全 文 ：· 1386 · 中华中医药杂志(原中国医药学报)2016年4月第31卷第4期 CJTCMP , April 2016, Vol . 31, No. 4
·研究报告·
蜘蛛香环烯醚萜类成分ethoxyviburtinal-11对大鼠
结肠纵行肌细胞收缩效应的影响
张婷1,2，胡京红1，王晶1，闫兴丽1，王娟1，罗武政1，施金钹1，陶丝雨1
（1北京中医药大学，北京 100029；2北京市延庆县食品药品安全监控中心，北京 102100）
摘要：目的：研究蜘蛛香环烯醚萜类成分ethoxyviburtinal-11对大鼠结肠纵行肌细胞的直接作用及初步机制探
讨。方法：原代培养大鼠结肠纵行肌细胞，观察不同时间、不同浓度的ethoxyviburtinal-11对大鼠结肠纵行肌细胞
的作用及ethoxyviburtinal-11对工具药5-羟色胺（5-HT）、乙酰胆碱（Ach）和去甲肾上腺素（NE）引起结肠纵行
肌细胞收缩效应的影响。结果：当浓度为4.04mmol/L，作用30s时，ethoxyviburtinal-11对结肠纵行肌细胞具有最强
的舒张效应。ethoxyviburtinal-11对5-HT引起的结肠纵行肌细胞收缩效应有显著抑制作用，而对Ach、NE的效应无
显著性影响。结论：ethoxyviburtinal-11对结肠纵行肌细胞具有直接的舒张作用，其舒张作用可能与5-HT有关。
关键词：蜘蛛香；ethoxyviburtinal-11；大鼠结肠纵行肌细胞；细胞长度变化百分率；肠易激综合征
基金资助：国家自然科学基金项目（No.81073132，No.81374044），北京中医药大学自主课题（No.2011YJB22X5029）
Effects of ethoxyviburtinal-11 on the contractile response of rat’s colon longitudinal
muscle cells and its mechanism
ZHANG Ting1,2, HU Jing-hong1, WANG Jing1, YAN Xing-li1, WANG Juan1,
LUO Wu-zheng1, SHI Jin-bo1, TAO Si-yu1
( 1Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China; 2Food and Drug Administration of
Beijing Yanqing District, Beijing 102100, China )
Abstract: Objective: To observe the effects of ethoxyviburtinal-11, a constituent of valeriana jatamansi jones, on rats’
colon longitudinal muscle cells and its mechanism. Methods: The primary cultured rat colon longitudinal muscle cells were
administrated by ethoxyviburtinal-11 at different time and concentration. The shrinkage effect induced by tool medicines including
serotonin (5-HT), acetylcholine (Ach) and norepinephrine (NE) was observed after the administration of ethoxyviburtinal-11.
Results: Ethoxyviburtinal-11 had a strongest relaxed effect on primary cultured rat colon longitudinal muscle cells when the
concentration was 4.04mmol/L and the time was 30s. Ethoxyviburtinal-11 could signifi cantly inhibit the shrinkage effect induced
by 5-HT but Ach and NE. Conclusion: The ethoxyviburtinal-11 could directly make the rats’ colon longitudinal muscle cells relax,
which may be related to 5-HT.
