全 文 ：2012 年 月
第 卷 第 期
四川大学学报 自然科学版
一
重组风雨花凝集素在大肠杆菌中
表达条件的优化
张 帆 , 高 顺 , 温 馨 , 谢之易 , 鲍锦库
四川大学生命科学学院 , 成都
摘 要 为提高重组表达质粒 一 在大肠杆菌中的表达量 ,对表达重组风雨花凝集
素基因工程菌的培养条件进行优化筛选 ,对影响蛋白质表达量和工程菌生长的因素如 值 、
诱导温度 、 、接种量 、诱导时间 、补充碳源形式 、诱导时机 、无机离子等进行了探索 经过优
化 ,重组融合 目的蛋 白占菌体总蛋白的 ,比优化前提高了 条件优化后 ,
工程菌经过放大培养 ,获得 的湿菌体量 ,超声波破碎菌体 , 证
实重组融合蛋白以包涵体形式表达
关键词 风雨花凝集素 大肠杆菌 表达条件 重组蛋白 包涵体
中图分类号 文献标识码 文章编号 一 一 一
, 八 , , 一 , 一
, , ,
少
, , , ,
, , ,
、, 。 , , 才
,
。 , 。
夕 , ` , ,
,
引 言
植物凝集素是指一类含有一个或多个与单糖
或寡聚糖特异可逆结合的非催化结构域的非免疫
源性的蛋白 , 〕植物凝集素从进化和结构相关性
来分 ,可分成 个不同家族 豆科凝集素 单
子叶植物甘露糖结合凝集素 包含 结构
域的壳多糖结合蛋白 型核糖体失活蛋 白
葫芦科韧皮部凝集素 木菠萝凝集
素 家族 览属凝集素 〕
收稿日期 一 一
基金项目 国家自然科学基金
作者简介 张帆 一 ,男 ,四川巴中人 ,硕士研究生 ,研究方面为生物化学与分子生物学
通讯作者 鲍锦库 一
四川大学学报 自然科学版 第 卷
单子叶植物甘露糖结合凝集素是一类来源于
单子叶植物专一结合甘露糖的凝集素 自 年
第一个单子叶甘露糖结合凝集素从雪花莲中分离
纯化以来闭 ,证实单子叶植物甘露糖结合凝集素在
包括石蒜科 、天南星科 、葱科 、兰科 、百合科 、莺尾
科 、凤梨科和姜科等被子植物家族广泛存在 , ·叼
近年来 ,单子叶甘露糖结合凝集素因其抗逆转录酶
病毒活性 、抗 病毒和人类细胞巨化病毒
活性 〕而引起生物学家的广泛关注
风雨花 “ 属石蒜
科多年生草本植物 ,具有清热解毒 、消肿功效 ,用于
痈疽肿毒 、跌伤红肿 ,毒蛇咬伤等 其地下球茎中
含有丰富的甘露糖结合凝集素 风雨花凝集素 ,
夕 ,
序列分析表明风雨花凝集素基因编码
个氨基酸的前体蛋白 包含 个氨基酸的信号肤
序列 、 个氨基酸成熟蛋白序列和 个氨基酸
的 一末端剪切序列 成熟蛋白由 个氨基
酸残基组成 ,分子量为 本文在克隆
基因基础上进行风雨花凝集素在 。。 中
表达条件的优化 ,为进一步探索其高密度高表达发
酵工艺奠定理论基础 ,同时为制备具有生物学活性
的重组风雨花凝集素及研究其结构与功能奠定基
础
材料与方法
材 料
菌株和质拉 。 购自
公司 ,基因型 帆 、
一 基 因 原 核表 达 质粒
购 自 公司 由地奥集团基
因工程药物研究室提供 含重组表达质粒
的工程菌在成都地奥集团基因工
程药物研究室构建并保存
培养基 液体培养基 ,含
, , 固体培养
基 ,在上述配方加人 的琼脂
试 剂和仪 器 , 均
购自英国 公司 , 购自 公司 ,其
它试剂为国产分析纯 一 全温振荡器 哈尔
