全 文 ：湖 北 农 业 科 学 2016 年
收稿日期：2016-02-29
基金项目：国家自然科学基金项目（31460467）
作者简介：田 芳（1988－），女，河南商丘人，在读硕士研究生，研究方向为植物病害防治，（电话）13677565434（电子信箱）1372059240@qq.com；
通信作者，赵思峰（1975-），男，四川巴中人，教授，博士，主要从事植物病害生物防治研究，（电话）13579455957（电子信箱）
Zhsf_agr@shzu.edu.cn。
第 55卷第 8 期
2016年 4月
湖北农业科学
Hubei Agricultural Sciences
Vol． 55 No.7
Apr.，2016
2
1
1
Jan
1期
1月
Vol． 5 No.2
Nov.
列当（Orobanche coerulescens Steph.）是一类无
叶绿素并以全寄生方式寄生于其他植物根部获取
所需养分的植物，其可寄生在茄科、豆科、菊科、伞
形科、葫芦科等多种重要经济作物上，造成寄主植
物减产 5％～100％，已在亚洲、欧洲、非洲、南美洲和
北美洲的较多国家和地区发生，每年给农业生产造
番茄独脚金内酯合成关键基因 CCD7、CCD8 RNA
沉默载体的构建
田 芳，姚兆群，陈美秀，徐 瑛，赵思峰
（新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用自治区高校重点实验室 ／石河子大学农学院，新疆 石河子 832003）
摘要：根据已知的番茄（Lycopersicon esculentum Mill．）CCD7 和 CCD8 基因的序列设计特异性引物，采用
RT－PCR克隆 CCD7和 CCD8基因片段，通过特定酶切将 2 个基因进行拼接，再将串联基因以反向重复的
方式连入 pUCCRNAi 载体，并定向插入到 p35 植物表达载体上。 结果表明，克隆获得了大小约为 400 bp
的 CCD7 和 CCD8 基因片段，基因片段拼接后获得 800 bp 左右的串联片段 CCD7－8；将该基因片段插入
pUCCRNAi 载体后得到 1 700 bp 大小的含 Intron 的反向重复序列 In－7－8， 并成功插入到植物表达载体
p35 中，通过酶切分析，RNAi 载体构建正确。 最终成功构建了番茄 CCD7 和 CCD8 2 个串联基因的 RNA
沉默表达载体 p35－In－7－8。
关键词：番茄（Lycopersicon esculentum Mill．）；独脚金内酯；列当；类胡萝卜素裂解双加氧酶 7（CCD7）和 8
（CCD8）；RNA 沉默载体
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2016）21－5668－04
DOI：10．14088 ／ j．cnki．issn0439－8114．2016．21．058
Construction of Strigolactones Key Genes CCD7、CCD8 of
Tomato RNA Silencing Expression Vector
TIAN Fang， YAO Zhao－qun， CHEN Mei－xiu， XU Ying， ZHAO Si－feng
（Key Laboratory of Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region for Oasis Agricul－tural Pest Management and Plant Protection Resource
Utilization ／ College of Agriculture， Shihezi Uni－versity， Shihezi 832003， Xinjiang， China）
Abstract： In order to construct tomato （Lycopersicon esculentum Mill．） carotenoid cleavage dioxygense 7 （CCD7） and 8
（CCD8） RNA silencing expression vector， the specific primers were designed according to the published sequence of tomato
CCD7 and CCD8． The CCD7 and CCD8 fragments were obtained by RT －PCR amplification，then they were concatenated
through specific enzyme digestion，and cloned into pUCCRNAi vector in a inverted repeat manner，finally inserted into p35
