全 文 ：三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因的
克隆及序列分析
何晓兰1 ,2 , 侯喜林1 , 吴纪中3 , 刘桂华2 , 钦佩4 , 朱卫民2＊
(1.南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室 , 江苏 南京 210095;2.江苏省农业科学院遗传生理研究所 ,
3.粮食作物研究所 , 江苏 南京 210014;4.南京大学生物技术研究所 , 江苏 南京 210093)
摘要:以藜科植物山菠菜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因的保守区设计引物 , 通过 RT-PCR技术 , 从三角叶滨藜 cDNA中
分离了两个 BADH 基因片段 BADH3 和 BADH5 , 并利用巢式 PCR、 cRACE 以及 3′-RACE 获得全长 BADH3。测序结果表明 ,
BADH3 和 BADH5之间的核苷酸同源性为81%, 其推测的氨基酸序列同源性 80%。全长 BADH3 核苷酸序列长 1 815 bp , 79
～ 1 578 bp 为一个开放阅读框架 , 推测的氨基酸序列全长 500 个氨基酸残基 , 相对分子质量为 54 700 , pI 为 5.5。其核苷
酸序列和推测的氨基酸序列与山菠菜同源性分别为 95%和 93%。 由三角叶滨藜 3′端部分 BADH 基因的克隆 gBADH1 和
gBADH2 推测的外显子序列分别与 BADH5 和 BADH3 完全一致 , 且 gBADH1 和 gBADH2的内含子插入位置和大小有较大差
异。表明三角叶滨藜 BADH 基因是一个多基因家族 , 至少存在 2 个成员。
关键词:三角叶滨藜;甜菜碱 脱氢酶;基因;克隆;聚合酶链式反应
中图分类号:Q949.745.1;Q781　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000 2030 (2004)01 0015 05
Molecular cloning and sequence analysis of betaine-aldehyde
dehydrogenase(BADH)in Atriplex triangularis
HE Xiao-lan1 ,2 , HOU Xi-lin1 , WU Ji-zhong3 , LIU Gui-hua2 , QIN Pei4 , ZHU Wei-min2＊
(1.National Key Laboratory of Genetics and Germplasm Enhancement , Nanjing Agricultural University ,
Nanjing 210095 , China;2.Institute of Agrobiological Genetics and Physiology;3.Institute of Food and Crop ,
Jiangsu Academy of Agricultural Sciences , Nanjing 210014 , China;4.Institute of Biotechnology ,
Nanjing University , Nanjing 210093 , China)
Abstract:BADH3 and BADH5 , two partial BADH cDNAs were cloned from Atriplex triangularis through RT-PCR technique by specific
primers designed on the basis of BADH gene on Atriplex hortensis.Comparison between BADH3 and BADH5 showed 81% identity for nu-
cleotide sequences and 80% identity for deduced amino acid sequences , respectively.Moreover , a 1 815 bp full-length cDNA sequence
of BADH3 was obtained using nested PCR , cRACE and 3′-RACE technique.Further analyses on BADH3 indicated that an open reading
frame(ORF)of 1 500 bp contained in this gene and predicted to encode a protein of Mr 54 700 with 500 amino acids.The nucleotide and
the deduced amino acid sequences of this full-length BADH3 show 95% and 93% identity to Atriplex hortensis BADH gene , respectively.
Genomic clones(gBADH1 and gBADH2)of 3′end of BADH gene were amplified and isolated from Atriplex triangularis , which introns
show significant difference in the length and position.The deduced transcriptional of gBADH1 and gBADH2 accorded with BADH5 and
BADH3 , respectively.
