全 文 ：高效液相色谱法测定山核桃叶中 5 个黄酮苷元含量*
沈勇，刘楠楠，徐敏，张坤，蒋福升，陈建真，田莎莎，丁志山＊＊
(浙江中医药大学，杭州 310053)
摘要 目的:采用反相高效液相色谱法同时测定山核桃叶中汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素的含量。方法:
采用戴安 Ultimate 3000系统，使用戴安 Acclaim 120 C18色谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，以甲醇 － 0. 1%乙酸水溶液(70∶ 30)
为流动相，流速 1. 0 mL·min －1，柱温为 30 ℃，检测器为戴安 Ultimate 3000 DAD，以对应化合物最大吸收波长(汉黄芩素 272
nm、白杨素 262 nm、小豆蔻明 342 nm、球松素查尔酮 342 nm、松属素 284 nm)为检测波长，同时对山核桃叶中 5 个黄酮苷元进
行含量测定。结果:在上述条件下，汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素浓度分别在 1. 27 ～ 25. 3、2. 56 ～ 51. 2、
1. 29 ～ 25. 6、5. 01 ～ 100. 2 和 5. 06 ～ 101. 2 μg·mL －1范围内线性关系良好，平均加样回收率(n = 9)分别为 98. 83%、99. 27%、
101. 1%、98. 70%和 99. 54%;测得山核桃叶中上述的 5 个化合物平均含量(n = 3)分别为 0. 0183%、0. 1142%、0. 0618%、
0. 7934%和 0. 3368%。结论:本法同时测定山核桃叶中汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素 5 个黄酮苷元，为
评价和监控山核桃叶质量及其深入研究与开发奠定了良好基础。
关键词:山核桃叶;黄酮苷元;高效液相色谱法;汉黄芩素;白杨素;小豆蔻明;球松素查尔酮;松属素;药食两用植物;中药质量
监控;中药多成分分析
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2013)05 － 0804 － 04
* 2008 浙江省新苗人才计划项目(2008R40G2120013) ;2012 浙江省新苗人才计划项目(2012R410057)
＊＊ 通讯作者 Tel:(0571)86613666;E － mail:zjtcmdzs@ 163． com
HPLC determination of the content of the five flavonoid
aglycones from the leaves of Carya cathayensis Sarg． *
SHEN Yong，LIU Nan － nan，XU Min，ZHANG Kun，JIANG Fu － sheng，
CHEN Jian － zhen，TIAN Sha － sha，DING Zhi － shan＊＊
(Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou 310053，China)
Abstract Objective:Using the RP － HPLC method for simultaneous determination of five flavonoid aglycones
(wogonin，chrysin，cardamomin，pinostrobin chalcone，and pinocembrin)in the leaves of Carya cathayensis Sarg．
Methods:The DIONEX Ultimate 3000 HPLC system coupled with DAD was carried out，and the Acclaim 120 C18
column (250 mm ×4. 6 mm，5 μm)was used with the mobile phase consisting of methanol and 0. 1% acetic acid
aqueous solution (70∶ 30)to determine the content of the five flavonoid aglycons． The flow － rate was 1. 0 mL·
min －1，the column temperature was at 30 ℃，The ultimate 3000 DAD detector was used． Consistent with the maxi-
mum absorption wavelength of the compound，the detection wavelengths were 272 nm (wogonin) ，262 nm (chry-
sin) ，342 nm (cardamomin and pinostrobin chalcone) ，and 284 nm (pinocembrin)． Results:The calibration
curves of the five flavonoid aglycons were linear in the range of 1. 27 － 25. 3，2. 56 － 51. 2，1. 29 － 25. 6，5. 01 －
