全 文 ：风雨花甘露糖结合凝集素基因克隆与序列分析*
鲍锦库 吴传芳 安 洁 高 顺 赵 曦 常丽青
荣艳珍 王陈继 陈 放Δ
(四川大学 生命科学学院 ,成都 610064)
摘要 单子叶甘露糖结合凝集素具有抑制人类免疫缺陷病毒的活性。 风雨花 ( Zephy ranthes gr andiflo ra )球茎
中含有亚基分子量为 12 KD的甘露糖结合凝集素 ( ZGA)。运用同源克隆的方法设计简并引物 ,通过 3 和 5 RACE
技术 ,从风雨花总 RN A中克隆了编码此凝集素的全长 cDN A序列 ,其开放阅读框长 492 bp,编码 164个氨基酸 ,包
含信号肽序列、成熟蛋白序列和 C-末端剪切序列的前体蛋白。 成熟蛋白由 106个氨基酸残基组成 ,分子量为 11. 6
KD。 成熟蛋白在氨基酸水平上与石蒜凝集素、雪花莲凝集素、水仙凝集素和君子兰凝集素分别有 71. 8% 、 81% 、
81. 8%和 84. 5%的同源性 ;在 Blocks数据库中检索 ZGA蛋白氨基酸序列的结构域 ,发现有 3个凝集素功能结构
域 ,并具有 3个典型的甘露糖专一结合位点盒 ( QDNY)。
关键词 人类免疫缺陷病毒 甘露糖结合凝集素 风雨花凝集素 基因克隆 序列分析
Molecular Cloning and Analysis of a Monocot Mannose-binding Agglutinin
from Zephyranthes Grandiflora( Family Amaryllidaceae)
Bao Jinku Wu Chuanfang An Jie Gao Shun Zhao Xi Chang Liqing
Rong Yanzhen Wang Chenji Chen FangΔ
(Col lege of Li fe Science, Sichuan Universi ty , Chengdu 610064,China )
Abstract The monoco t mannose-binding lectin can inhibit HIV from infecting th e targ et cells. Th e tota l
RN A o f Zephy ranthes g r andiflo ra wa s ex trac ted and reversely tr anscribed into cDN A. Degenera te primers w ere
designed based on th e conserv ed r eg ions o f o ther monoco t manno se-binding agg lutinins by h omo lo gy alignment.
The 694bp full-leng th cDNA o f Zephy ranthes g r andiflo ra agglutinin ( ZGA ) was cloned by RT-PCR, 3 and
5 RACE ( r apid amplifica tion o f cDN A ends ). The star t codon and stop codon of ZGA were at 37-39bp and 529-
531bp respectiv ely. The N CBI Bla st analysis r esult showed that ZGA gene encoded a pro tein pr ecur so r with signa l
peptide , mature pro tein and C-te rminal cleavage sequence. The mature ZGA protein contained 106 amino acids
r esidues and its molecula r w eight was 11. 6KD. The per centag es o f identity of th e deduced mature ZGA pro tein
with tho se o f Galanthus niv alis agg lutinin, Narcissus h ybrid cultiv a r ag glutinin, Lycoris radia te agg lutinin and
Cliv ia minia ta agglutinin were 71. 8% , 81% , 81. 8% and 84. 5% , respectiv ely. Blo cks ana ly sis r ev ealed that ZGA
had th ree func tional domains and th ree manno se-binding boxes ( QDN Y) .