Key words: Valeriana jatamansi Jones; Ethoxyviburtinal-11; Rats’ colon longitudinal muscle cells; Percentage of
change of the cell length; Irritable bowel syndrome
Funding: National Natural Science Foundation of China (No.81073132, No.81374044), Independent Selected Subjects
Program of Beijing University of Chinese Medicine (No.2011YJB22X5029)
通讯作者：闫兴丽，北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学科技处，邮编：100029，电话：010-64286498
E-mail：xingliyan3@126.com
蜘蛛香为败酱科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的
干燥根及根茎。始载于《本草纲目》，2010版《中华人民共和国
药典》（一部）收载[1]。具有理气止痛、消食止泻、祛风除湿、镇
静安神的功效。用于治疗脘腹胀痛、食积不化、腹泻痢疾、风
湿痹痛、腰膝酸软、失眠等症状。课题组前期研究发现蜘蛛香
原粉[2]及环烯醚萜类有效部位[3]对慢性应激所致肠易激综合征
（irritable bowel syndrome，IBS）模型大鼠的胃肠功能亢进具有
改善作用，均可明显减少IBS模型大鼠的排便粒数，具有止泻
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作用。ethoxyviburtinal-11为蜘蛛香中环烯醚萜类降解后的主要
成分，研究表明[4]：ethoxyviburtinal-11对应激兼腹泻模型小鼠
和单纯的腹泻模型小鼠均具有止泻作用，且前者治疗作用优于
后者，可明显改善利血平致小鼠腹泻及精神状态异常的作用，
提示其可能是改善腹泻型IBS的有效物质基础。为进一步探讨
ethoxyviburtinal-11止泻、改善胃肠功能的药效学作用及机制，本
实验在成功建立大鼠结肠纵行肌细胞培养方法的基础上[5-6]，
通过观察ethoxyviburtinal-11对大鼠结肠纵行肌细胞直接作用
及对工具药5-羟色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、乙酰胆碱
（acetylcholine，Ach）和去甲肾上腺素（noradrenaline，NE）作用
结肠纵行肌细胞效应的影响，初步探讨其改善胃肠运动的作用
及机制。
材料
1. 动物 健康SPF级成年Wistar大鼠，雄性，体质量100-
150g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号
SCXK（京）2006-0009。
2. 主要药品与试剂 5-HT，Sigma，批号：H9523；Ach，
Sigma，批号：101103427；NE，Sigma，批号：101156277，高糖
DMEM干粉，Gibco，批号：748854；胎牛血清，Gibco，批号：
91110003；HEPES，AMRESCO，批号：0511-100g；胶原酶Ⅱ，
Worthington，批号：E11903；胰蛋白酶抑制剂，Sigma，批号：
T9003。
3. 仪器 奥林巴斯BX40系统显微镜（奥林巴斯），Thermo
3111型CO2培养箱（Thermo），LDZX-40SBI型不锈钢立体灭菌器
自动型（上海申安医疗器械厂），Eppendorf离心机5810R（倍肯
集团Eppendorf），NTS-Elements BR 3.60。
方法
1. 大鼠结肠纵行肌细胞的分离培养 按照前期建立的细
胞培养方法，取120-150g Wistar雄性大鼠2只，禁食不禁水48h，
断脊椎处死，自肛门上3cm处取结肠10cm，放入Hepes-Ringer缓
冲液中反复灌肠冲洗结肠内部残余粪便 。在显微镜下沿肠系
膜对侧纵行切开肠段，翻转至外侧，刮去黏膜外层，揭下外纵
结肠平滑肌层。D-hanks缓冲液清洗2次，将组织层剪至1-2mm3
体积后，加10mL含0.1%Ⅱ胶原酶和0.01%大豆胰蛋白酶抑制剂
的消化液，37℃恒温水浴震荡20min，1 000r/min离心5min，共
消化2次，弃消化液。加入5mL全培养液，吹打均匀。过100目细
