全 文 ：三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及植物表达载体
的构建
何晓兰1 , 　吴纪中2 , 　刘桂华1 , 　张保龙1 , 　钦　佩3 , 　侯喜林4 , 　朱卫民1
(1.江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 , 江苏 南京 210014;2.江苏省农业科学院粮食作物研究所 , 江苏 南京
210014;3.南京大学生物技术研究所 ,江苏 南京 210093;4.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,江苏 南京
210095)
收稿日期:2003-04-10
基金项目:江苏省高新技术资助项目(005034310105)
作者简介:何晓兰(1973-),女 ,江苏东台人 ,硕士 , 助理研究员, 主要
从事植物基因工程研究。
　　摘要:　通过 RT-PCR技术从盐生植物三角叶滨藜总 RNA 中 , 扩增并克隆了 BADH68 基因。该基因全序列显
示 ,核苷酸序列长 1 520 bp , 12～ 1 515 bp 为1 个开放阅读框架 , 推测的氨基酸序列全长为 500 个氨基酸残基 ,其核苷
酸序列与菠菜和山菠菜同源性分别为 89%和 95%。 利用 BamHI和 SacI 酶切位点将 BADH68基因连接到 pCAMBI-
A2301的多克隆位点 , 并把 35S 启动子和 nos终止子分别连接到 BADH 基因的上游和下游的多克隆位点上 , 获重组
植物表达质粒 pCAMATBADH682 , 并转入根癌农杆菌 LBA4404 中 ,获 LBA4404(pCBAMATBADH682)菌种。
关键词:　三角叶滨藜;甜菜碱醛脱氢酶;基因克隆;植物表达载体
中图分类号:　S636.9　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2003)04-0237-05
Cloning of Betaine Aldehyde Dehydrogenase(BADH)Gene from Atriplex
triangularis and Its Plant Expression Vector Construction
HE Xiao-lan1 , 　WU Ji-zhong2 , 　LIU Gui-hua1 , 　ZHANG Bao-long1 , 　QIN Pei3 , 　HOU Xi-lin4 , 　ZHU Wei-min1
(1.Institute of Agrobiological Genetics and Physiology , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , China;2.Institute of Food Crops , Jiangsu
Academy of AgriculturalSciences , Nanjing 210014 , China;3.Institute of Biotechnology , NanjingUniversity , Nanjing 210093 , China;4.StateKey Laborato-
ry of Crop Genetics and Germplasm Enhancement , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China)
　　Abstract:　BADH68 gene was amplified from Atriplex triangularis cDNA with RT-PCR technique.The nucleotide sequences
of this gene showed 89% and 95% identity to the BADH cDNA from Spinacia oleracea and Atriplex hortensis , respectively.
BADH68 gene was cut in BamHI and SacI sites , and linked to the multiclone sites of pCAMBIA2301.35S promoter and nos termi-
nus were joined to the sites of the upstream and downstream of BADH68 gene , respectively.Plant recombination expression vec-
tors , pCAMATBADH682 was obtained , and translated to Agrobacterium tumefaciens LBA4404.