Key words HIV Monocot mannose-binding lectin Zephyr anth es g randiflor a agg lutinin ( ZGA)
Gene cloning Alignment ana ly sis
植物凝集素是一类非免疫来源的、具有可逆的
糖结合专一性 ,能促使细胞凝集的蛋白质或糖蛋
白 [1 ]。按分子进化和结构上的相关性可以将植物凝
集素分为几个家族 [ 2] ,它们是豆科植物凝集素超家
* 国家自然科学基金资助项目 ( 30000032)
Δ联系人。
族、包含有几个“ hevein”结构域的几丁质结合凝集
素、单子叶甘露糖结合凝集素、 II型核糖体失活蛋
白、木菠萝素相关凝集素、葫芦科和苋属小家族凝集
素。 其中单子叶甘露糖结合凝集素是来源于单子叶
植物的特异结合甘露糖的凝集素 ,通常由 2～ 4个
11～ 14 KD相同亚基组成二聚体或四聚体 ,每个亚
基包含有 3个甘露糖结合位点。单子叶甘露糖结合
生物医学工程学杂志
J Biomed Eng 2004; 21( 5)∶ 812～ 818
凝集素在石蒜科、鸢尾科、百合科、凤梨科、天南星
科、兰科、葱属等植物中广泛存在 [3 ] ,它们属于一个
在进化上相关的超家族 ,不仅序列上有很高的同源
性 ,分子模型的总体结构也极为相似。单子叶甘露糖
结合凝集素因为具有抑制人类逆转录病毒 (如人类
免疫缺陷病毒 HIV)的活性且对人类无害而引起人
们的重视。研究表明 ,在 HIV的感染中 ,病毒表面糖
蛋白 GP120的高甘露糖型糖链的正确糖基化是感
染所必需的。 目前以 GP120糖链为靶防御 HIV感
染的药物已成为治疗艾滋病的首选开发药物 ,如糖
基化抑制剂和结合糖链的化合物以及结合高甘露糖
型糖链的凝集素 [4, 5 ]。结合高甘露糖型糖链的凝集素
可以和 GP120的糖链相互作用 ,干扰病毒和靶细胞
的相互融合 ,从而达到降低感染的效果 [6 ]。目前已从
单子叶植物中分离到几种甘露糖结合凝集素 ,体外
实验表明具有良好的抗 HIV I /II的活性。如从兰科
植物中分离的凝集素 ,从石蒜科植物君子兰、水仙、、
雪花莲中分离的凝集素等 [7, 8 ]。显示了单子叶甘露糖
结合凝集素在抗 HIV感染中的应用潜力。
中草药风雨花 ( Zephyranthes g randif lo ra )属石
蒜科多年生草本植物 ,具清热解毒、消肿功效 ,用于
痈疽肿毒、跌伤红肿 ,毒蛇咬伤等。其地下球茎中含
有丰富的甘露糖结合凝集素。本文根据石蒜科植物
甘露糖结合凝集素的保守序列设计简并引物 ,从风
雨花球茎中克隆出风雨花甘露糖结合凝集素的全长
cDN A并对其进行分析。 为以后风雨花凝集素
( Zephy ranthes g randif lo ra agglutinin, ZGA )的性
质、结构与抗病毒活性以及利用基因重组技术进行
凝集素基因的表达等研究工作打下基础。
1 实验部分
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料、工程菌和克隆载体 采集风雨花
幼嫩球茎 ,在液氮中迅速冷冻保存 ;克隆用宿主菌为
大肠杆菌 DH5α,载体为 Taka ra公司 T /A克隆载
体。
1. 1. 2 试剂盒、工具酶和其它试剂 3 -RACE试
剂盒、 Taq酶、 Td T酶和 DNA Marker购自 Takara
公司 , 5 -RACE试剂盒购自 GIBCO公司 , 植物总
RNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自上海生物工
程公司。实验所用引物的合成以及克隆的测序均由
上海生物工程公司完成。风雨花甘露糖结合凝集素
基因克隆的引物序列如下:
3 RACE引物为
正向引物: 5’ -T TT /C ATC ATG CAA /G
GAA /G GAC TG-3
反向引物: 5 CTG TCT AAG GAC CGG ATC
C 3
反转录引物: 5 C TG TCT AAG GAC CGG
ATC C Oligo dT 3
5 RACE引物为:
正向引物: 5 T TC TGA TCT AGA GGT ACC
GGA TCC Oligo d T 3
反转录引物: 5 AAG CT T AGC CTC ACT
CGT CTC 3
反向引物: 5 GAC TCC AAC GAC GAT TCC