100. 2 and 5. 06 － 101. 2 μg·mL －1，and the average recoveries (n = 9)were 98. 83%，99. 27%，101. 1%，
98. 70%，and 99. 54% for wogonin，chrysin，cardamomin，pinostrobin chalcone，and pinocembrin，respectively． Ad-
ditionally，the average contents of the 5 compounds mentioned above were 0. 0183%，0. 1142%，0. 0618%，
0. 7934%，and 0. 3368%，respectively． Conclusion:The method can simultaneously determine the content of the
five flavonoid aglycones in the leaves of C． cathayensis，which paves the way for evaluation，quality control and fur-
ther exploitation of the leaves of C． cathayensis．
Key words:Carya cathayensis Sarg．;flavonoid aglycon;HPLC;wogonin;chrysin;cardamomin;pinostrobin chal-
—408— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(5)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.05.006
cone;pinocembrin;medical and edible plant;quality control of traditional Chinese medicine;multi － component a-
nalysis of traditional Chinese medicine
山核桃(Carya cathayensis Sarg．)是一种落叶乔
木，属胡桃科山核桃属，我国为主产地之一。山核桃
主要分布在我国的浙江、安徽两省交界地区，其中以
临安、昌化品质为佳，具有明显的地域分布特
性［1 － 2］。山核桃作为一种药食两用植物，近年来受
到研究者的广泛关注，本实验室前期研究发现山核
桃树叶中含有抗肿瘤活性的黄酮类物质［3 － 4］，并从
山核桃叶中分离鉴定出含量较高的汉黄芩素、白杨
素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素 5 个黄酮类活
性成分。5 个化合物都具有很好的药理活性，如汉
黄芩素具有解痉、抗炎、抗变态反应的功效［5］;球松
素查尔酮可选择性抗利什曼原虫［6］，抗肿瘤以及舒
张血管、防止动脉粥样硬化等心血管药理作用;小豆
蔻明在心血管疾病方面具有其独特的疗效，能改善
平滑肌细胞的糖代谢;白杨素具有抗肿瘤、放疗增
敏、抗炎、抗氧化、防治心脑血管疾病等多种药理作
用［7］;松属素具有包括抗菌、抗原虫、抗诱变、抗氧
化、抑制睾丸酮 5A －还原酶、抑制酪氨酸酶、抑制葡
萄糖基转移酶、抑制肥大细胞及中性粒细胞分泌、杀
虫、抗肿瘤、局麻等［8］多种药理学活性。检索国内
外文献，关于山核桃中物质含量测定的报道很少，主
要集中在总黄酮含量的测定，这些报道主要采用紫
外分光光度法以槲皮素、芦丁等为指标性成分［9 － 10］
进行含量测定。黄酮单体含量测定仅发现山核桃叶
中球松素查尔酮含量测定［11］和山核桃外蒲壳中球
松素和大黄酚含量的测定［12］，尚未发现 HPLC 同时
测定山核桃叶中多种黄酮类物质含量的报道，加之
国内外对山核桃叶的化学成分报道同样很少，这些
研究不能全面系统地评价山核桃叶的质量，使得山
核桃叶的质量监控标准缺乏。本研究建立了 HPLC
法同时测定山核桃叶中汉黄芩素、白杨素、小豆蔻
明、球松素查尔酮、松属素 5 个黄酮苷元含量的方
法，为山核桃叶质量监控标准的确立提供了基础。
1 仪器与试药
美国戴安公司 Ultimate 3000型高效液相色谱仪系
统、Acclaim120 C18色谱柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm);
SK25 /OHP型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限
公司，功率150 W，频率40 kHz)、Sartorius BD211D电子
天平(德国塞多利斯，十万分之一);自动双重纯水蒸馏
器(上海申胜生物技术有限公司);AP003 －1457型真空
泵(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。
山核桃叶采自浙江临安，经浙江中医药大学丁志
山教授鉴定为山核桃 Carya cathayensis Sarg．的树叶。
对照品汉黄芩素(批号 MUST － 11040501，纯度
≥98%)和白杨素(批号 MUST － 11103007，纯度≥
98%)由北京恒元启天化工技术研究院、北京世纪
奥科生物制剂有限公司联合研制;小豆蔻明(批号
110763 － 200403)购自中国食品药品检定研究院;球
松素查尔酮、松属素由实验室自制，经 NMR 鉴定其
结构，HPLC 峰面积归一化法检测含量分别为
99. 4%和 99. 2%。
甲醇，GR，天津赛孚瑞科技有限公司，批号
