全 文 ：江苏农业学报(Jiangsu J .of Agr.Sci.), 2004 ,20(2):65～ 69
三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因 5′侧翼序列的克隆与
分析
何晓兰1 , 　刘桂华1 , 　倪万潮1 , 　侯喜林2 , 　吴纪中3 , 　钦　佩4 , 　朱卫民1
(1.江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所 ,江苏 南京 210014;2.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 ,
江苏 南京 210095;3.江苏省农业科学院粮食作物研究所 , 江苏 南京 210014;4.南京大学生物技术研究所 , 江苏 南京
210093)
收稿日期:2003-10-10
基金项目:江苏省高新技术项目(BG2001314)
作者简介:何晓兰(1973-),女 ,江苏东台人 ,硕士,助理研究员 ,主要从
事植物基因工程研究。
　　摘要:　根据三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)5′端序列设计特异引物 , 采用反向 PCR技术从三角叶滨
藜总DNA中扩增并克隆了该基因的5′侧翼区约855 bp 的片段。距起始密码子ATG 77 bp 处的T 碱基为可能的转录
起始位点。 在-25 ～ -30 bp、-260 ～ -265 bp、-337 ～ -342 bp 以及-715 ～ -720 bp 含有推测的 TATA-box
(TATAAA), 在-389～ -393 bp 和-720～ -724 bp 含有推测的 CAAT-box(CCAAT), 以及在-112～ -116 bp 和-397
～ -401 bp含有推测的 ABA 作用元件CACGT。仅其-178～ -1 bp 区与中亚滨藜 BADH 基因启动子区高度同源 , 同
源性为 90%。该 BADH 基因 5′侧翼区与其它植物 BADH 基因的启动子区无同源性。
关键词:　三角叶滨藜;甜菜碱醛脱氢酶基因;5′侧翼序列;反向 PCR
中图分类号:　S636.9　　　文献标识码:　A　　　文章编号:　1000-4440(2004)02-0065-05
Molecular Cloning and Sequence Analysis of 5′Flanking Sequence of Be-
taine Aldehyde Dehydrogenase Gene in Atriplex triangularis
HE Xiao-lan1 , 　LIU Gui-hua1 , 　NI Wan-chao1 , 　HOU Xi-lin2 , 　WU Ji-zhong3 , 　QIN Pei4 , 　ZHU Wei-min1
(1.Institute of Agrobiological Genetics and Physiology , Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , China;2.NationalKey Laboratory of Genet-
ics and Germplasm Enhancement , Nanjing Agricultural University , Nanjing 210095 , China;3.Institute of Food Crops , Jiangsu Academy of Agricultural Sci-
ences , Nanjing 210014 , China;4.Institute of Biotechnology , Nanjing University , Nanjing 210093 , China)
　　Abstract:　According to the specified primers designed by 5′end sequences of the betaine aldehyde dehydrogenase gene
(BADH)in Atriplex triangularis DNA , the fragment of its 5′flanking sequences were amplified and cloned by inverse PCR tech-
nique.Results showed a base T , 77 bp away from the initiation codon ATG for translation , was the possible initiation site for tran-
scription.The 5′flanking sequences had four predicted TATA motifs(-25--30 bp , -260--265 bp , -337--342 bp
and -715--720 bp), two predicted CCAAT motifs(-389--393 bp and -720--724 bp)and two predicted ABA re-
sponse elements(-112--116 bp and -397--401 bp).The sequences between -178--1 bp showed 90% identity to
the promoter of BADH gene of A.centralasiatica.
