全 文 ：苦杏仁中黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2的
液质联用检测分析
郑润生，徐晖* ，王文丽，詹若挺，陈蔚文
(广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室，广东 广州 510006)
［摘要］ 基质效应是影响液质联用定量准确性的一个重要因素，在方法学评价阶段中必不可少。该研究采用稀释法，并
通过优化色谱和质谱条件，成功克服苦杏仁的基质效应对整个分析过程的干扰，建立了一种可对苦杏仁污染黄曲霉毒素 B1，
B2，G1，G2进行大量筛查及检测的液质联用方法，与 Mycosep226 净化柱纯化的方法相比，具有回收率高、经济、简便的特点;对
11 批样品进行检测发现有 2 批样品的黄曲霉毒素检测结果呈阳性，其中黄曲霉毒素 B1的污染水平为 1. 590 ～ 2. 340 μg·
kg －1，黄曲霉毒素总量(B1 + B2 + G1 + G2)的污染水平为 2. 340 ～ 3. 304 μg·kg
－1，表明苦杏仁污染黄曲霉毒素这一现象应当
引起重视，并且有必要对其贮藏方式进行考察，以减少黄曲霉毒素的污染。
［关键词］ 液质联用技术;中药饮片;苦杏仁;黄曲霉毒素;真菌毒素
［收稿日期］ 2013-05-13
［基金项目］ 中央财政支持地方高校发展专项资金项目(粤财教
［2010］358 号)
［通信作者］ * 徐晖，研究员，主要研究方向为中药质量评价新方
法，Tel:(020)39358331，E-mail:zyfxsherry@ gzucm. edu. cn
［作者简介］ 郑润生，硕士研究生，E-mail:zhengrunsheng17 @
126. com
黄曲霉毒素(aflatoxins，简称 AFs)是由黄曲霉、
寄生曲霉等产生的有毒次生代谢产物，主要包括黄
曲霉毒素 B1(AFB1) ，B2(AFB2) ，G1(AFG1) ，G2
(AFG2) ，具有严重的致癌、致畸、致突变等作用，危
害巨大，其中 AFB1在 1993 年被世界卫生组织癌症
研究机构(IAＲC)划定为Ⅰ类致癌物［1-2］。对此，
《中国药典》2010 年版一部收录了桃仁、胖大海等五
味中药中 AFB1，AFB2，AFG1，AFG2的高效液相色谱
荧光检测方法［3］，并规定 AFB1最高限量为 5 μg·
kg －1，AF(B1 + B2 + G1 + G2)最高限量为 10 μg·
kg －1，但并未对苦杏仁等其他易霉变的药材制订相
关的限量标准。
苦杏仁 Semen Armeniacae Amarum 为蔷薇科植
物山杏、西伯利亚杏、东北杏或杏的干燥成熟种子，
具有降气止咳平喘，润肠通便等功效［4］。与桃仁相
似，苦杏仁富含淀粉、油脂类等成分，易因贮藏、处理
等过程中的操作不当而引发霉变，进而污染真菌毒
素。本课题组前期也发现苦杏仁极易发生霉变，且
污染 AFB1的几率远高于其他中药材
［5-6］。因此，为
了保障患者的健康，推动中国药典对苦杏仁进行相
关限量标准的规定，有必要对其污染黄曲霉毒素的
情况进行进一步的调查研究。
液质联用技术(LC-MS /MS)具有选择性高、灵
敏度好、多组分同时检测等优点，近年来被广泛用于
真菌毒素的研究，在中药真菌毒素检测方面显示了
很好的应用前景［7-9］。由于中药成分复杂，产生的基
质效应成为影响 LC-MS /MS法检测准确度的主要因
素，目前国内对中药材真菌毒素的 LC-MS /MS 检测
多侧重于采用免疫亲和柱或多功能净化柱的方法进
行样品纯化，但其纯化效果容易受样品基质、pH、溶
剂、盐浓度等的影响，同时各种纯化柱的价格昂贵，
无法重复使用，检测成本高［10］，无法满足对大量药
材进行筛查的需求。
本研究旨在采用稀释法，并通过优化色谱和质
谱条件，从而达到减少基质效应影响的目的，建立一
套不需经过复杂、昂贵的纯化步骤即可对苦杏仁污
染的 AFB1，B2，G1，G2同时进行定性定量检测的 LC-
MS /MS方法，实现其经济、快速、高通量的筛查，为
进一步完善中药的安全性评估提供参考。
1 材料
TSQ Quantum Access 液相色谱-串联三重四级
杆质谱仪，带 Xcalibur 2. 0 操作软件(美国，Ther-
mo) ;氮吹仪(美国，caliper) ;台式冷冻离心机(德
国，Sartorius) ;VXＲ 涡旋振荡器，带 VX8 配件(德
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国，IKA) ;pH计(美国，Thermo) ;1 /1 万电子分析天
平(德国，Sartorius)。
黄曲霉毒素混合对照品溶液，含 AFB1 1. 039 mg
·L －1，AFB2 0. 314 0 mg·L
－1，AFG1 1. 056 mg·
L －1，AFG2 0. 288 0 mg·L
－1(批号 LB96951) ，购自
美国 SUPELCO 公司。甲醇、乙腈(色谱纯，德国，
Merck) ;醋酸铵、甲酸(色谱纯，美国，DikmaPure) ;