20120518001;甲醇，AR，衢州巨化试剂有限公司，批
号 20120101;冰乙酸，AR，中国杭州化学试剂有限公
司，批号 20091128;自制双蒸水。
2 方法与结果
2. 1 溶液的制备
2. 1. 1 混合对照品储备液 精密称取汉黄芩素、白
杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素的对照品适
量，分别加甲醇制成各单体对照品储备液(汉黄芩
素 253 μg·mL －1、白杨素 512 μg·mL －1、小豆蔻明
513 μg·mL －1、球松素查尔酮 501 μg·mL －1、松属
素 506 μg·mL －1)。分别吸取各单体对照品储备液
适量，加甲醇制得混合对照品储备液(汉黄芩素
25. 3 μg·mL －1、白杨素 51. 2 μg·mL －1、小豆蔻明
25. 6 μg·mL －1、球松素查尔酮 100. 2 μg·mL －1、松
属素 101. 2 μg·mL －1)。
2. 1. 2 供试品溶液 取适量山核桃叶干品粉碎，过
40 目筛，称取粉末约 0. 5 g，精密称定，置于 50 mL
量瓶中，精密加入甲醇 50 mL，称定重量，浸泡 1 h后
超声处理 30 min，取出待冷却后再次称定重量，用甲
醇补足减失重量，取续滤液过 0. 45 μm滤膜，即得。
2. 2 色谱条件及系统适用性考察 采用戴安 Ac-
claim 120 C18色谱柱(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ，流
动相为甲醇 － 0. 1%乙酸水溶液(70 ∶ 30) ，流速 1. 0
mL·min －1，柱温为 30 ℃，检测波长 272 nm(汉黄芩
素)、262 nm(白杨素)、342 nm(小豆蔻明和球松素
查尔酮)、284 nm(松属素)。各峰与相邻峰的分离
度均大于 1. 5，理论塔板数均在 1 万以上，汉黄芩
素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素的保留
时间分别约为 9. 4、10. 7、14. 9、15. 8、20. 4 min。样
品与对照品各波长下的色谱图见图 1。
—508—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(5)
图 1 山核桃树叶提取物(A)和对照品(B)在各检测波长下的 HPLC
色谱图
Fig 1 HPLC chromatograms of Carya cathayensis leaf extraction samples
(A)and reference substances(B)
1．汉黄芩素(wogonin) 2．白杨素(chrysin) 3．小豆蔻明(cardamomin)4．
球松素查尔酮(pinostrobin chalcone) 5．松属素(pinocembrin)
2. 3 方法学考察
2. 3. 1 线性关系考察 精密量取混合对照品储备
液 1000、500、250、125、50 μL，加甲醇稀释至 1 mL，
摇匀，即得系列混合对照品溶液，过 0. 45 μm 滤膜，
分别进样 10 μL，以待测成分浓度 X(μg·mL －1)为
横坐标，峰面积 Y(mAU × min)为纵坐标，绘制标准
曲线，结果表明汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素
查尔酮、松属素浓度分别在 1. 27 ～ 25. 30、2. 56 ～
51. 20、1. 29 ～ 25. 60、5. 01 ～ 100. 20 和 5. 06 ～
101. 20 μg·mL －1范围内线性关系良好，相应的回
归方程分别为:
Y = 1. 012X + 0. 0590 r = 0. 9999
Y = 0. 8255X － 0. 0903 r = 0. 9999
Y = 1. 046X － 0. 0587 r = 0. 9999
Y = 0. 8067X － 0. 4716 r = 0. 9999
Y = 0. 7391X + 0. 3407 r = 0. 9999
2. 3. 2 精密度试验 精密吸取同一浓度混合对照
品溶液 10 μL，连续进样 6 次，记录色谱图，测量峰
面积，结果汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔
酮、松属素峰面积的 RSD 分别为 1. 1%、1. 7%、
0. 79%、1. 6%和 1. 3%，表明仪器稳定，色谱系统重
现性良好。
2. 3. 3 重复性试验 取山核桃树叶粉末 6 份，按
“2. 1. 2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，进样
10 μL，测定峰面积，结果样品中汉黄芩素、白杨素、
小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素的平均含量分别为
0. 184、1. 143、0. 611、7. 932、3. 365 mg·g －1，RSD 依
次为 1. 8%、1. 3%、1. 7%、0. 34% 和 1. 1%，表明方
法精密度良好。
2. 3. 4 稳定性试验 取新制备的同一份供试品溶
液，分别在室温放置 0、2、4、8、12 和 24 h 进样 10
μL，记录色谱图，计算汉黄芩素、白杨素、小豆蔻明、
球松素查尔酮、松属素峰面积的 RSD 分别为
0. 91%、0. 49%、0. 78%、1. 7%和 0. 48%，结果表明