Key words:　Atriplex trangularis;betaine aldehyde dehydrogenase;gene cloning;plant expression vector
　　三角叶滨藜(Atriplex triangularis)是藜科滨藜属
植物 ,自然分布于沿海沼泽边缘 ,可用海水直接浇罐
的一年生多叶植物 ,叶可食用 ,且具有较强的耐盐耐
旱能力[ 1] 。生物对非生物胁迫的普遍反应是积累与
细胞代谢相容的低分子量有机溶质 ,如蔗糖 、甘露
醇 、脯氨酸 、海藻糖以及季胺类化合物[ 2～ 4] 。甜菜碱
是一种季胺类化合物。
据报道 ,藜科植物中的甘氨酸甜菜碱(GB)是经
过两步催化合成的 ,即乙酰胆碱※甘氨酸甜菜碱醛
※甘氨酸甜菜碱[ 5] ,其中第二步由甜菜碱醛脱氢酶
(BADH)所催化 。GB作为参与渗透调节的小分子物
质 ,它的积累与盐胁迫和缺水的严重程度成比例 ,在
生物合成水平上受到调控。1990 年 Elizabeth 等首
237江苏农业学报(Jiangsu J .of Agr.Sci.), 2003 , 19(4):237～ 241
次从菠菜中克隆出 BADH 基因[ 6]以来 ,人们已从山
菠菜[ 7] 、猪苋菜[ 8] 、甜菜[ 9] 、大麦[ 10]等中分离和鉴定
出了 BADH 基因 。本研究以我们从三角叶滨藜中克
隆到的 BADH cDNA 的拼接序列(GenBank 注册号:
AY256971)设计引物 , 从盐生植物三角叶滨藜总
RNA中分离 BADH基因 ,并将其构建到植物表达载
体上 ,以期探明该基因的植物表达 ,进而为阐明植物
耐盐分子机理及创造耐盐新种质奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　植物　三角叶滨藜播种于蛭石中 ,经Hongland
营养液培养 ,待幼苗长出 2片真叶时取部分幼苗进行
盐处理 ,处理起始浓度为 50 mmol/L NaCl ,每隔 3 d浓
度提高50 mmol/L ,直至浓度达到500 mmol/L ,并使苗
在500 mmol/L NaCl的溶液中生长 7 d。
1.1.2　菌种和质粒　pMD18-T Vector 为 TakaRa 公
司产品;PCAMBIA2301由中国科学院上海植物生理
研究所提供;JM109 由复旦大学生命科学院提供;
LBA4404由南京农业大学王华忠博士提供。
1.1.3　主要化学试剂和酶　Trizol kit 和 3S plasmid
Miniprep Kit V3.1为上海申能博彩公司产品;TakaRa
RNA PCR kit(AMV)ver21 、RNaseH、T4 DNA 连接酶 、
LA-Taq以及 BamHI 和 SacI等为 TakaRA公司产品 。
DNA gel extraction Kit为Vitagene公司产品。
1.2　方法
1.2.1　三角叶滨藜 RNA提取　取经盐处理后的三
角叶滨藜幼嫩展开叶 ,用 Trizol法抽提总 RNA(参照
Trizol kit说明书的方法)。
1.2.2　引物设计及目的基因的扩增　根据本实验
室克隆的三角叶滨藜 BADH cDNA 序列(GenBank 注
册号:AY256971)设计下列引物:
　TBf:5′-TTCA G↑GATCCBamHI ATGGCGTTTCCTATGCC-3′
TBr:5′-TCA GAGCT↑CSacl TAAGGAGACTTGTACCAG-3′
以三角叶滨藜总 RNA为模板 ,参照 TakaRa RNA
PCR kit(AMV)ver21提供的方法进行 cDNA合成及
PCR扩增。
1.2.3　BADH 基因克隆和 DNA 序列测定　PCR产
物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 ,用 DNA gel extrac-
tion Kit回收纯化 ,将回收的 DNA片段插入 pMD18-T
载体 ,构建重组质粒 pBADH ,转化感受态大肠杆菌
JM109。根据α互补原理酶切电泳法和 PCR法筛选
重组子 。DNA测序由上海申能博彩公司测定。
1.2.4　植物重组表达质粒的构建 　用 BamHI 和
Sacl酶切 pBADH 和 pCAMBIA2301 , 1.5%琼脂糖凝
胶电泳检测 , 再用 DNA gel extraction Kit 回收纯化
BADH 基因片段及线性载体片段 ,经 T4 DNA连接酶
连接两片段后再将 35S启动子和 nos终止子分别构
建到重组载体的 BADH 区段上下游多克隆位点上 ,
获得植物重组表达质粒 pCAMATBADH 。重组质粒
转化大肠杆菌 JM109 ,将转化产物均匀涂布于含 100
mg/L Kan的 LB 平板上 , 37℃培养 14 h。挑取单菌
落 ,分别接种于 3 ml含 100 mg/L Kan的 LB液体培
养基中 , 37℃下 200 r/min 振荡培养过夜。用 3S
plasmid Miniprep Kit V3.1抽提质粒 ,并进行琼脂糖
凝胶电泳检验和 PCR酶切鉴定 。
1.2.5　植物重组表达质粒的根癌农杆菌转化　用
冻融法将植物重组表达载体 pCAMATBADH 转入根
癌农杆菌 LBA4404 ,涂布于含 100 mg/L Kan 和 200
mg/L Rif的 YEB 平板上 ,28℃培养 36 h。挑取单菌