真菌毒素多功能净化柱 Mycosep226(美国，Ｒomer) ;
实验所用超纯水由 Millipore Q 纯净水设备(法国，
Millipore)制得。
11 份苦杏仁样品各 100 g，分别购自广州地区
的药店、药材市场和医院，经广州中医药大学中药资
源科学与工程研究中心詹若挺研究员鉴定为正品，
样品购买后置密封袋中独立包装，于真空干燥器中
保存备用。
2 方法
2. 1 色谱条件 色谱柱为 Hypersil GOLD C18柱
(2. 1 mm ×100 mm，3 μm) (美国，Thermo) ;流动相
A-甲醇，B-4. 0 mmol·L －1醋酸铵-0. 1%甲酸水溶液
(pH 3. 0) ;梯度洗脱(0 ～ 5 min，20% A;5 ～ 20 min，
20% ～80% A)。流速 0. 3 mL·min －1;柱温 30 ℃;
样品温度 4 ℃;进样体积 10 μL。
2. 2 质谱条件 离子源为电喷雾离子化源(ESI) ;
喷雾电压 3 500 V(+) ;鞘气、辅助气压力均为 690
kPa(N2) ，流速分别为 13. 3 L· min
－1 和 5 L·
min －1;离子传输毛细管温度 350 ℃;选择反应监测
模式(SＲM)检测，并采用切换阀保护质谱，0 ～ 10
min洗脱液切换至废液。4 种黄曲霉毒素 SＲM检测
的相关质谱参数见表 1。
表 1 4 种黄曲霉毒素的质谱参数
Table 1 ESI-MS /MS parameters of four aflatoxins
黄曲霉
毒素
母离子
定量
子离子
碰撞能量
/ eV
定性
子离子
碰撞能量
/ eV
离子化
方式
AFB1 313 285 37 241 23 ESI +
AFB2 315 287 31 259 27 ESI +
AFG1 329 243 27 214 30 ESI +
AFG2 331 313 28 245 30 ESI +
2. 3 供试品溶液的制备 取样品粉末(过 3 号筛)
2. 0 g，精密称定，置于 50 mL离心管中，精密加入 10
mL 84%乙腈，浸泡 20 min 后 500 r·min －1涡旋 10
min混匀，然后在 1 500 r·min －1转速下提取 60 min，
样品于 4 ℃，5 000 r·min －1下离心 5 min，再取 250
μL上清液氮气吹干(室温) ，残渣精密加入1 mL甲醇
溶解，最后用 0. 22 μm微孔滤膜过滤，备用。
3 结果与分析
3. 1 专属性试验 分别取苦杏仁的阴性样品溶液、
四种黄曲霉毒素的标准品溶液和阳性样品溶液，按
2. 1 项下方法进行检测，记录色谱图，结果见图 1。
由图中可知，AFG2，G1，B2，B1的保留时间分别为
14. 23，15. 11，15. 91，16. 62 min，阴性样品在各化合
物的 ＲT未见干扰。
a. 阴性样品;b. 对照品溶液(其中 AFB1，B2，G1，G2质量浓度分别为 4. 16，1. 26，4. 22，1. 15 μg·L －1) ;c. 阳性样品(左右两边分别为定量离子
与定性离子色谱图)。
图 1 4 种黄曲霉毒素的 SＲM图谱
Fig. 1 SＲM chromatograms of the negative sample (a) ，aflatoxin standards (b)and the positive sample (c)
3. 2 线性关系考察 取黄曲霉毒素对照品溶液，用
色谱甲醇以 25，50，125，250，1 250，2 500，12 500，
25 000，125 000 倍稀释，按上述色谱、质谱条件进样
分析，以进样浓度为横坐标(X) ，峰面积为纵坐标
(Y) ，权重 W = 1 /X2，使用 Xcalibur 2. 0 计算线性方
程。结果见表 2，可见 4 种黄曲霉毒素在各自浓度
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范围内具有良好的线性关系。
表 2 线性范围、检测限(LOD)和定量限(LOQ)
Table 2 Concentration ranges，linearity(r) ，LOD and LOQ of
four aflatoxins
黄曲霉
毒素
线性范围
/ng·L －1
线性方程 r
LOD
/ng·L －1
LOQ
/ng·L －1
AFB1 20. 80 ～4 156 Y = －1 061. 98 +359 698X 0. 999 0 5. 200 10. 40
AFB2 12. 60 ～1 256 Y = －1 064. 09 +262 570X 0. 997 4 6. 300 12. 60
AFG1 21. 10 ～4 224 Y = －1 444. 86 +197 337X 0. 995 6 5. 280 10. 56
AFG2 23. 00 ～1 152 Y = －1 726. 89 +159 835X 0. 995 5 5. 800 11. 50
3. 3 检测限(LOD)及定量限(LOQ) 取梯度稀释
的对照品溶液，按上述色谱质谱条件注入液质联用
仪进行分析，以 3 /1 和 10 /1 的信噪比分别测得四种