AGC TCC 3
1. 2 方法
1. 2. 1 风雨花总 RNA的提取 按照植物总 RNA
提取试剂盒的说明进行 ,总 RNA经 1%非变性琼脂
糖凝胶电泳分析其质量。
1. 2. 2 风雨花凝集素基因 3 端 cDN A片段的克隆
( 3 RACE) 按照 3 -RACE试剂盒 ( Taka ra )使用
说明进行操作 ,反转录条件为 30℃ 10 min, 50℃ 20
min, 95℃反应 5 min和 5℃ 5 min。反转录后对其进
行 3 -RACE分析 , PCR引物为简并引物 , PCR体系
各组分按 Taq酶的使用说明添加 , PCR条件为
94℃预变性 1 min, 94℃变性 30 s, 55℃退火 30 s,
72℃延伸 2 min, 30个循环。 PCR反应液经 1%琼脂
糖 ( 0. 5× TBE)凝胶电泳分离 ,用胶回收试剂盒回收
目的片段 ,回收的目的片段用 T /A克隆载体进行连
接转化大肠杆菌 DH5α,筛选阳性克隆并测序。
1. 2. 3 风雨花凝集素基因 5 端 cDN A片段的克隆
( 5 RACE) 5 RACE技术是在 3 RACE获得部分
cDN A序列后 ,设计特异性的引物用于 5 末端的扩
增。 用一个反向的特异性引物在反转录酶的作用下
反转录总 RNA得到第一链 cDN A,用 RNA酶去除
多余的 RNA后 ,再用脱氧核苷酸末端转移酶
( TdT)在 cDN A的 3 端进行同聚加尾反应 ,从而在
cDN A的 3 端加上特异性接头 ,参照 GIBCO公司
5 RACE试剂盒说明进行操作。 PCR条件及后续工
作同 3 RACE相同。
1. 2. 4 风雨花凝集素基因全长 cDN A的拼接及基
因和蛋白的序列分析 利用 VectN TI等软件对凝
集素基因的 3 末端和 5 末端序列结果进行拼接 ,
获得全长 cDN A,并对其进行开放阅读框 ( ORF)分
析。 运用 DNA Too ls5及网络资源进行基因和蛋白
813第 5期 鲍锦库等。 风雨花甘露糖结合凝集素基因克隆与序列分析
序列分析。
2 结果与讨论
2. 1 风雨花总 RNA的质量分析
由图 1看出 ,提取的风雨花总 RNA在凝胶上
没有 DNA和蛋白质的污染 , 28S核糖体 RNA与
18S核糖体 RNA的带型比较清晰 ,无拖尾现象 ,两
条带的亮度比基本呈现 2∶ 1的关系 ,说明 RNA完
整性比较好。
图 1 风雨花球茎总 RNA琼糖凝胶电泳图
Fig 1 Total RNA from bulb of Zephyranthes grandiflora
2. 2 简并 PCR引物的设计
为设计克隆风雨花凝集素所用的简并引物 ,我
们以雪花莲凝集素的蛋白序列为基准 ,通过 NCBI
中的 Blast比较 ,选取和风雨花亲缘关系相近的单
子叶植物雪花莲 [9 ]、水仙 ( GenBank AC: M 88118)、
玉帘 ( GenBank AC: AY099490)、君子兰 [10 ]、石蒜甘
露糖结合凝集素蛋白 [11 ]序列进行比对 ,发现该类凝
集素具有很高的同源性 ,有两处非常保守的区域 ,分
别在 46～ 57, 111～ 121位 (以 GNA为基准 ) ,适宜
设计引物 (见图 2a)。考虑到完全由氨基酸序列反推
设计的引物简并度太大 ,容易出现假阳性克隆 ,干扰
待克隆基因的分离效率。为了降低引物的简并度 ,我
们设计了猜测体引物 ,即根据特定物种当中某种已
知蛋白质的密码子使用频率 [12 ] ,同时采纳了根据猜
测最可能在目的基因中出现的密码子资料 ,选用含
密码子简并度最低的蛋白质区段进行合成。 因为风
雨花相近科属物种应该具有相似的密码子偏好。 将
这五种凝集素相应的核苷酸序列进行比对 ,发现在
这两个保守区域氨基酸对应的核苷酸序列有很高的
同源性 (见图 2b)。许多氨基酸都采用了相同的密码
子 ,故选取 46～ 57位氨基酸对应的核苷酸序列进行
引物设计 ,根据蛋白质和核苷酸序列的比较结果 ,设
计正向引物 5-T TT /C A TC ATG CAA /G GAA /G
GAC TG-3进行 3 RACE扩增。
( a)
814 生物 医学 工 程学 杂志 第 21卷
( b)
图 2 石蒜科五种已知的甘露糖结合凝集素的氨基酸序列 ( a)和保守区域的核苷酸序列 ( b)比较