plant expression vector． Results show that we cloned about 400 bp CCD7 and CCD8 gene fragment，respectively． The
concatenation gene CCD7－8 of 800 bp was constructed by gene fragment splicing． Two copies of CCD7－8 gene was inserted
into pUCCRNAi vector and got 1 700 bp contain Intron’s inverted repeat sequence In－7－8． Then they were inserted into p35
vector successfully and the RNAi vector was constructed correctly by enzyme digestion analysis． Finally successful constructed
tomato CCD7 and CCD8 two concatenation genes’ RNA silencing expression vector p35－In－7－8．
Key words： tomato（Lycopersicon esculentum Mill．）； strigolactones； orobanche； carotenoid cleavage dioxygense 7（CCD7） and
8（CCD8）；RNA silencing vector
第 21 期
表 1 PCR 扩增所用引物序列
引物名称
7-F
7-R
8-F
8-R
引物序列（5′-3′）
GCTCTAGATACTGCCTATTGGGATTAC
GAAGGCCTCACATTCTTCATAACTTTCG
GAAGGCCTAGACAAATCGAATCGGACGCATATA
GCGTCGACCTGCCTCCATTCTCACCACC
酶切位点
XbaⅠ
StuⅠ
StuⅠ
SalⅠ
产物
CCD7 基因片段
CCD8 基因片段
成的经济损失达数十亿美元［1－3］。 人们采用农业、物
理、化学、生物等各项措施防治列当，均无法完全防
治，在列当严重发生地区的农民会因为防效和防治
成本等问题直接放弃所种作物甚至弃耕土地［4，5］。列
当靠种子进行繁殖，且种子产生量大，1 株成熟植株
可产生 5 万～50 万粒种子，种子可随风、流水、人为
活动等因素快速传播， 可在土壤中存活数十年，这
是列当难以防治的重要原因 ［1，3］。 列当种子内的
KAI2蛋白是一个受体蛋白，可感受到寄主植物根系
分泌的独脚金内酯类似物的刺激然后诱导列当种
子萌发 ［6］，若能减少寄主植物分泌的独脚金内酯或
使其不分泌， 则有望培育出抗列当的寄主品种 ［7］。
Dor等［8］发现番茄（Lycopersicon esculentum Mill．）突
变株 SL－ORT1 因不能产生独脚金内酯从而对埃及
（瓜）列当表现出高抗特性；用类胡萝卜素生物合成
途径抑制剂氟啶草酮处理番茄后， 与对照相比，处
理番茄植株根系几乎检测不到独脚金内酯，同时根
际大麻列当种子萌发率减少 98％以上［9］。 在植物体
内，类胡萝卜素裂解双加氧酶 7（CCD7）和 8（CCD8）
是独脚金内酯合成途经中最为关键的 2 个功能基
因， 可共同作用将 β－类胡萝卜素裂解成独脚金内
酯，这 2 个基因缺失或者沉默，均会导致独脚金内
酯合成量下降或不能合成 ［7，10］。 列当目前在新疆主
要农业区均有分布，已在加工番茄、甜瓜、向日葵等
重要经济作物上造成严重损失 ［3，11］。 本研究从番茄
上克隆 CCD7 和 CCD8 基因，并利用获得的基因，构
建 RNA 沉默载体， 为获得抗列当的独脚金内酯合
成量减少的植株提供技术支撑。
1 材料与方法
1．1 材料
材料：所用番茄品种为改良毛粉 802，将番茄种
子用 2％的次氯酸钠消毒后种植于营养土 ∶蛭石为
1∶1 的花盆内并置于温室培养，2 d 浇 1 次水， 待长
到 7～8 片真叶后将其从花盆中取出，切取根系并用
水冲洗干净，晾干。 根据 TRIzol法提取根部 RNA并
反转录为 cDNA备用。
载体 ：中间载体 pUCCRNAi 和植物表达载体
p35 由石河子大学生命科学学院黄先忠老师赠送。
菌株：大肠杆菌 DH5α由本实验室保存。
主要试剂：pMD18－T Vector、DNA 限制性内切
酶、T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶购自 TaKaRa
公司；质粒小量提取试剂盒，凝胶回收试剂盒购自
天根生化科技（北京）有限公司；引物合成和基因测
序由北京六合华大基因科技有限公司完成。
1．2 目的基因片段的获得及验证
根据 NCBI 上已知番茄 CCD7 和 CCD8 基因的
序列信息，分别设计了两个基因部分片段引物（表
1）。为了便于载体的构建，在扩增 CCD7目标片段的
上下游引物上分别引入 XbaⅠ和 StuⅠ酶切位点，在