黄曲霉毒素的 LOD和 LOQ，结果见表 2。
3. 4 日内、日间精密度试验 平行取苦杏仁(未污
染)粉末 3 份，每份 2. 0 g，按 2. 3 项下方法制备供试
品溶液，添加特定浓度的对照品溶液，配制成低、中、
高 3 个浓度水平的加标溶液(AFB1，B2，G1，G2的质
量浓度依次为 0. 416，0. 126，0. 422，0. 115;4. 16，
1. 26，4. 22，1. 15;12. 48，3. 78，12. 66，3. 45 μg·
L －1) ，每个浓度各 3 份，每份样品重复测定 2 次，连
续测定 3 d，根据峰面积结果进行方差分析，计算方
法的日内精密度和日间精密度。结果显示 4 种黄曲
霉毒素 3 个浓度水平的日内精密度 ＲSD为 1. 6% ～
6. 8%，日间精密度 ＲSD为 2. 3% ～6. 6%，表明仪器
的精密度良好。
3. 5 重复性试验 平行取苦杏仁(未污染)粉末 9
份，每份 2. 0 g，按照低、中、高 3 个浓度水平(AFB1，
B2，G1，G2的具体浓度与 3. 4 项一致，相当于生药质
量浓度依次为 8. 320，2. 520，8. 440，2. 300;83. 20，
25. 20，84. 40，23. 00;249. 6，75. 60，253. 2，69. 00 μg
·kg －1)添加黄曲霉毒素对照品溶液，待溶剂挥干
后，按 2. 3 项下方法制备供试品溶液，进样分析，根
据各浓度峰面积的方差分析，计算方法的重复性。
结果见表 4，可知 4 种黄曲霉毒素在 3 个浓度水平
的重复性 ＲSD为 2. 2% ～8. 6%，表明方法的重复性
良好。
3. 6 基质效应考察 按 3. 4 项下方法配制的低、
中、高 3 个浓度的加标溶液，各 3 份;再用色谱甲醇
配制相同浓度的对照品溶液，每个浓度各 3 份，进样
分析，按照以下公式［11］计算 2 组峰面积的比值，考
察苦杏仁的基质效应，结果见表 3，表明基质效应的
影响可忽略不计。
基质效应(ME)= 加标溶液测得的峰面积
对照品溶液测得的峰面积
× 100%
表 3 基质效应考察
Table 3 The investigation of matrix effect in Armeniacae Semen
Amarum
黄曲霉毒素 低 中 高
AFB1 95. 54 99. 00 90. 71
AFB2 95. 77 99. 30 91. 93
AFG1 94. 41 99. 22 93. 44
AFG2 90. 98 97. 70 98. 33
3. 7 回收率试验 平行取苦杏仁(未污染)粉末 12
份，每份 2. 0 g，其中 3 份作为空白对照，另外 9 份按
3. 5 项下方法制备得低、中、高 3 个浓度的溶液，每
个浓度各 3 份，进样分析，峰面积记为 A;另外取苦
杏仁(未污染)粉末 3 份，每份 2. 0 g，按 3. 4 项下方
法配制成低、中、高 3 个浓度的加标溶液，每个浓度
各 3 份，进样分析，峰面积记为 B;再用色谱甲醇配
制相同浓度的标准品溶液，每个浓度各 3 份，进样分
析，峰面积记为 C;按照以下公式［11］计算提取回收
率 ＲE与绝对回收率 ＲA，结果见表 4。
ＲE = A /B × 100%;
ＲA = A /C × 100%
表 4 苦杏仁中黄曲霉素 B1，B2，G1，G2 回收率(n = 3)
Table 4 Extraction recovery (ＲE)and apparent recovery (ＲA)
of four aflatoxins in Armeniacae Semen Amarum (n = 3)
黄曲霉毒素
添加水平
/μg·kg －1
ＲE1)
/%
ＲA1)
/%
ＲSD
/%
AFB1 8． 320 97． 32 /81． 78 101． 7 /83． 74 3． 2
83． 20 96． 11 /88． 38 97． 07 /86． 80 3． 1
249． 6 97． 05 /95． 25 88． 04 /82． 25 2． 3
AFB2 2． 520 98． 71 /86． 46 102． 9 /87． 34 7． 4
25． 20 96． 33 /88． 10 97． 00 /86． 93 4． 4
75． 60 96． 02 /90． 91 87． 88 /82． 11 2． 2
AFG1 8． 440 97． 31 /85． 95 102． 8 /92． 64 4． 4
84． 40 98． 96 /90． 10 99． 73 /90． 64 3． 8
253． 2 97． 01 /96． 16 90． 41 /85． 57 3． 7
AFG2 2． 300 97． 00 /103． 6 95． 47 /103． 9 8． 6
23． 00 97． 27 /94． 87 99． 60 /86． 67 4． 8
69． 00 94． 81 /90． 87 93． 23 /85． 99 3． 4
注:1)不纯化 /Mycosep226 纯化。