胞筛网，按1×105个/mL浓度接种入25mL培养瓶中培养，培养箱
条件为95%O2，5%CO2，37℃[5-7]。
2. 大鼠结肠纵行肌细胞存活率鉴定 取90μL细胞悬液，
加入0.04%的台盼蓝10μL，混匀，5min后用细胞计数板进行计
数及存活率鉴定，活细胞数应>90%。
3. ethoxyviburtinal-11对大鼠结肠纵行肌细胞的直接作
用 取5块24孔细胞培养板，接种浓度为5×104个/mL的结肠纵
行肌细胞，培养72h后，每块板均加入50μL浓度为40.4、4.04、
4.04×10-1、4.04×10-2、4.04×10-3mmol/L的ethoxyviburtinal-11
和相同体积的D-hanks缓冲液，分别作用15、30、60、120、240s
后，加入200μL 2.5%的戊二醛终止反应。每组随机选取50个细
胞，用NTS-ElementsBR 3.60软件测定结肠纵行肌细胞长度，计
算细胞长度变化百分率，以细胞长度变化百分率进行统计学处
理。细胞长度变化百分率（%）=（实验组细胞长度-对照组细胞
平均长度）/对照组细胞平均长度×100%。正值为舒张，负值为
收缩。
4. 5-HT对大鼠结肠纵行肌细胞的直接作用 取1块24孔细
胞培养板，以5×104个/mL浓度接种细胞，培养72h后，分别加入
5-HT：1.88、1.88×10-1、1.88×10-2、1.88×10-3、1.88×10-4mmol/L及
相同体积的D-hanks缓冲液。作用30s后加入200μL，2.5%戊二
醛终止反应。每组随机选取50个细胞，用NTS-ElementsBR 3.60
软件测定结肠纵行肌细胞长度，计算细胞长度变化百分率，以
细胞长度变化百分率进行统计学处理。注：Ach和NE浓度参照
前期实验结果[6]。
5. ethoxyviburtinal-11对工具药作用后大鼠结肠纵行肌细
胞效应的影响 取3块24孔细胞培养板，接种浓度为5×104个/
mL的结肠纵行肌细胞，培养72h后，每块板分为3组：对照组、
工具药组、ethoxyviburtinal-11+工具药组。对照组：加D-hanks
缓冲液50μL，30s后，加200μL 2.5%戊二醛终止反应。工具药
组：加入相应浓度的工具药（浓度为1.88×10-2mmol/L的 5-HT、
4.86×10-2mmol/L的NE、5.5×10-1μmol/L的Ach），作用30s后，
加入200μL 2.5%戊二醛终止反应。ethoxyviburtinal-11+工具
药组：加入50μL相应浓度的工具药作用10s后，加入50μL
4.04mmol/L ethoxyviburtinal-11，作用30s，加入400μL 2.5%戊
二醛终止反应。每组随机选取50个细胞，用NTS-ElementsBR
3.60软件测定结肠纵行肌细胞长度，计算细胞长度变化百分
率，以细胞长度变化百分率进行统计学处理。
6. 统计学方法 数据以x-±s表示，采用SPSS 17.0统计软件
进行分析，用ONE-WAY ANOVA进行组间比较，以P<0.05为差异
有统计学意义。
结果
1. 结肠纵行肌细胞的一般形态观察 倒置显微镜下观察，
大鼠结肠纵行肌细胞为椭圆形或长梭形，长度各异，免疫组化
染色显示胞浆呈棕色及浅棕色，核呈浅蓝色。培养36h后细胞
已贴壁，呈长梭形，细胞核位于中央，为卵圆形，2-5d细胞开
始增殖，细胞呈长梭形，少数为多角形，7-10d细胞长至致密单
层。结肠纵行肌细胞台盼蓝染色计数，91.4%细胞不着色，培养
的细胞成活率符合要求。
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2. ethoxyviburtinal-11对大鼠结肠纵行肌细胞的直接作
用 见图1。由随机区组设计的方差分析结果可知，时间影响因
子有统计学差异（P<0.05），当时间为30s时，细胞舒张效应最
强。浓度影响因子有统计学差异（P<0.05），与对照组比较，不
同浓度的ethoxyviburtinal-11均可引起结肠纵行肌细胞显著舒
张，且存在一定的量效关系，当浓度为4.04mmol/L时，细胞舒张
效应最强。故选择ethoxyviburtinal-11浓度4.04mmol/L，作用时
间30s，为进一步实验研究的条件。
图1 ethoxyviburtinal-11对结肠纵行肌细胞的直接作用
4.04×10-3 4.04×10-2 4.04×10-1 4.04 40.4
3. 5-HT对大鼠结肠纵行肌细胞的直接作用 见表1。与
对照组比较，不同浓度的5-HT作用于大鼠结肠纵行肌细胞，均
可引起细胞显著收缩，且呈一定的量效关系，当5-HT浓度为
1.88×10-2mmol/L时，细胞收缩作用最强。