扩增 CCD8 目标片段的上下游引物上分别引入 Stu
Ⅰ和 SalⅠ酶切位点。
以提取的番茄根部 cDNA 为共同模板，7－F 和
7－R为引物，扩增 CCD7基因片段；再以 8－F 和 8－R
为引物，扩增 CCD8基因片段。利用琼脂糖凝胶电泳
分离上述 PCR 扩增产物，割胶回收目的基因片段并
连接于 pMD18－T 载体上转化培养，PCR 鉴定为阳
性的克隆进行测序验证。
1．3 目的片段的串联
将片段 CCD7 和 CCD8 分别克隆到 pMD18－T
载体上， 通过 PCR 筛选目标基因片段， 分别记作
pMD18－T－7 和 pMD18－T－8。
用限制性内切酶 StuⅠ和 SalⅠ双酶切 pMD18－
T－7；再用 StuⅠ和 SalⅠ切取 CCD8 片段，用 T4连接
酶将片段 CCD8连入 pMD18－T－7 中，并将新得到的
克隆命名为 pMD18－T－7－8。
1．4 反向重复序列在中间载体 pUCCRNAi 上的
构建
1）串联片段正向插入 pUCCRNAi 质粒 。 以
pMD18－T－7－8 为模板，7－F 和 8－R 为引物，PCR 扩
增串联片段 CCD7－8。 载体 pUCCRNAi 和 pMD18－
T－7－8 分别用 XbaⅠ和 SalⅠ双酶切后，将串联片段
正向插入到 pUCCRNAi中，记作＋pRNAi－7－8。
2）串联片段反向插入 pUCCRNAi 质粒。 因为
pUCCRNAi质粒上 XbaⅠ、SalⅠ与 SpeⅠ、XhoⅠ分别
为同尾酶，所以载体＋pRNAi－7－8 用 SpeⅠ和 XhoⅠ
双酶切后， 直接将串联片段 CCD7－8 连入＋pRNAi－
7－8 中，新得到的载体记作 pRNAi－In－7－8。
1．5 沉默表达载体的构建
用 PstⅠ将 pRNAi－In－7－8 上包含 Intron 在内
田 芳等：番茄独脚金内酯合成关键基因 CCD7、CCD8 RNA 沉默载体的构建 5669
湖 北 农 业 科 学 2016 年
的反向重复序列切下，插入用同样酶切且已去磷酸
化的 p35 植物表达载体上， 筛选转化重组体得到
CCD7－8基因的反向重复植物表达载体 p35－In－7－8。
2 结果与分析
2．1 目的基因片段的获得及验证
以 7－F 和 7－R 为引物，获得的番茄 cDNA 为模
板进行 PCR 扩增， 得到约 400 bp 大小的目标条带
（图 1A）；以 8－F 和 8－R 为引物、番茄 cDNA 为模板
进行 PCR 扩增，获得约 400 bp 大小的目标条带（图
1B），均与预计结果接近。 PCR产物与 pMD－18－T载
体连接后，挑选单克隆进行测序。将测得的序列登陆
NCBI进行 Blast比对。 通过 MEGA5．05 软件构建系
统发育树。 CCD7的系统发育树（图 2 A）显示 CCD7
与 Solanum lycopersicum CCD7 NM＿001247504．1在
同一个分支上聚为一组，同源性达到 97％；CCD8的系
统发育树（图2B）显示，CCD8 与 Solanum lycoper-
sicum CCD8 JF831532．1、Solanum lycopersicum CCD8
NM＿001279347．2 在同一个分支上聚为一组，同源性
较高。 结果表明，克隆的 CCD7和 CCD8序列正确。
2．2 目标片段的串联
将片段 CCD7与 T载体连接，转化、挑克隆并摇
菌， 以 7－F 和 7－R 为引物进行菌液 PCR， 得到约
400 bp大小的片段，说明片段 CCD7已连上 T 载体，
记作 pMD18－T－7（图 3A）。
用 StuⅠ和 SalⅠ双酶切片段 CCD8后，与同样酶
切的 pMD18－T－7 载体相连，以 7－F 和 8－R 为引物，
PCR 扩增串联片段 CCD7－8，电泳检测，得到 800 bp
左右的条带，记作 pMD18－T－7－8（图 3B）。获得含有
CCD7和 CCD8 2个基因片段的串联基因。
2．3 干涉中间载体的构建
2．3．1 串联片段正向插入 pUCCRNAi 质粒 采用
限制性内切酶 XbaⅠ和 SalⅠ对 pMD18－T－7－8质粒
进行酶切 ， 获得大小为 800 bp 的串联基因片段
CCD7－8。酶切片段经割胶回收后连入同样酶切开的
pUCCRNAi载体，获得＋pRNAi－7－8重组载体。以 7－
F和 8－R 为引物，PCR 扩增， 得到约 800 bp 的目标
条带（图 4），表明 CCD7－8已连入 pUCCRNAi载体。
2．3．2 串联片段反向插入 pUCCRNAi 质粒 采用
限制性内切酶 SpeⅠ和 XhoⅠ酶切＋pRNAi－7－8 质
粒，将串联基因 CCD7－8连入其中，获得 pRNAi－In－
7－8 重组载体。 采用 PstⅠ对重组载体进行酶切鉴
定，结果显示，重组载体能切下 1 700 bp 左右的目
的基因条带（图 5）。 表明串联基因 CCD7－8 已反向
连入＋pRNAi－7－8 载体，pRNAi－In－7－8 中间载体构