供试品溶液在 24 h内稳定。
2. 3. 5 加样回收率试验 称取“2. 3. 3”项中已测
知含量的山核桃树叶(批号 20111008)粉末 9 份，每
份 0. 25 g，精密称定，平均分为 3 组，分别精密加入
混合对照品溶液(汉黄芩素 46. 3 μg·mL －1、白杨素
286. 0 μg·mL －1、小豆蔻明 152. 3 μg·mL －1、球松
素查尔酮 1985. 0 μg·mL －1、松属素 841. 6 μg·
mL －1)0. 8、1. 0、1. 2 mL，按“2. 1. 2”项下的方法制备
供试溶液，在上述色谱条件下进样 10 μL，计算汉黄
芩素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮、松属素的
量，并根据加入量计算回收率，结果见表 1，表明方
法准确度良好。
2. 4 样品测定 取 3 批次样品各 3 份，分别按
“2. 1. 2”项下的方法制备供试品溶液，精密取供试
品溶液 10 μL进样分析，以外标法计算各成分的平
均含量，结果见表 2。其中白杨素、球松素查尔酮和
松属素含量分别占其叶片干重的 0. 1%以上，含量
较高，而 球 松 素 查 尔 酮 的 含 量 更 是 达 到 了
0. 7934%，值得深入研究。
3 讨论
本研究运用 HPLC法同时对山核桃叶中汉黄芩
素、白杨素、小豆蔻明、球松素查尔酮和松属素 5 个
黄酮类物质的含量进行了测定，采用二极管阵列检
测器，同时设定多个检测波长，使得每个物质都能在
其最大吸收波长下进行含量测定，系统误差小，精密
度和可靠性高，与山核桃树叶中球松素查尔酮单体
含量测定结果［11］相当。本实验分别考察了加热回
流提取、超声提取对山核桃树叶中 5 个黄酮苷元成
分提取的影响，结果无明显差异，因超声提取操作简
单方便，故选超声提取;考察甲醇(60%、80%、
100%)、乙醇(60%、80%、100%)作为提取溶剂，结
果表明 100%甲醇提取率最高;比较 100%甲醇提取
—608— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(5)
表 1 加样回收率测定结果
Tab 1 The result of recovery rate
成分
(component)
原有量
(original)/μg
加入量
(added)/μg
测定值
(found)/ μg
回收率
(recovery)/%(n =3)
RSD /%
平均回收率
(mean recovery)/%(n =9)
汉黄芩素(wogonin) 46. 0
白杨素(chrysin) 285. 8
小豆蔻明(cardamomin) 152. 8
球松素查尔酮
(pinostrobin chalcone)
1983. 0
松属素(pinocembrin) 841. 3
37. 1 82. 6 98. 87 0. 76
46. 3 92. 1 99. 46 1. 7
55. 6 100. 6 98. 16 0. 74
228. 8 512. 2 98. 98 1. 5
286. 0 571. 7 99. 97 0. 67
343. 2 625. 1 98. 87 1. 5
121. 8 276. 1 101. 3 1. 3
152. 3 306. 8 101. 2 1. 1
182. 7 337. 1 100. 9 1. 2
1588. 0 3559. 6 99. 28 0. 43
1985. 0 3943. 2 98. 75 1. 6
2382. 0 4319. 1 98. 07 0. 79
673. 3 1509. 9 99. 31 0. 89
841. 6 1677. 6 99. 37 1. 3
1009. 9 1850. 5 99. 93 1. 0
98. 83
99. 27
101. 1
98. 70
99. 54
表 2 样品中 5 个分析物的含量(%，n =3)
Tab 2 Contents of 5 analytes in three batch samples
批号
(lot No．)
汉黄芩素
(wogonin)
白杨素
(chrysin)
小豆蔻明
(cardamomin)
球松素查尔酮
(pinostrobin
chalcone)
松属素
(pinocembrin)
20111008 0. 0184 0. 1143 0. 0611 0. 7932 0. 3365
20111010 0. 0179 0. 1134 0. 0623 0. 7928 0. 3368
20111015 0. 0186 0. 1148 0. 0621 0. 7942 0. 3372
15、30、45、60 min，结果显示 30 min 已提取完全;同
时考察不同体积甲醇(25、50、75 mL) ，发现 50 mL
即可充分提取，故本文确定 0. 5 g 山核桃树叶粉末
以 100%甲醇 50 mL超声提取 30 min。流动相考察
发现甲醇 － 0. 1%乙酸水溶液较甲醇 －水溶液峰形
更佳，理论塔板数更高，甲醇 － 0. 1%乙酸水溶液比
例为 70∶ 30 时各峰分离良好且分离度均大于 1. 5，
保留时间适中。本研究为进一步开发利用山核桃叶
奠定了良好基础。
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(本文于 2012 年 8 月 9 日收到)
—708—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(5)