Key words:　Atriplex triangularis;betaine aldehyde dehydrogenase gene;5′flanking sequence;inverse PCR
　　三角叶滨藜(Atriplex triangularis)是藜科滨藜属
一年生多叶植物 ,叶可食用 ,自然分布于沿海沼泽边
缘 ,具有较强的耐盐耐干旱能力 ,可以用海水直接浇
灌[ 1] 。甘氨酸甜菜碱是季胺类化合物 ,作为一种重
要的渗透保护剂 ,有助于提高植物对非生物逆境的
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适应性[ 2 , 3] 。在藜科植物中 ,甘氨酸甜菜碱经两步
催化合成[ 4] ,其中第二步是由甜菜碱醛脱氢酶(Be-
taine aldehyde dehydrogenase , BADH)所催化。BADH
活性受盐诱导[ 5 ,6] ,其调控可能主要是在基因表达
水平上进行。目前 , BADH 基因 5′侧翼区已从甜菜
碱积累植物菠菜 、中亚滨藜以及苋菜中得到分
离[ 7 ～ 9] 。但对该基因启动子表达调控方面的研究较
少。
本研究以本实验室从三角叶滨藜中克隆到的
BADH cDNA序列(GenBank注册号:AY256971)设计
的引物 ,采用反向 PCR法 ,首次从三角叶滨藜基因
组中分离并克隆了该基因 5′侧翼区 ,以期为深入研
究该启动子的表达调控奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料
三角叶滨藜种子由南京大学盐土农业基地提
供 ,2002 年 4 月下旬播种于蛭石中 ,用 Hongland 营
养液培养。限制性内切酶 AluI、EcoRI、HindⅢ 、PstI 、
SalI 、Sau3AI 、SmaI、BamHI、SacI 和 XbaI 、T4 DNA 连接
酶 、质粒载体 pMD18-T 以及 LA-Taq DNA 聚合酶均
购自 TakaRa公司。大肠杆菌(E .coli)JM109为本实
验室保存 。
1.2方法
1.2.1　三角叶滨藜总DNA的提取　参照张保龙的
抽提方法[ 10] , 再用 2.0 μl 提取的 DNA 样品进行
1.0%琼脂糖凝胶电泳 ,检测 DNA的质量和浓度。
1.2.2　反向PCR
1.2.2.1　总 DNA的酶切　参照TakaRa公司限制性
内切酶 Kit的操作方法 ,用 AluI、BamHI、EcoRI 、Hind
Ⅲ、PstI 、SalI、Sau3AI、SmaI 及 XbaI 共 9 种酶分别对
0.2 μg 三角叶滨藜总 DNA 进行酶切 , 37℃水浴过
夜。
1.2.2.2　酶切片段的环化　参照 TakaRa 公司 T4
DNA连接酶 Kit的操作方法 ,25.0 μl反应总体积中
分别加入 12.5 μl ddH2O , 2.5 μl 10×T4 DNA ligase
buffer ,10.0 μl酶切总 DNA 及 1.0 μl T4 DNA 连接
酶 ,16℃连接过夜 ,从而获得 9个酶切PCR反应库 。
1.2.2.3　引物的设计与 PCR扩增　根据 BADH 基
因连接酶 5′端序列设计引物 ,由上海申能博彩公司
合成 。序列如下 ,P1:5′-ATC GCA TTC CCA TCA TCA
ACC-3′;P2:5′-GGG AGG AGA GAG AAA GAG TGG-
3′;P3:5′-ACG AAC AGG CAT AGG AAA CGC-3′;P4:
5′-CGA TGG GGA GAG GAG AGA ACC-3′。
PCR反应体系参照 LA-Taq DNA 聚合酶 Kit的
方法 , 用引物 P3和 P4分别以各酶切 PCR反应库
(经 94℃,10 min总变性)为模板进行第一轮 PCR扩
增 ,反应条件:98℃, 10 s;58℃, 1 min 30 s;72℃, 3
min进行 20 个循环 ,尔后 98℃,10 s;54℃, 1 min 30
s;72℃,3 min进行 15个循环 。再以 2.0 μl第一轮
PCR产物为模板 ,用引物 P2和 P1进行第二轮 PCR
扩增 ,反应条件:94℃,2 min 之后 98℃, 10 s;58℃, 1
min 10 s;72℃,2 min 30 s进行20个循环 ,尔后98℃,
10 s;54℃, 1 min 10 s;72℃2 min 30 s 进行 15个循
环 。
1.2.3　PCR产物克隆与测序　用琼脂糖凝胶电泳
法回收和纯化扩增的目的片段 。在 T4 DNA 连接酶
作用下 ,将纯化的 DNA 片段插入载体 pMD18-T ,构
建重组质粒 ,转化感受态大肠杆菌 JM109 ,根据α互
补原理 ,酶切电泳法及 PCR法筛选重组子。DNA测
序由上海申能博彩公司测定 。
1.2.4　序列分析　用 DNAtools和 DNA Club软件进
行序列分析 ,并用网上软件作转录起始位点和启动
子信号分析(http://biosci.umn.edu/ software/proscan/
promoterscan.html),以及同 GenBank 数据库(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov)资料作核苷酸序列同源性比
较 。
2　结 果
2.1　三角叶滨藜 BADH基因 5′侧翼区的扩增与克
隆
引物P1 、P2 、P3和 P4在三角叶滨藜 BADH 基因
5′端序列上的位置见图 1。采用反向 PCR法 ,分别
从 AluI库 、EcoRI库 、PstI 库 、SalI库以及 Sau3AI 库中
扩增出 5条 、1条 、1 条 、1条以及 3条片段 ,共计 11
条 ,大小为 300 bp 至 3.5 kb(图 2 , 其中 SmaI 库和
XbaI库的 PCR图谱未显示)。将分别从 AluI 库 、PstI
库 、SalI库和Sau3AI库中扩增得到的1.4 kb 、450 bp 、
3.5 kb 和 500 bp 片段分别命名为 gBADH31 、
gBADH36 、gBADH37 和 gBADH39 ,插入 pMD18-T ,转
入 JM109中 ,皆获得了外源插入片段的克隆 。
66 江 苏 农 业 学 报 　2004 年 第 20 卷 第 2 期
带下划线的ATG为翻译起始密码子;带下划线的T 为可能的转录起始位点;阴影序列分别为引物 P2 、P3 、P4和 P1所在位置。
ATG with underline is an initiation codon for translation.T with underline is a possible initiation site for transcription.The shaded regions are the primer posi-
tions of P2 , P3 , P4 and P1.