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3. 8 方法比较 平行取苦杏仁(未污染)粉末 12
份，每份 2. 0 g，其中 3 份作为空白对照，另外 9 份按
3. 5 项下方法制备后，取 6 mL上清液放入玻璃试管
内，Mycosep226 柱进行纯化［7］(具体操作参照厂家
说明) ，再取 250 μL 洗脱液氮气吹干，定容，得低、
中、高 3 个浓度的溶液，每个浓度各 3 份;另外取苦
杏仁(未污染)粉末 3 份，每份 2. 0 g，按 2. 3 项下方
法制备，取 6. 0 mL 上清液放入玻璃试管内，My-
cosep226 柱进行纯化(具体操作参照厂家说明) ，再
取 250 μL洗脱液氮气吹干，按 3. 4 项下方法配制成
低、中、高 3 个浓度的加标溶液，每个浓度各 3 份;再
用色谱甲醇配制相同浓度的标准品溶液，每个浓度
各 3 份;进样分析，分别计算 3 组样品的峰面积，按
照 3. 7 项下公式计算本方法的 ＲE与 ＲA，并与 3. 7
项下的结果进行比较，分析 2 种方法的差异。结果
如表 4，可见回收率不纯化 ＞回收率Mycosep226纯化，表明本
研究建立的方法回收率更高，损失率更低。
3. 9 样品测定结果 分别取收集自广州地区的药
店、药材市场和医院的 11 批苦杏仁药材样品各 2
份，每份 2. 0 g，按前述方法进行样品制备和分析，结
果见表 5。
表 5 11 批苦杏仁中黄曲霉毒素的检测结果
Table 5 Contamination levels of four aflatoxins in 11 samples of
Armeniacae Semen Amarum μg·kg －1
来源 AFB1 AFB2 AFG1 AFG2
药店 1 2. 340 － － －
药店 2 － － － －
药店 3 － － － －
药店 4 － － － －
市场 1 － － － －
市场 2 － － － －
市场 3 － － － －
市场 4 － － － －
医院 1 1. 590 0. 310 1. 440 －
医院 2 － － － －
医院 3 － － － －
4 讨论
基质效应是由于样品共流组分对目标化合物离
子化效率的影响而引起的，是导致 LC-MS /MS 定量
的不准确的主要影响因素［12］。因此，基质效应的评
价在方法学验证阶段尤为重要。减少基质效应主要
有以下方法［12］:优化样品前处理技术，比如各种净
化柱纯化;稀释样品，降低干扰成分浓度;优化提取
溶剂、定容溶剂，提高质谱对目标物的响应;提高色
谱分离度，减少共流组分的影响等方法。但目前国
内报道的中药材中真菌毒素的 LC-MS /MS检测多侧
重于样品的前处理技术这一方面，即采用免疫亲和
柱或多功能净化柱纯化样品，然而这些方法操作较
繁琐，检测成本高，严重限制 LC-MS /MS方法的大范
围应用。
因此，本研究根据上述减少基质效应的方法，采
用稀释法，比较并优化了各种流动相(0. 1%甲酸水
溶液与甲醇、4. 0 mmol·L －1醋酸铵-0. 1%甲酸水溶
液与甲醇、4. 0 mmol·L －1醋酸铵-0. 2%甲酸水溶液
与甲醇)、洗脱梯度、定容溶剂(流动相、甲醇)等条
件，从而提高黄曲霉毒素的响应。最终采用提取后
添加法［11］对苦杏仁在低、中、高 3 个浓度点进行了
基质效应考察，实验结果表明，本研究的方法已成功
克服基质效应对整个 LC-MS /MS定量分析过程的影
响，从而可用于苦杏仁中 AFB1，B2，G1，G2快速、准
确的检测。
同时，通过比较本方法与 Mycosep226 净化柱的
效果，发现 2 种方法的 ＲA和 ＲE有明显的差异，My-
cosep226 净化柱纯化后各黄曲霉毒素的回收率均有
一定程度降低，说明使用该净化柱纯化的方法会导
致目标化合物的损失，这对微量残留的黄曲霉毒素
检测极为不利。而本方法不存在以上缺点，且提取、
检测过程简便，不仅节省了检测的成本，更提高了结
果的准确性，从而可用于苦杏仁的大量筛查。
本实验收集的苦杏仁药材共 3 种:燀苦杏仁
(去种皮)、炒苦杏仁(去种皮)、苦杏仁(未去种
皮) ，检测结果显示 3 份去种皮的苦杏仁中有 2 份已
污染黄曲霉毒素，而其他未去种皮的苦杏仁均未见
污染，推测原因可能是苦杏仁去种皮后种仁的营养
物质(油脂、淀粉)完全暴露，更容易被真菌侵染，从
而增加污染黄曲霉毒素的风险。因此，苦杏仁污染
黄曲霉毒素的这一现象应当引起重视，并且有必要
考察其合适的贮藏方式和条件，以降低污染的风险，
同时，及早建立相关的限量标准也将有利于降低黄
曲霉毒素对消费者的危害性。
本研究为中药材污染黄曲霉毒素的快速检测提
供了新的研究思路:通过降低基质成分浓度、优化色
谱、质谱条件，减少干扰成分的共流出，有可能克服
中药材基质对 LC-MS /MS 检测的影响，不需昂贵的
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净化柱即可实现药材的筛查与检测。
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Determination of aflatoxin B1，B2，G1，G2 in Armeniacae Semen Amarum