Key words:Atriplex triangularis;betaine-aldehyde dehydrogenase (BADH);gene;cloning;polymerase chain reaction (PCR)
三角叶滨藜 (Atriplex triangularis)是藜科滨藜属植物 , 自然分布于沿海沼泽边缘 , 是可以经受海水
直接浇灌的一年生多叶植物 , 叶可食用 , 且具有较强的耐盐 、 耐干旱能力[ 1] 。甘氨酸甜菜碱
　　收稿日期:2003 04 30
　　基金项目:江苏省高新技术资助课题 (BG2001314)
　　作者简介:何晓兰 (1973 ), 助理研究员 , 主要从事植物基因工程研究。 E-mail:lanygrass@yahoo.com.cn
＊通讯作者 Corresponding author
　南京农业大学学报　2004 , 27 (1):15～ 19
Journal of Nanjing Agricultural University
(GB)作为季胺类化合物 , 是植物的一种重要的渗透保护剂 , 有助于生物适应非生物逆境[ 2 ,3] 。在藜科
植物中 , GB是经两步催化合成的[ 4] , 其中第二步是由甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)所催化。目前 , BADH
基因已从菠菜[ 5] 、山菠菜[ 6] 、 猪苋菜[ 7] 、甜菜[ 8] 、大麦[ 9]等植物中分离和鉴定 。迄今为止 , 有关三角叶
滨藜GB的生物合成途径及相关合成基因的研究还未见报道。本试验从三角叶滨藜中分离了 BADH 基
因 , 并对其进行了序列分析。
1 　材料与方法
1.1　材料
三角叶滨藜播种于蛭石中 , 用Hoagland营养液培养 。在 2片真叶期对部分幼苗进行盐处理 , NaCl起
始浓度为 50 mmol·L-1 , 每隔 3 d提高 50mmol·L-1 , 直至 500mmol·L-1 。幼苗在500 mmol·L-1NaCl溶液
中生长一周。以仅用 Hoagland营养液培养的三角叶滨藜为对照 。
Trizol试剂为上海申能博彩公司产品;TakaRa RNA PCR kit (AMV)Ver 2.1 、 RNase H、 T4 RNA连接
酶 、 pMD18-T vector、 LA-Taq 、 LA PCR kit均为 TakaRa 公司产品。大肠杆菌 JM109由江苏省农业科学院
张保龙提供。
1.2　总 RNA和 DNA的抽提
取在 500mmol·L-1 NaCl溶液中生长一周的三角叶滨藜幼嫩展开叶 , 用Trizol法抽提总 RNA;取对照
幼嫩展开叶 , 用 CTAB法提取总DNA。电泳分析 RNA和 DNA质量。
1.3　RT-PCR
1.3.1 　RT-PCR 　以滨藜属植物山菠菜 BADH
cDNA保守区序列设计引物 P1和 P2 (所有引物
序列见表 1)。操作方法参照 TakaRa RNA PCR kit
(AMV)Ver 2.1。
1.3.2 　巢式 PCR 　以 RT-PCR的特异产物序列
设计三角叶滨藜BADH cDNA专一反向引物 P3和
P4 , 以滨藜属植物山菠菜和中亚滨藜 BADH
cDNA 5′保守区设计正向简并引物 P5。用随机寡
核酸引物反转录盐处理三角叶滨藜总 RNA , 以
P3和 P5引物进行第一轮 PCR。取 1 μL 第一轮
PCR产物为模板 , 用 P4和 P5引物进行第二轮
PCR。
1.3.3 　cRACE　参考李秋莉等[ 10]的方法 , 根据
已获得的三角叶滨藜部分 BADH cDNA的序列 ,
表 1　三角叶滨藜 BADH 基因克隆引物
Table 1　Primers for cloning BADH cDNA
from Atriplex triangularis
引物
Primers
5′※ 3′ 碱基对数
Base pairs
P1 TTG GAG CTT GGA GGT AAA AGT CCT 24
P2 GCA TGG TTG TGA GCA ATT AAC CAA A 25
P3 GAT AAC AGG ACC AAG TCG GCA 21
P4 TTG CAG CAG GAA TAT CAC CGA 21
P5 ATC GCA TWC CCA TCA TCA ACC 21
SRT-P (P)AAA CAG CTC CAA C 15
P6 TCT TAG CAG CAA TAG CAC GCA 21
P7 TTG CAG CAG GAA TAT CAC CGA 21
P8 CCA TGC AAA TAT GGA AAG AGG 21
P9 ATG TGA GAG GGT AAC TAA GGC 21
P10 TCA TCA CCA ACC CTT TAT TCA AT 23
在靠近 3′端一侧设计一条 5′末端磷酸化反转录引物SRT-P , 在 SRT-P 远端 , 设计两条反向嵌套 PCR引
物 P6和P7。在SRT-P 近端 , 设计两条正向嵌套PCR引物 P8和P9。以 RT-P反转录盐处理的三角叶滨藜