图 1　引物 P1 、P2、P3和P4在三角叶滨藜 BADH基因 5′端所在的位置
Fig.1　Positions of primers P1 , P2, P3 and P4 in 5′end of BADH gene of Atriplex triangularis
A、B 、C 、D、E 、F 、G 分别表示以 AluI、BamHI 、EcoRI、HindⅢ 、PstI 、SalI 和 Sau3AI 进行酶切后所得的第一轮PCR产物;A 1、B1 、C1 、D1 、E1 、F1 、G1 分
别表示相应的第二轮PCR产物;M 表示 1 kb DNA Ladder;箭头指示处为进行克隆的DNA片段。
A , B ,C , D , E ,F and G represent the first PCR products of DNA digested by AluI , BamHI , EcoRI , HindⅢ , PstI , SalI and Sau3AI , respectively;A1 , B1 ,
C1 , D1 , E1 , F1 and G1 represent the corresponding second PCR products , respectively;M means 1 kb DNA Ladder;DNA segments clonedwere indicated using
arrows.
图 2　反向 PCR 产物的琼脂糖电泳
Fig.2　Agarose gel electrophoretic analysis of inverse PCR products
2.2　三角叶滨藜 BADH基因5′侧翼区的序列分析
分析结果表明 , gBADH31 、gBADH36和 gBADH39
的长度分别为 1 259 bp 、470 bp 和 485 bp , 其中
gBADH36和 gBADH39序列包含于 gBADH31中 。而
gBADH37未能成功测序。 gBADH31 含有 1 个正向
AluI(AGCT)位点和 2 个反向 AluI(TCGA)位点;
gBADH36仅含有 1个 PstI 位点;gBADH39含有 2 个
正向 Sau3AI(GATC)位点和 1个反向 Sau3AI(CTAG)
位点。以 gBADH31从引物 P2至第一个 AluI位点为
确证的三角叶滨藜 BADH 基因 5′侧翼区序列 ,通过
反向 PCR至少获得距 BADH 起始密码子ATG长855
bp 三角叶滨藜 BADH 基因 5′侧翼区序列 。根据软
件分析结果 ,以及经过 cRACE获得的 BADH 基因的
5′前导序列 ,5′端距起始密码子 ATG 77 bp处的 T 碱
基为可能的转录起始密码子。在-25 ～ -30 bp 、-
260 ～ -265 bp 、-337 ～ -342 bp和-715 ～ -720 bp
序列为推测的TATA-box(TATAAA);在-389 ～ -393
bp和 -720 ～ -724 bp 序列为推测的 CAAT -box
(CCAAT),以及-112 ～ -116 bp和-397 ～ -401 bp
序列为推测的植物中通用的受 ABA信号诱导的顺
式作用元件 CACGT[ 11](图 3)。
GenBank BLAST 结果表明 ,三角叶滨藜 5′侧翼
区-178 ～ -1 bp区段与中亚滨藜启动子区有 90%
的同源性 ,且该区段 178个碱基中有 9个缺失 ,而该
区段上游序列与中亚滨藜启动子区无明显同源性。
此外 ,三角叶滨藜 5′侧翼区与现已克隆的菠菜和苋
菜[ 4 ,6] BADH基因启动子区亦无同源性 。
67何晓兰等:三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶基因 5′侧翼序列的克隆与分析
下划线处为CAAT-box;方框处为TATA-box;波浪线处为CACGT 元件;小写字母为 AluI 位点;黑体字母T 和ATG 分别为可能的转录起始
子和起始密码子;阴影序列为引物 P2所在位置。
Sequence with underline is CAAT-box.TATA-box is in pane position.Sequence withwave line is CACGT element.The AluI site is in small letter position.