A．1、2.CCD7 基因片段；B.1、2.CCD8 基因片段；M.DM2000 Marker
图 1 CCD7 和 CCD8 基因片段的 PCR 扩增
M 1 2
A B
500 bp
M 1 2
500 bp
图 2 基于 CCD7 和 CCD8 序列构建的系统发育树
CCD7
Solanum lycopersicum CCD7 NM_001247504.1
lSolanum lycopersicum cultivar M82 CCD7 GQ468555.1
Solanum tuberosum XM_006347863.1
Prunus mume CCD7 XM_008234396.1
0.02
97
Nicotiana tabacum cultivar K326（MAX4） KC795555．1
Solanum lycopersicum CCD8 JF831532.1
Solanum lycopersicum CCD8 NM_001279347.2
CCD8
Solanum tuberosum CCD8 lXM_006359699.1
0.02
92
100
A
B
1.空白；2、3.CCD7－8 基因片段；M.DM2000 Marker
图 4 ＋pRNAi－7－8 的 PCR 检测结果
M 1 2 3
750 bp
1、2.In－7－8 基因片段；M.Marker 3
图 5 pRNAi－In－7－8 的酶切鉴定结果
M 1 2
2 000 bp
1 200 bp
A．1、2.CCD7基因片段；B．1－2.CCD7－8基因片段；M．DM2000 Marker
图 3 pMD18－T－7 和 pMD18－T－7－8 的 PCR 检测
M 1 2
500 bp
M 1 2
750 bp
A B
5670
第 21 期
建成功。
2．4 沉默表达载体的构建
用限制性内切酶 PstⅠ双酶切 pRNAi－In－7－8
质粒，获取了包含 Intron 的 In－7－8 片段。 将酶切后
的 In－7－8 片段回收后定向插入以相同限制性内切
酶酶切且去磷酸化的植物表达载体 p35 上。重组载
体用限制性内切酶 PstⅠ进行酶切， 可切下大小约
1 700 bp的条带（图 6），表明包含 Intron 在内的串联
基因 CCD7－8 已成功连入 p35， 从而得到具有反向
重复序列的植物表达载体 p35－In－7－8。
3 小结与讨论
独脚金内酯（Strigolactones，SLs）是一类新发现
的类胡萝卜素衍生型植物激素， 其在抑制植物分
枝、调节根生长、叶老化和花的形成方面有重要作
用，在刺激列当种子萌发并与寄主植物建立寄生关
系过程中也至关重要［6，7］。目前已知有多个酶参与独
脚金内酯的合成 ， 其中胡萝卜素裂解双加氧 7
（CCD7）和胡萝卜素裂解双加氧酶 8（CCD8）发挥了
关键作用 。 本研究中克隆获得的番茄 CCD7 和
CCD8 基因经 BLAST 分析后与 Solanum lycoper-
sicum 的 CCD7 和 CCD8 都有很高的同源性。 Vogel
等 ［10］将番茄中的 CCD7 沉默后，番茄上 Orobanche
ramosa 的寄生量减少了 90％，但同时番茄分枝量有
了明显的增加；Pasare 等 ［12］将马铃薯的 CCD8 沉默
后马铃薯表现出侧枝增加， 匍匐茎减少。 Gomez－
Roldan 等 ［13］将豌豆体内与独脚金内酯合成密切相
关的 CCD8基因被缺失突变后突变体无法有效合成
独脚金内酯，列当的寄生数量也显著减少。 单个基
因的沉默已经取得了良好的抗列当效果。
反向重复序列导入植物体是一种高效诱导
RNA 沉默的方法，其优点是在任何遗传转化体系成
熟的植株中都可进行， 且产生的 RNA 沉默高效持
久并能在后代稳定遗传［14］。 本研究先在一个小型中
间载体中构建好反向重复序列后再转入植物表达
载体，并且两个反向重复片断之间有 Intron 隔开，选
用小型中间载体 pUCCRNAi 构建反向重复拷贝数
高，操作容易。 本研究在构建 RNA沉默载体时所用
的 pUCCRNAi 中间载体中已经插入了一段 Intron
序列，使用十分方便。同时把 CCD7和 CCD8进行串
联，同时插入到一个载体中，减少了多余的试验操
作，省时省力。
本研究以番茄根部提取的 cDAN为模板， 克隆
CCD7 和 CCD8 基因片段并使其串联， 插入到中间
载体 pUCCRNAi 中构建反向重复结构，最后插入到
植物表达载体 p35 上，成功构建含 2 个基因片段的
RNA沉默载体 p35－In－7－8，为研究抗列当的番茄新
品种培育提供了技术支撑。
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1、2.In－7－8 基因片段；M.DM 1 kb Marker
图 6 p35－In－7－8 的酶切鉴定结果
M 1 2
10 000 bp
2 000 bp
1 000 bp
田 芳等：番茄独脚金内酯合成关键基因 CCD7、CCD8 RNA 沉默载体的构建 5671