Fig 2 Comparison of the amino-acid sequences ( a ) and conserved nucleotide sequences ( b ) of f ive mannose-binding agglutinins f rom
Amaryllidaceae
注: 图中加框部分为拟设计引物的区域 ( box: amino-acid sequence for p rimer d esig n) , GN A: 雪花莲凝集素 ( Galanth us nivalis agglu tinin ) ,
N HA: 水仙凝集素 ( Narcissus h ybrid cultivar agglutinin) , ZCA: 玉帘凝集素 ( Zephy ranthes candida agglutinin) , CM A: 君子兰凝集素 Cliva
miniat agglu tinin) , LRA:石蒜凝集素 ( Lycori s radiata agglu tinin )
2. 3 3 RACE扩增结果
利用 RT-PCR技术 ,获得一条约 500 bp的片
段 (见图 3) ,测序分析显示其与其它物种的凝集素
基因具有很高的同源性。
2. 4 5 RACE扩增结果及全长序列的获得
利用 3 序列测定结果设计引物用于 5 的扩
增 , 通过 5 RACE技术获得一条约 500 bp的片段
(见图 4) ,测序分析显示其与其它物种的凝集素基
因具有很高的相似性。利用 V ectN TI软件包对风雨
花凝集素基因的 3 末端和 5 末端序列进行拼接获
得一条 694 bp的完整 cDN A。全长 cDN A开放阅读
框长 492 bp, 编码 169个氨基酸 ,起始密码子位于
第 37～ 39 bp, 终止密码子位于 529～ 531 bp处。
图 3 3 RACE PCE产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 3 The result of 3 RACE PCR
M. DNA marker DL2000( bp ) ; 1, 2. The 3 RACE p rod uct of ZGA
图 4 5 RACE PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
Fig 4 The resul t of 5 RACE PCR
M. DN A marker DL2000( bp)
1, 2. The 5 RACE p roduct of ZGA
815第 5期 鲍锦库等。 风雨花甘露糖结合凝集素基因克隆与序列分析
表 1 风雨花凝集素 ( ZGA) cDNA编码蛋白质的氨基酸序列
Table 1 Amino acid sequence deduced f rom cDNA of Zephyranthes grandiflora agglutinin
注:箭头所示为引物的位置 ;加框的是启始密码子和终止密码子 ;横线表示加尾信号
Arrow: posi ti on of primer, box: s tart and s top codon , u nderline: putative polyaden ylation sig nals
2. 5 风雨花凝集素成熟蛋白序列的确定及氨基酸
序列的同源性分析
通过与 GenBank上其它物种凝集素基因的比
较 ,发现 ZGA基因编码一个包含信号肽、成熟蛋白
序列和 C-末端剪切序列的前体蛋白。N-端信号肽剪
切位点在第 24( S)和第 25个氨基酸 ( D)之间 ,这与
大多数单子叶甘露糖专一性结合凝集素相似 [3 ]。
ZGA蛋白的 C-末端肽剪切位点在 131位的 G和
132位的 T之间。 因此 ZGA的成熟蛋白为:
1 DN ILYSGET L STGESFN YGP Y TFIMQE-
DCN LV LYDVDKPI W ASN TGGLAR GCHLSM-
Q SDG
61 N LVVY TPSGN RAIWASN TQG ENGN-
YVCILQ KDRNVV IYGT ARW ATG
运用 DNA Too l5. 1计算 , ZGA由 106个氨基酸
残基组成 ,分子量为 11. 6 KD,等电点为 4. 45。 将
ZGA的成熟蛋白氨基酸序列同其它甘露糖结合凝
集素如雪花莲凝集素 ( GN A) [ 9]、君子兰凝集素
( CMA)
