉剂 ,上海丽珠东风生物技
术公司 ) ; Dan(粉剂 ,上海第九制药厂 ,应用前用 1%
Protective effect of saponins of gynostemma pubescens on
neuronal injury in cultured cortical neurons of mice
HUO Hai-Ru, W ANG Tian-You
1 , YU Shu-Ren, XIAO Pei-Gen
( Insti tute of Medicinal Plant Development , Peking Union Medical College
and Chinese Academy of Medical Sciences , Bei jing　 100094)
ABSTRACT　 AIM　 To investig ate pro tective ef-
fect o f SGP, the to tal saponin isolated f rom
saponins of gynostemma pubescens ( gagnep) C. Y.
Wu. , on neuronal injury induced by g lutama te
( Glu) and ischemic damage. METHODS　 Co rtical
neurons of mice w ere cultured in v ivo with measur-
ing lactate dehydrogenase ( LDH) relea sed to the
ex t ra-cellula r ba thing media and numbering the
dead neurons. RESULTS　 SGP 2 and 10 mg· L- 1
migh t low er LDH content in ex t ra-cellular bathing
media and reduce the number of cell death. CON-
CLUSION　 SGP may provide par tical pro tection a-
gainst Glu-induced neuro to xici ty and pro tect neu-
rons f rom ischemia.
KEY WORDS　 gynostemma pubescens; neuronal
culture; g lutamate; ischemia
1Bei jing Neu rosurgical Ins ti tu te, Bei jing　 100050
·122· 中国药理学通报　Chinese Pharmacological Bulletin　 1998 Apr; 14( 2): 122～ 4