滨东 联 电子技术 开发 有 限公 司 ,
, 一 扫描仪 一 , 核
酸和蛋白质分析仪 , 分光光度计
上海第三分析仪器厂
方 法
种子液制备 甘油菌解冻后划线接种于
含 拜 琼脂平皿中 , 培养过
夜 次日从平皿中挑选单菌落接种于 中 ,
, 培养 ,然后按 比例扩
种到 培养基中 , , 培养
至对数生长期 , ℃保存
摇瓶发酵培养 将培养好的种子液按
比例接种于培养基中 三角瓶加人
培养基及 拼 , ,
培养至密度 。。 时 ,加人 ,
使其终浓度为 ,继续培养 ,培养结束
测定 。值及重组蛋白的表达量
菌种的保存 取 重组工程菌 ,加
人终体积为 的灭菌甘油 ,混匀 ,分别装
人两个 管中 ,分别保存于一 ℃和一
℃,待用
菌体密度测定 用 分光光度计在波长
处比浊法测定菌液密度
表达量的测定 收集 菌体处理后 ,
进行 一 分离胶质量分数为 ,浓缩
胶质量分数为 ,凝胶用 一 一 扫
描并分析重组蛋白的表达量
表达条件的优化 对影响细菌生长和蛋白
表达的 值 、诱导温度 、 、接种量 、诱导时
间 、补充碳源形式 、诱导时机 、无机离子 、
十和 才 等因素进行了探索
结果与分析
培养基 值对细菌生长及表达的影响
对重组风雨花凝集素而言 ,随着初始 值的
升高 ,表达量先升高后降低 ,最高表达量为
而 值逐渐下降 图 ,最适培养 值为
外源基因表达过程中 ,培养基 值影响培养基中
某些营养物质及中间代谢产物的解离 、底物分子的
带电状况 ,从而进一步影响细胞内酶的合成和活
性 ,使细胞代谢和细胞透性发生变化 ,因此 , 影
响菌体对营养物质的吸收和利用 。 〕`大肠杆菌的
最适 为 一 ,降低 虽然减慢了比生长
速率 ,但可以减少杂蛋白的干扰 ,从而提高包涵体
中目标蛋白的产量 薛冲等 〕曾观察到 值对
一工程菌生长表达均有影响 另外 ,吴军等 〔`, 〕观
察到 值对 一 工程菌生长影响不大 ,但对表
达影响很大 ,诱导表达时 一 最高 ,其原
第 期 张帆等 重组风雨花凝集紊在大肠杆菌中表达条件的优化
因可能是高 值下乙酸对基因表达的抑制作用
降低
温度对细菌生长及表达的影响 在最适
值条件确定的情况下 ,选择 ℃、 ℃、 ℃、
℃和 ℃ 个不同的培养温度来进行试验 ,结果
表明在 ℃培养时重组蛋白表达量最高为
图
基因在高效转录和翻译时需要大量能量 ,及时给予
充足的供氧量对目标产物的高效表达有重要作用
通气量对微生物的代谢及蛋白表达非常重要 ,控制
培养基的装量 ,瓶口的封闭程度和摇瓶转速可实现
通气条件的优化
划
印山生︵李︶邵酬唱泪皿阳
划
,,上月
打炭厂芯广卞甲茹书 “
装液量
司卜蛋白质表达量 吞 值
︵承︶啊邵鸽扭目月
山 茹一一一飞 “
值
一` 蛋白质表达量 值
图 装液童对细菌生长及表达的影响
图 值对细菌生长及表达的影响
︵享︶酬扭月琳唱阳
浓度
互“
八︸弓臼`
犯︵享︶训很唱刃阳月
一` 蛋白质表达量 值
测
舀八,州立,
卜艺污
温度 ℃
尸`蛋白质表达量 值
图 培养温度对细菌生长及表达的影响
图 工 浓度对细菌生长及表达的影响
装液且对细菌生长及表达的影响
摇瓶以 层纱布封口 ,分别采用摇瓶装液量为
、 、 和 写摇瓶培养 结果表明 ,装液
量为 时 ,可获得较高的菌体生物量和重组蛋