表1 5-HT对大鼠结肠纵行肌细胞的直接作用（x-±s，n=50）
组别 浓度（mmol/L） 细胞长度变化百分率（%）
对照组 - -0.28±5.25
5-HT组 1.88 -15.44±7.61**
1.88×10-1 -12.60±6.15**
1.88×10-2 -16.71±6.63**
1.88×10-3 -7.78±6.65**
1.88×10-4 -4.68±6.68**
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。
4. ethoxyviburtinal-11对工具药作用大鼠结肠纵行肌细胞效
应的影响
4.1 ethoxyviburtinal-11对5-HT作用后大鼠结肠纵行肌细胞
效应的影响 见表2。与对照组比较，5-HT引起结肠纵形肌细
胞显著收缩，而加入ethoxyviburtinal-11后能显著抑制5-HT对细
胞的收缩作用。提示ethoxyviburtinal-11的直接舒张细胞作用可
能与5-HT有关。
4.2 ethoxyviburtinal-11对Ach作用大鼠结肠纵行肌细胞效
应的影响 前期研究发现[6]，当Ach浓度为5.5×10-1μmol/L时
对细胞具有最强的收缩作用，故本实验Ach浓度选择5.5×10-1
μmol/L。与对照组比较，Ach可引起结肠纵行肌细胞显著收
缩，但加入ethoxyviburtinal-11后对收缩效应无显著影响，故
提示ethoxyviburtinal-11的直接舒张细胞效应与M受体无关。
见表3。
表3 ethoxyviburtinal-11对Ach作用大鼠结肠纵行肌细胞
效应的影响（x-±s，n=50）
组别 剂量（mmol/L）
细胞长度变化
百分率（%）
对照组 - -0.00±6.05
Ach组 5.5×10-4 -11.06±3.97**
ethoxyviburtinal-11+Ach组 4.04 -11.27±4.55**
注：与对照组比较，**P<0.01。
4.3 ethoxyviburtinal-11对NE作用大鼠结肠纵行肌细胞效应
的影响 前期研究发现[6]，当NE浓度为4.86×10-2mmol/L时对
大鼠结肠纵行肌细胞具有最强的舒张作用，故本实验NE浓度
选择4.86×10-2mmol/L。与对照组比较，NE可引起结肠纵行肌
细胞显著舒张，但加入ethoxyviburtinal-11后对其舒张效应无显
著影响，故提示ethoxyviburtinal-11的直接舒张细胞效应与β受
体无关。见表4。
表4 ethoxyviburtinal-11对NE作用大鼠结肠纵行肌细胞效应的
影响（x-±s，n=50）
组别 剂量（mmol/L）
细胞长度变化
百分率（%）
对照组 - -0.00±4.46
NE组 4.86×10-2 23.66±6.63**
ethoxyviburtinal-11+NE组 4.04 22.28±5.93**
注：与对照组比较，**P<0.01。
讨论
肠道的运动来源于肠壁平滑肌细胞的收缩。一般认为，神
经递质、激素或药物与胃肠平滑肌特异受体结合后，可引起平
滑肌细胞的收缩或舒张，而M受体、β受体、5-HT在胃肠平滑
肌运动中研究较多[8-12]。体外分离的细胞可排除扩散屏障，如
神经递质、胃肠激素、药物在组织间扩散速率，兴奋和抑制之
间的相互作用等因素所带来的影响，可以从机制层面深入了解
药物的作用靶点。近年来，很多学者运用离体结肠平滑肌细胞
考察了不同药物对细胞舒缩、Ca2+转运、K+转运、细胞电位变化
等的作用[13-17]。
本研究在前期建立细胞模型，观察到了M受体激动剂
Ach、β受体激动剂NE对结肠纵行肌细胞的收缩及舒张作
表2 ethoxyviburtinal-11对5-HT作用大鼠结肠纵行肌细胞
效应的影响（x-±s，n=50）
组别 剂量（mmol/L）
细胞长度变化
百分率（%）
对照组 - 0.00±5.45
5-HT组 1.88×10-2 -14.13±4.56**
ethoxyviburtinal-11+5-HT组 4.04 -5.23±5.76**△△
注：与对照组比较，**P<0.01，与5-HT组比较，△△P<0.01。
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用，确定最强浓度基础上[6]，观察不同浓度、不同作用时间
ethoxyviburtinal-11对结肠纵行肌细胞的收缩效应。初步探讨
ethoxyviburtinal-11对Ach、5-HT和NE所诱导的细胞收缩或舒张
模型协同或拮抗作用的影响，判断其作用机制与M受体、5-HT
和β受体的关系。