落 ,分别接种到 3 ml 含 100 mg/L Kan和 200 mg/L
Rif的 YEB液体培养基中 ,28℃下 250 r/min振荡培
养过夜 ,进行 PCR检测 。
2　结 果
2.1　三角叶滨藜 BADH 基因的克隆
以本实验室克隆的三角叶滨藜 BADH cDNA拼
接序列(GenBank注册号:AY256971)设计的引物 TBf
和 TBr ,对三角叶滨藜 cDNA进行 PCR扩增 ,获得长
近 1.5 kb 条带(图 1)。将纯化后的 PCR 产物与
pMD18-T 连接 ,并转化大肠杆菌 JM109。单克隆的
BamH Ⅰ限制性内切酶酶切鉴定及 TBf 和 TBr引物
的 PCR检测结果表明 ,已获得插有近 1.5 kb的外源
DNA片段的克隆 pBADH68。测序结果显示 ,该外源
片段全长为1 520 bp ,含有 1个1 500 bp的 ORF。其
核苷酸序列和推测的氨基酸序列与菠菜和山菠菜的
同源性分别为89%和 95%与86%和93%,且与本实
验室原克隆的 BADH cDNA 序列亦在 55 、239 、322 、
327 、579 、706 、715 、1 053以及1 367位点上存在差异 ,
同源性为99%(图 2)。
2.2　三角叶滨藜 BADH 基因植物表达载体的构建
上述重组质粒pBADH68经BamHI 和Sacl酶切 ,
将该重组质粒的外源插入片段连接到 pCAMBIA2301
238 江 苏 农 业 学 报 　2003 年 第 19 卷 第 4 期
M:GeneRulerTM DNA Ladder Mix;A:cDNA的 PCR产物。
M:GeneRulerTM DNA Ladder Mix;A:PCR products of cDNA.
图 1　三角叶滨藜 cDNA 的 PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析
Fig.1　Agarose gel electrophoretic analysis on PCR products from
Atriplex triangularis cDNA
的多克隆位点 BamHI和 SacI之间 ,然后将 35S启动
子和 nos终止子分别构建于重组载体的 BADH区段
上下游多克隆位点上。转化感受态 JM109。根据单
克隆的限制性内切酶 BamI和 SacI 的酶切鉴定以及
用 TBf和 TBr引物的 PCR检测结果 ,确认外源片段
已插入到 pCAMBI3301的多克隆位点上(图 3),其中
35S和 nos 插入片段的 PCR检测及酶切分析未显
示 。获得植物重组表达质粒 pCAMATBADH682。
2.3　植物重组表达载体的根癌农杆菌 LBA4404的
转化
下划线序列为引物 TBf 和TBr 所在位置;具阴影的 ATG 和TAG 分别为起始密码子和终止密码子;阴影部分为醛脱氢酶保守残基;方框字母为
与原三角叶滨藜 BADH cDNA的差异处。
Sequences with underline were TBf and TBr primers;ATG and TAG with shade were initiation codon and stop codon , respectively;the shaded area was conservative
amino acid residual bases of aldehyde dehydrogenase;the nucleotide codons in pane were different from its previous BADH cDNA of Atriplex triangularis.
图 2　三角叶滨藜 BADH cDNA核苷酸序列和推测的氨基酸序列
Fig.2　Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence for BADH cDNA from Atriplex triangularis
239何晓兰等:三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因克隆及植物表达载体的构建
a:pCAMATBADH的 BamHI 和 SacI酶切鉴定;b:LBA4404(pCAMATBADH)的 PCR鉴定;M1:λDAN/HindⅢ marker;M2:GeneRulerTM DNA Ladder
Mix;A:pCAMATBADH682酶切产物;CK:LBA4404空菌株的PCR产物;E 、F、G、H 、I 、J:LBA4404(pCAMATBADH682)的 6个单克隆 PCR产物。
a:identification of pCAMATBADH digested by BamHI and Sacl;b:PCR identification of LBA4404(pCAMATBADH);M1.λDNA/HindⅢ marker;M2:
GeneRulerTM DNA Ladder Mix;A:the products of pCAMATBADH682 digested by restriction endonucleases;CK:PCRproduct of LBA4404;E ,F ,G ,H , I and J:
PCR products of LBA4404(pCAMATBADH682).