幼嫩展开叶总 RNA获得单链 cDNA , 再用 T4 RNA Ligase将单链 cDNA环化 。以环化的 cDNA为模板 , 用
P6和 P8进行第一轮 PCR。再以第一轮 PCR产物为模板 , 用 P7和 P9引物进行第二轮 PCR扩增 。
1.3.4 　3′-RACE　参考李秋莉等[ 11]的方法 , 以 oligo dT-adapter 引物反转录盐处理三角叶滨藜幼嫩叶总
RNA , 获第一链 cDNA。用 M4和 P8引物对第一链 cDNA进行第一轮 PCR。取 1 μL 做模板 , 用 P9和 M4
引物进行第二轮 PCR。
1.4　总 DNA的 PCR扩增
以P1和 P2引物进行三角叶滨藜总 DNA 的 PCR扩增[ 12] 。以引物 P8 和 P9以及山菠菜和中亚滨藜
BADH cDNA保守区序列设计的引物 P10 , 对三角叶滨藜总 DNA进行巢式 PCR。
1.5　克隆与测序
PCR产物用低溶点琼脂糖凝胶电泳纯化和回收目的扩增片段 。在 T4 DNA连接酶作用下 , 将回收的
DNA片段插入 pMD18-T 载体 , 构建重组质粒 , 转化感受态大肠杆菌 JM109。根据α互补原理 , 用酶切电
·16· 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 27 卷
泳法以及 PCR法筛选重组子 。DNA序列由上海申能博彩公司测定。
1.6　序列分析
用DNAtools和 DNAClub进行序列分析 , 并与 GenBank 数据库资料 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
作 cDNA核苷酸序列以及推测的氨基酸序列的同源性比较。
2 　结果与分析
2.1　三角叶滨藜 BADH基因的 cDNA克隆
用引物P1和 P2对三角叶滨藜的总 RNA进行 RT-PCR , 获得了约 600 bp的条带 。对 5个克隆进行测
序 , 其中 4个克隆相同 , 命名为 BADH3 , 另一个命名为 BADH5 , 核苷酸序列长皆为 585 bp (图 1)。
BADH3 和BADH5 核苷酸序列同源性为 81%。BADH3和 BADH5 核苷酸序列与山菠菜的同源性分别为 95%
和81%, 证明它们是三角叶滨藜 BADH 基因的一部分 , 且表明三角叶滨藜 BADH基因是一个多基因家族
成员 , 其至少存在 2个 BADH基因。这与在高粱[ 13] 、 红树[ 14] 、 猪苋菜[ 7]上的报道相一致。Weigel等[ 15]
认为 BADH有两种同工酶BADHⅠ和 BADHⅡ。可能在植物中有两种形式的BADH , 它们分别存在于叶绿
体和微粒体中。红树中两种 BADH基因的克隆及其表达研究有力地证明了他的观点[ 14] 。在三角叶滨藜
中是否存在定位于不同亚细胞的两种 BADH , 其表达水平是否不同 , 这还有待于对其进行全序列分析和
表达调控研究。
图 1　三角叶滨藜 BADH cDNA核苷酸序列和推测的氨基酸序列
Fig.1　Nucleotide sequences and deduced amino acid sequences for BADH cDNA from Atriplex triangularis
(注:上排核苷酸序列为 BADH3 的;下排核苷酸序列为BADH5的 , 其中星号指与 BADH3 一致的序列;氨基酸序列为BADH3开放阅读
·17·第 1期　　　　　　　何晓兰等:三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因的克隆及序列分析
框架所推测的序列 , 其上方黑体字为 BADH5 与 BADH3 推测的有差异的氨基酸残基;ATG和TAG分别为翻译起始密码子和翻译终止密码
子; AATAAA 为推测的多聚腺苷酸信号;阴影处为醛脱氢酶保守区。
Note:The upper numbered nucleotide sequence was that of BADH3;The lower nucleotide sequence was that of BADH5 , which the asterisk designated
residues identical in both sequences;The deduced amino acid sequence was for the open reading frame of BADH3 , the difference between this and the de-
duced amino acid sequence for BADH5was shown above in bold face;ATG and TAG were an initiation codon and a stop codon, repectively;AATAAA was
a polyadenylat ion signal;The shaded region was conserved among aldehyde dehydrogenases.)