白总量 图 ,此时表达量为 装液量与摇
瓶中的溶氧及营养物质的量有关山〕溶氧是细菌
生长及产物形成重要的因素 由于氧在水中的溶解
度很小 ,因此氧往往成为发酵过程的限制性因素
装液量过大 ,进人摇瓶中的空气量就少 ,在细菌进
入对数生长期后 ,易造成溶氧恶化 装液量过少 ,营
养物质的量不足 ,会减少 目标蛋白的表达量 外源
对细菌生长及表达的影响
实验过程中 个不同 浓度 , 结果表明
当 浓度为 重组蛋白的表达量
最高 ,为 重组表达菌的生长与重组产物的
表达水平之间在一定范围内存在着一定的关联性 ,
这种相关关系依赖于培养基组成 、培养温度 、菌体
活力 、 诱导的浓度和表达时间等因素 在
培养基培养条件下 , 重组表达菌的表达水平和诱
导剂 之 间在一定范 围内存 在 着线性关
系 `」
接种蚤对细菌生长及表达的影响
对重组 工程菌而言 ,接种量为 时有
较高的表达量为 ,但是此时菌体的总量较
四川大学学报 自然科学版 第 卷
到
低 见图 提高诱导初期菌体的生物量可以提高
目的蛋白的产量 ,但过高的菌体浓度反而会因为营
养消耗太快或通氧量的不足而降低蛋白产量 通过
研究不同接种量对蛋白产生的影响发现 ,接种量并
非越大越好 ,由于摇瓶的装液量是一定的 ,其中的
营养物质和供氧量也是一定的 ,接种量太大 ,虽然
在生长初期 ,菌体生长繁殖速度快 ,但到了诱导阶
段 ,由于营养物质和供氧量的限制 ,导致 目标蛋白
的表达量降低
︵享︶嚼粥妈月扭洲
扩 沪护 `添加物
蛋白质表达量 值
叶仪丫了拼丫 、
图 碳 源形 式对细菌生长及表达 的影 响
划口
︸匀乌` 曰
接种量
蛋白质表达量 值
图 接种量时细菌生长及表达的影响
翅自
一匕
︵乐︶喇粥妈泪扭囚
︵李︶咽耀唱双皿幽
补充碳源形式对细菌生长及表达的影响
研究表明 ,含重组质粒 一 转化菌培养
时 ,培养基中加人 的葡萄糖 , 能抑制乳糖操
纵子的开放达到抑制 目的蛋白的提前表达 , 促进
重组质粒大量复制 〕,对随后诱导 目的蛋白高效
表达有益 补充三种不同形式碳源的对比发现 图
,孚糖和葡萄糖的添加对重组蛋白的表达量没有
大的影响 另外 ,添加物对重组工程菌生长有一定
的抑制作用
诱导时机对细菌生长及表达的影响
如图 所示 ,重组工程菌初始诱导 。。分别
为 。 、 、 、 诱导时 ,随着初始诱导 值
逐渐升高 ,蛋白质表达量逐渐降低 ,从 值 。
时的 降低到 值为 时的 但
菌体密度不断升高 原因可能是由于诱导前菌体密
度太高 ,细胞分泌的代谢物抑制了 目的蛋白的表
达 初始诱导 。。低于 , 目的蛋白表达量高 ,
但菌体太少 故选择 值 为最佳诱导时机
无机离子对细菌生长及表达的影响
由图 , 和 可知 ,添加过高浓度的 、
和 、 对重组工程菌的蛋白表达量有不
同程度的抑制作用 但是随着 、 “ 和 才
诱导 值
`, 蛋白质表达量 值
图 诱导时机对细菌生长及表达的影响
恻自
︵享︶咽粥妈泪扭洲
钙离子浓度 一几
去 蛋白质表达量 值
图 离子对细菌生长及表达的影响
浓度的增加 ,工程菌 值持续增加 对重组风雨
花凝集素而言 , 的合适添加量为 ,
此时表达量为 的合适 添加量为
,此时表达量为 才的合适添
加量为 ,此时表达量最高可占菌体总