by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
ZHENG Ｒun-sheng，XU Hui* ，WANG Wen-li，ZHAN Ｒuo-ting，CHEN Wei-wen
(Ｒesearch Center of Chinese Herbal Ｒesource Science and Engineering，Key Laboratory of Chinese Medicinal
Ｒesource from Lingnan，Ministry of Education，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510006，China)
［Abstract］ A simple，rapid and cost-effective high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS /
MS)method was established for simultaneous determination of aflatoxins (AFB1，AFB2，AFG1，AFG2)in Armeniacae Semen Amarum
and the application was performance in 11 samples collected from different markets，medical stores and hospitals. The sample was ex-
tracted with 84% acetonitrile /water and 250 μL extraction was directly injected into a LC-MS /MS system without further purification
procedure after being redissolved with methanol. The LC separation was performed on a C18 column with a linear gradient elution pro-
gram of 4 mmol·L －1 NH4Ac-0. 1% formic acid solution and menthol as the mobile phase. Selected reaction monitoring (SＲM)was
used for selective determination of the four aflatoxins on a triple quadruple mass spectrometer，which was operated in positive ionization
modes. All the four aflatoxins showed a good linear relationship with r ＞ 0. 999 0，the average recoveries were between 87. 88% and
102. 9% and the matrix effect was ranged from 90. 71% to 99. 30% in low，intermediate and high levels. Furthermore，the higher re-
covery was obtained by the method reported in this study，comparing to the cleanup procedure with the Mycosep 226 purification col-
umn. Eleven samples collected were detected and the contamination levels of the AFB1 were between 1. 590-2. 340 μg·kg
－1 and the
AF (B1 + B2 + G1 + G2)was ranged from 2. 340 to 3. 340 μg·kg
－1 . In summary，the developed method was suitable to detect and
screen AFB1，AFB2，AFG1，AFG2 in Armeniacae Semen Amarum.
［Key words］ LC-MS /MS;Chinese crude drugs;Armeniacae Semen Amarum;aflatoxins;mycotoxins
doi:10． 4268 /cjcmm20132025
［责任编辑 孔晶晶］
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第 38 卷第 20 期
2013 年 10 月
Vol. 38，Issue 20
October，2013