2.2　三角叶滨藜 BADH3全长 cDNA的克隆
为了获得 BADH3的 5′端和 3′端序列数据 , 运用巢式 PCR、 cRACE[ 10]以及 3′-RACE[ 11]技术 , 分别获
得了 BADH3 5′端 834 bp 、 5′端 204 bp以及3′端 442 bp序列 (图2)。5′端 834 bp序列的3′端与长585 bp的
已知 BADH3序列重叠176 bp , 其 5′端与 5′端 204 bp序列重叠 64 bp。3′端 442 bp序列与长 585 bp的已知
BADH3 序列重叠 64 bp。证明通过巢式 PCR、 cRACE以及 3′-RACE所获得的 3个克隆均为 BADH3的一部
分。合并 cDNA长为 1 815 bp , 其 5′端有78 bp的前导序列区 , 79 ～ 81 bp为起始密码子 , 79 ～ 1 578 bp构
成一个完整的开放阅读框架 , 编码 500个氨基酸残基的蛋白质 (图 1), 推测的蛋白质相对分子质量为
54 700 , pI 为 5.5。接着是终止密码子 , 以及 234 bp的 3′端尾随序列区 , 该区含一个多聚腺苷酸信号
AATAAA , 位于 poly (A+)尾上游 111 bp处 。
图 2　以三角叶滨藜 cDNA为模板 , PCR扩增产物的琼脂糖电泳分析
Fig.2　Agarose gel electrophoretic analysis of PCR products from Atriplex triangularis cDNA
(M1.λDNA/ EcoRⅠ +HindⅢ marker;M2.GeneRulerTMDNA ladder mix;A.The first PCR amplifi cation products;B.The second PCR amplifi cation
products)
将全长BADH3推测的氨基酸序列于GenBank上分析 , 起始8个氨基酸残基中含有与菠菜 BADH完全
一致的七肽片段 Gln-Leu-Phe-Ile-Asp-Gly-Glu , 该七肽是胰蛋白酶消化完整 BADH 蛋白所产生 , 前后氨基
酸分别为Arg 和Gln 。起始7个氨基酸残基与菠菜相似 , 可能为一个不典型的转导肽Met-Ala-Phe-Pro-Met-
Pro-Val[ 5] , 表明 BADH3翻译的成熟蛋白质有可能定位于叶绿体中 。BADH3 推测的蛋白质序列在 257 ～
266亦包含一个十肽基序Val-Thr-Leu-Glu- Leu-Gly-Gly-Lys-Ser-Pro 以及与在 294位置酶功能有关的 Cys为
醛脱氢酶高度保守的序列 (图 1), 这些残基可能包含 NAD+结合位点以及酶催化位点[ 5 ,6 ,8] 。
2.3　三角叶滨藜 BADH基因 3′端部分序列的克隆
以三角叶滨藜总 DNA为模板 , 通过 PCR技术获得插入片段的核苷酸序列长分别为 1 195和 589 bp
的2个克隆 gBADH1和 gBADH2 。推测其编码区序列分别与 BADH5 和 BADH3完全一致 , 且在推测的内含
子插入位置和大小存在较大差异 (数据未显示)。同一段编码区 , 在 gBADH1 中处于 1 个外显子区域 ,
而在 gBADH2 中处于 2 个外显子区域。 其中 gBADH2 3′端存在 4 个 23 碱基正向重复序列
ATTGAATAAAGGGTTGGTTGATG , 每个重复序列内包含一个多聚腺苷酸信号AATAAA 。这 4个正向重复序
列的功能可能与 BADH mRNA转录终止调控信号有关。 gBADH1 和 gBADH2 的核苷酸序列存在较大差异 ,
亦进一步证明三角叶滨藜 BADH基因是一个多基因家族成员 。
·18· 　　　　　　　　　　　　　　南　京　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　第 27 卷
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责任编辑:沈　波
·19·第 1期　　　　　　　何晓兰等:三角叶滨藜甜菜碱醛脱氢酶 (BADH)基因的克隆及序列分析