图 3　琼脂糖电泳分析
Fig.3　Agarose gel electrophoretic analysis
　　用冻融法将植物重组表达质粒 pCAMAT-
BADH682转入感受态根癌农杆菌 LBA4404 ,挑取 6
个单克隆 ,用TBf和TBr引物进行PCR检测 ,得到与
BADH基因大小相同的 PCR产物(图 3)。表明植物
重组表达质粒 pCAMATBADH682 已转入 LBA4404 ,
命名为 LBA4404(pCAMATBADH682)。
3　讨 论
本研究从三角叶滨藜 cDNA 中扩增并克隆了
BADH68基因 。测序结果表明 , pBADH68的外源插
入片段含有 1个完整的开放阅读框架 ,其推测的氨
基酸序列与菠菜和山菠菜的同一性分别为 89%和
95%,推测编码了 1个由 500个氨基酸残基组成的
蛋白质(图 2)。起始 8 个氨基酸残基后含有与菠
菜[ 7] BADH 完全一致的七肽片段 Gln-Leu-Phe-Ile-
Asp-Gly-Glu。该七肽是由胰蛋白酶消化完整 BADH
蛋白产生的 ,前后氨基酸分别为 Arg 和Gln。起始 7
个氨基酸残基与菠菜的相似 ,可能是 1个不典型的
转导肽 Met-Ala-Phe-Pro-Met-Pro-Val。推测的蛋白质
序列在 259 ～ 266亦包含 1个十肽基序 Val-Thr-Leu-
Glu-Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro 以及在 294 位点上含有
与酶功能有关的醛脱氢酶高度保守的氨基酸残基
Cys。这些残基可能包含 NAD+结合位点及酶催化
位点[ 7] ,表明 BADH68基因可编码活性蛋白 。
所克隆的 BADH68基因核苷酸序列和推测的氨
基酸序列与原三角叶滨藜 BADH cDNA拼接序列的
同源性分别为99%和 96%,在核苷酸序列和推测的
氨基酸序列的多个位点上存在差异。其原因可能是
三角叶滨藜 BADH 基因是 1个多基因家族成员 ,这
在高梁[ 11] 、红树[ 12] 、猪苋菜[ 8]等上已有报道 。另一
原因可能是 PCR扩增引起突变 。采取高保真的 pfu
酶进行 PCR扩增等措施可降低 PCR的突变率[ 13] 。
此外 ,对 PCR产物进行多个克隆的测序分析 ,去除
少数突变产物克隆 ,可以降低 PCR产物直接用于基
因表达等后期工作的难度。
甘氨酸甜菜碱是植物的一个重要渗透保护剂 ,
BADH 酶是甘氨酸甜菜碱合成的关键酶。但很多农
作物如水稻 、油菜 、马铃薯和蕃茄等却没有甜菜碱积
累 。油菜中亦存在 BADH 基因 ,但油菜在干旱和盐
胁迫诱导下不积累 BADH。我们从盐生植物三角叶
滨藜中克隆了 BADH68基因 ,其推测的氨基酸序列
与菠菜和山菠菜有一定差异 。本研究把三角叶滨藜
BADH68基因成功构建到 pCAMBIA2301 载体上 ,获
得 pCAMATBADH植物重组表达载体 ,并将其转入根
癌农杆菌 LBA4404 中 , 获重组菌株 LBA4404(pCA-
MATBADH682)。目前正通过农杆菌介导法用三角
叶滨藜 BADH68基因转化油菜 ,以进一步验证该基
因的功能 ,并试图通过转基因技术获得耐盐油菜新
种质。
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