研究结果表明，ethoxyviburtinal-11可使单个结肠纵行肌细
胞舒张，在4.04×10-3-40.4mmol/L的浓度范围内，呈一定的量
效关系，最大效应浓度为4.04mmol/L，作用时间为30s。并且，
ethoxyviburtinal-11对5-HT引起的结肠纵行肌细胞收缩效应有
显著抑制作用，而对Ach、NE的效应无显著性影响。前期在整
体动物实验中，发现蜘蛛香环烯醚萜类通过降低结肠、血清中
5-HT含量，下调结肠5-HTR3A受体表达水平改善IBS胃肠道症
状。ethoxyviburtinal-11为蜘蛛香环烯醚萜类成分，具有抑制小
鼠胃肠运动亢进的作用[18-19]。ethoxyviburtinal-11对结肠纵行肌
细胞具有舒张作用，与前期实验结果相吻合，其作用机制可能
与通过抑制细胞上5-HT受体活性，引起细胞舒张有关，而与M
受体、β受体可能无关，确切的机制有待进一步研究。
参 考 文 献
[1] 国家药典委员会.中国人民共和国药典(一部).北京:中国医药
科技出版社,2010:346
[2 ] 樊江波.蜘蛛香治疗肠易激综合征的作用和机制研究.北京:
北京中医药大学,2008
[3] 闫兴丽.蜘蛛香环烯醚萜类对肠易激综合征的治疗作用及机
理研究.北京:北京中医药大学,2009
[4] 王娟,张婷,胡京红,等.蜘蛛香环烯醚萜类成分ZXX止泻作用
实验研究.辽宁中医药大学学报,2014,16(11):30-32
[5] 张婷,胡京红,闫兴丽.大鼠结肠纵行肌细胞分离及培养方
法的改进.武汉:2012年第五届临床中药学学术研讨会,
2012:179-186
[6] 张婷,胡京红,王晶,等.一种新型大鼠结肠纵行肌细胞分离培
养方法的建立.中国药理学通报,2013,29(5):412-417
[7] Stephen M,Jerry D.Cholecystokinin-induced contraction of
dispersed smooth muscle cells.Am J Physiol,1982,243(6):497-504
[8] Hiroki Morita,Erito Mochiki,Nobuyuki Takahashi,et al.Effects of
5-HT2B,5-HT3 and 5-HT4 receptor antagonists on gastrointestinal
motor activity in dogs.World J Gastroenterol,2013,19(39):6604-6612
[9] 王迎寒.基于5-羟色胺信号系统的戊己丸不同配伍方改善结
肠运动的机制研究.北京:中国中医科学院,2013
[10] 旺建伟,叶虹玉,赵文静,等.痛泻要方对IBS内脏高敏性大鼠
结肠组织5-HT4受体mRNA与c-fos mRNA表达的影响.中华中
医药杂志,2014,29(4):1070-1075
[11] 李琼,刘同慎,刘孟安.胃肠舒对胃肠功能障碍大鼠胃肠道
AchE及NO的影响.中华中医药杂志,2010,25(5):1307-1310
[12] 周应初,周鹤俊,刘斌.5-HT在肠易激综合征发病机制中的研
究现状.胃肠病学,2011,16(7):445-448
[13] 司春峰,魏睦新,轩原清史.氢溴酸槟榔碱对大鼠离体结肠平
滑肌细胞作用的研究.上海中医药杂志,2004,38(3):48-50
[14] 李凌霞,李季委,王兴焱,等.薯蓣皂苷对大鼠结肠平滑肌细胞
内钙浓度的影响.中医药学报,2013,41(4):62-63
[15] 徐新寓,王云,杨微微,等.高糖对大鼠结肠平滑肌细胞表
达内源性胰岛素样生长因子的影响.世界华人消化杂志,
2012,20(12):998-1003
[16] 吕颐.结肠平滑肌细胞培养方法的建立及东北鹤虱松弛肠平
滑肌作用初探.天津:天津医科大学,2006
[17] Boyer J C,Magous R,Christen M O,et al.Contraction of human
colonic circular smoothmuscle cells is inhibited by the
calcium channel blocker pinaverium bromide.Cell Calcium,
2001,29(6):429-438
[18] 闫兴丽,洪纓,石晋丽,等.蜘蛛香环烯醚萜对肠易激综合征
模型大鼠5-HT和5-HIAA的影响.中国中药杂志,2011,13(9):
176-182
[19] 闫兴丽,洪缨,石晋丽,等.蜘蛛香环烯醚萜对肠易激综合征模
型大鼠胃肠敏感性和胃肠激素的影响.北京中医药大学学报,
2009,32(8):546-549
（收稿日期：2015年2月5日）