The boldface letters T and ATG are the possible initiation site for transcription and initiation codon for translation.Primer P2 is binded at the shaded position.
图 3　三角叶滨藜 BADH基因 5′侧翼区
Fig.3　5′flanking region of BADH gene of Atriplex.triangularis
3　讨 论
在高盐条件下 ,甜菜叶和根中 BADH 基因转录
水平可分别提高 4倍和3 倍[ 5] 。大麦的叶和主根中
BADH mRNA水平亦能分别提高 8倍和 2倍[ 12] 。表
明高等植物 BADH 基因受盐诱导表达 ,在正常情况
下表达量较低 ,甚至不表达。郭北海 、刘凤华等通过
组成型启动子把菠菜 、甜菜以及山菠菜的 BADH 基
因转入其它非甜菜碱积累植物 ,在一定程度上提高
了转化植物的耐盐性[ 13 ,14] 。但 BADH 过量表达势
必给植物带来不利影响 ,即使不具胁迫环境 ,在组成
型启动子下 ,植物始终进行过量的转录和表达 ,消耗
过多能量 ,从而影响植物产量[ 15 , 16] 。如何使非甜菜
碱积累植物在盐胁迫时能及时且适量合成甜菜碱以
用于维持植物的渗透平衡 ,保护大分子物质 ,而在正
常条件下又不会进行 BADH表达。开展 BADH基因
启动子的研究便可在一定程度上克服这一困难。
本研究采用反向 PCR技术从三角叶滨藜分离
并克隆了 BADH基因5′侧翼区855 bp的序列 。该序
列含有4个TATA-box和 2个CAAT-box ,该基因 5′侧
翼区与现已克隆的菠菜和苋菜 BADH基因启动子区
没有同源性[ 7 , 9] ,且其-178 bp上游序列与中亚滨藜
启动子区亦无明显同源性 ,表明三角叶滨藜 BADH
基因5′侧翼区在转录调控上具有自身的特点。该基
因 5′侧翼区还具 2个 ABA 反应元件-CACGT ,表明
三角叶滨藜 BADH 基因可能受 ABA 诱导表达[ 17] 。
大麦 BADH基因研究报道 ,外施 ABA 可提高该基因
的转录水平 ,证明 BADH 基因受 ABA 诱导 ,但转录
水平较盐诱导低 ,因此该植物 BADH 基因可能仅需
ABA的间接参与[ 12] 。三角叶滨藜 BADH 基因是否
为ABA 依赖型基因 , 以及 5′侧翼区各个区段对
BADH 基因转录起什么作用 ,均有待进一步探明。
本研究采用反向 PCR进行基因组未知区段的
扩增 ,用四碱基限制性内切酶AluI和 Sau3AI形成的
酶切PCR反应库皆获得多条特异性DNA片段 ,较六
碱基限制性内切酶更成功 ,这与四碱基限制性内切
酶在基因组中位点较多有关 。试验中采用 7种六碱
基限制性内切酶 ,仅 EcoRI 、PstI 和 SalI 获得单一特
异性条带 ,因 EcoRI 的扩增片段较小(约 250 bp)而
放弃 ,PstI的扩增片段亦相对较小(485 bp)。SalI获
得约 3.5 kb 的条带 ,但较难克隆到一般的 T 载体
上 ,这可能是由于较长 PCR产物易形成一些位点的
缺刻 ,从而影响测序 。本试验采取多次克隆皆未能
成功测序 。但四碱基酶 PCR库亦存在明显不足 ,因
扩增片段往往含多个该酶切位点 ,不易断定环化位
点及其它短片段的连接并环化 ,给后期序列分析带
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来较大困难 。在用 AluI库扩增所获得的 gBADH 31
片段就含有 1个正向 AluI位点和 2个反向 AluI 位
点。为了排除其它短片段的连接 ,本研究仅以 P2引
物区段至第一个 AluI 位点之间的序列为确证的三
角叶滨藜 BADH 基因 5′侧翼区序列。
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