第 期 张帆等 重组风雨花投集素在大肠杆菌中表达条件的优化
恻
︵承︶释唱扭渐间泪
蛋白的 “
到自升六一叨 丫一一咭 “
时间
蛋白质表达量 值
︵瞬︶蜘邵唱姐月洲
钙离子浓度 比
一` 蛋白质表达量 值
图 乙十离子对细 菌生长及表 达的影响
扩
图 诱导时间对细菌生长及表达的影响
贯盗寥麟一巍一阶一
切
划
︵东︶嘲释唱皿洲泪
按离子浓度 几
蛋白质表达量 备 值
图 才离子对细菌生长及表达的影响
图 表达条件的优化电泳结果
, 却
呀
。 才
〕
感口加 口曰 口日 口
诱导时间对细菌生长及表达的影响
在其它培养条件已确定的情况下 , 重组工程
菌在加人诱导剂后 、 、 、 、 分别取样进行
分析 结果表明 ,加人诱导剂 后重
组蛋白的表达量达 ,说明重组 工程菌
最适诱导时间为 图
表达条件的优化结果
将上述培养和诱导优化的条件扩大到 摇
瓶培养 ,培养条件如下 培养基 值 ,温度
,装液量 , 浓度 ,接种
量 ,诱导时机 。。 , , 和 浓度
, 才浓度 ,诱导时间 ,添
加物 甘油 ,培养结束后离心收集菌体可得
的湿菌体量 ,重组蛋白的表达量达 ,比
优化前提高了 图 超声波破碎菌体 ,
证实重组融合蛋白以包涵体形式表达
图
簧鬓
一 了叻解 麟 装 绷麟蘸 鬃
一一一朽
图 重组工程菌破菌的电泳结果
亡
, ,
,
讨 论
风雨花凝集素序列中仅仅含有三个半胧氨酸 ,
形成一对二硫键 ,蛋白比较简单 ,翻译后无糖基化
修饰 ,因此克服了进人体内后被迅速降解的特点 ,
为进一步与硫氧还蛋 白基因融合表达提供有力的
条件 外源基因在大肠杆菌中的高水平表达不仅决
定于基因 、载体和宿主三者之间的相互关系 ,而且
受到培养基 值 、诱导温度 、重组表达菌的生长
四川大学学报 自然科学版 第 卷
状态 、接种量 、补充碳源形式 、诱导时机 、细菌密度 、
诱导物的浓度 、诱导时间和无机离子等因素的影
响
环境因素对菌体生长及目的蛋白的表达的影
响很大 ,特别是培养环境的 及温度 李会成 〔` 〕
等认为 ,基因工程菌的细胞生长的最佳 为
,基因表达的最佳 为 而本实
验结果与其不同 ,可能是不同宿主要求不同的
范围 影响真核蛋白在原核细胞中高水平表达的因
素很多 ,本文尝试低温和低 浓度诱导 ,没有
成功获得融合 目的蛋白的可溶表达 因此 ,下游的
纯化将通过包涵体的变复性来进行重组蛋白的分
离纯化 另外 ,工程菌培养过程中所需的无机盐主
要是磷酸盐 、 、 、 和一些微量元素 ,作用是
提供菌体生长所需的各种元素 〕在体外翻译体
系中含有适量的 犷 、 、 才等离子可以显
著降低蛋白质合成中的错读 〕实验证明 ,添加适
量的 、 、 才等离子有利于重组
的表达
影响外源基因在 。 中表达的因素很多 ,
并且各因素之间有较大的相关性 ,综合分析各种影
响风雨花凝集素在大肠杆菌中表达的因素将更具
理论和实践意义 本文通过优化培养和诱导条件 ,
确定了 重组工程菌合适的培养和诱导条件 ,
为进一步探索其高密度高表达发酵工艺奠定了理
论基础 ,同时也为进一步制备具有生物学活性的重
组风雨花凝集素 ,研究其结构与功能奠定基础
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