[10 ]、石蒜凝集素 [11 ]和水仙凝集素等进行比
较 ,结果表明:与雪花莲凝集素同源性为 81% ,与水
816 生物 医学 工 程学 杂志 第 21卷
仙凝集素的同源性为 81. 8% ,与石蒜凝集素同源性
为 71. 8% ,与君子兰凝集素的同源性为 84. 5% 。
2. 6 ZGA成熟蛋白序列中结构域的预测及专一性
结合糖基化位点盒分析
在 blocks数据库中 ( www . blocks. fhcro. o rg )
中检索 ZGA蛋白氨基酸序列的结构域 ,发现 ZGA
氨基酸序列中存在三个结构域区 (见图 5)。
图 5 风雨花凝集素氨基酸序列功能结构域
Fig 5 Amino acid sequence of functional domain of Zephyranthes grandif lora agglutinin
加框区 ( 1～ 26, 41～ 75, 80～ 99)为 ZGA中存在的 3个凝集素蛋白功能模块。 其中阴影区为非常保守的氨基酸残基 ,双划线部分表示比较保守
的氨基酸残基 ,单划线部分表示变异较大的氨基酸残基
Box: Functional domains Gray background: Very conserv ative amino acids Dual underline: Conservativ e amino acid Underline: Non identical
amino acid
通过对玉帘凝集素 ( ZCA)与雪花莲凝集素
( GN A)、水仙凝集素 ( N HA)、石蒜凝集素 ( LRA)和
君子兰凝集素 ( CMA)的分析 ,发现 ZGA同大多数
甘露糖专一结合的凝集素一样 ,具有 3个典型的甘
露糖专一结合位点盒 ( QDNY) [13 ] (见图 6) ,说明
ZGA是一种甘露糖专一性结合的凝集素。
图 6 风雨花甘露糖结合凝集素的甘露糖结合位点
Fig 6 Mannose-binding boxes(QDNY) of Zephyranthes grandif lora agglutinin
方框表示甘露糖结合位点盒 ( QDNY) ; Box: mannose-binding b ox es ( QDNY)
3 结 论
在克隆风雨花凝集素基因时采用同源克隆的方
法 ,通过简并引物的设计、 RT-PCR和 RACE技术 ,
克隆出 ZGA的全长 cDN A序列。序列分析表明
ZGA cDNA的全长序列由 694个核苷酸组成 ,编码
164个氨基酸的前体蛋白 ,编码产物包含 N-端 24
个氨基酸残基的信号肽序列 , C-端有 34个氨基酸残
基组成的剪切序列 ,成熟蛋白分子量为 11. 6KD。
ZGA的氨基酸序列与多种甘露糖结合凝集素序列
有较高的同源性 ,而且具有三个非常保守的甘露糖
结合位点盒 ( QDN Y)。 ZGA中存在的凝集素蛋白功
能模块与雪花莲凝集素 ( GN A )、水仙凝集素
( N HA)及君子兰凝集素 ( CMA)等单子叶甘露糖结
合凝集素相比 ,有 61. 7% ( 50 /81)的氨基酸高度保
守 ,有 17. 3% ( 14 /81)的氨基酸比较保守 ,因为蛋白
质结构上的同源性与它们的功能相关 ,显示这些位
点的保守性与它们相似的功能共性之间有密切的关
系。其中两个非常一致的区域 ,一个在 59～ 65区域 ,
完全一致的氨基酸序列为 DGN LVVY;另一个在
89 ～ 99区 域 , 完 全 一 致 的 氨 基 酸 序 列 为
LQKDRNVV IYG,这两个高度保守的区域恰好分
别具有一个甘露糖专一性结合位点盒 ,推测这两个
区域对于形成甘露糖结合的活性中心有重要作用。
随着我国加入 WTO,研究开发具有我国自主知识
产权的新型抗艾滋病药物显得尤为重要。本文报道
从风雨花中成功克隆甘露糖结合凝集素全长 cDN A
序列 ,分析结果表明它和具有抗艾滋病毒活性的甘
露糖结合凝集素具有高度同源性 ,特别是在甘露糖
结合位点高度保守 ,而这些位点是抑制病毒感染所
必需的 [2, 3, 6～ 8, 10 ] ,因此可以推测风雨花甘露糖结合
凝集素应具有抗艾滋病毒活性 ,这就为进一步研究
工作打下了基础。
817第 5期 鲍锦库等。 风雨花甘露糖结合凝集素基因克隆与序列分析
参 考 文 献
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