全 文 ：福 建 师 范 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
T HE J O URN A L O F F UJ 砚A N T EA H CE RS UN I V E RS IT Y
( N A T URA L S CI EN CE )
`
2 ( 2 ): 72 一 76
,
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眉豆胰蛋白酶抑制剂的研究’
李田 土 方幼兰 陈 : 盛 余宝笙
( 高分子研究所生化研究室 )
t
一 ’ 己! 首
, 叨 吕 卜一 .
动植物体内常含有胰蛋白酶抑制剂 . ’ i 通过戮种药角宜的筛选比较 , 我们发现眉豆中
含有较丰富的胰蛋白酶抑制剂 . 国内外对豆类来源的胰蛋白酶抑制剂的研究相当普遍 、
深入 , ’ 但有关詹豆侠蛋由酶抑制剂的研究尚未见报导飞
眉豆 〔V才: ” a c 夕落i n dr 京c a ( L · ) S k e e l s 〕 ,也叫饭豆 , 属午豆科 , 普渔种植于福建闽南
各地 . 本文报导眉豆胰蛋 白酶抑制剂的制备 、 分离和抑制活力及分子量范围的测定 .
二 、 材 料 与、 方 法
1
. 材料: 眉豆购自福建省南安县 , 提取前先脱去表皮 , 粉碎加工成粉末 .
2
. 试俐: 酶 一 ( 结晶羊腆蛋白酶 )采用 上海中奶公司乳品一厂产品 . 底物中的苯甲酞 -
D卜精氨酸对硝基苯胺盐酸盐 (B A P N A 、 H c )L 及苯甲酞 . L `精氨酸乙醋盐酸盐 (B A E E ) ,
均为上海生化所东风试剂厂产品 ( 生化试剂 ) ; 酪蛋白为上海牛奶公司乳品一厂产品 ,
血红蛋白为日本武田化学株式会社产品 . 标准蛋白中的细胞色素 C为美国 s IG M A化学公
司产品 , 结晶胰蛋白酶为上海牛乳公司产品 , 卵情蛋白为上海化学试荆分装厂产品 ( 国
产分装 ) , 牛血清白蟹白 ( `电泳单点纯 · )为上海牛奶公司综合厂产品 . , p had 心 f · G· 5公
和 s如 h a d e x G· 1 0 为上海化学试荆厂产品 · (进口`分装 ) 之其他试剂均为分析纯 `
3
.分析方法 : 在抑制剂提取过程中 , 蛋 白含量采用物il n 一酚法和紫外吸收法 J” . 抑
制粼的活力测定分瓤以B A P N人、 B A E E 、 ’ 酪蛋白 、 一血红蛋自为底物 , 测定方法基本 上
按文澎比幻 、 〔3〕 、 仁4〕进行 . 抑制常数按文献仁幻的方法计算了 j
三 、 实 卜验 结 果
’
, 、眉宜映蛋白醉抑制姗的制奋
’ 酸提取 : 眉豆粉末用 .0 2纽万 H: oS ` 抽提 2小时 , 离心收集上清液二 二
`
热处理除杂蛋白: 上清液分次在 60 ~ 65 ℃的水浴中加热五分钟 , 用冰水迅速冷却 ,
静置过夜后离心除去杂蛋白 .
一耳琢硫氨蔽国牡届生化学术荟议录用 , 于 : 9 8 ,年 , 。月刊登在该学术会议论文摘要汇编 ( 土
册 ) 第九页 ,
冬期 1 眉豆胰蛋白酶抑制剂的研究
分步盐析 : 用 6 N取 OH 将所得上清液的p H 值调至 5左右 , 再缓慢加入固体硫酸钱至
4 0帕泡和度 . 六小时后离心 , 沉淀为无活性蛋白 , 弃去 . 上清液继续加入 固体硫酸按至
75 响饱和度 , 静置冰箱过夜 , 离心收集沉淀 , 1即为眉豆胰蛋白酶抑制剂的粗制品 .
.
, p h“ 。 x o 一 50 柱分离 . 凝胶住 一 .2 5 “ 7 e5 m, 将粗制品的溶解 液上柱 , ; 用 含 .0 5对
N a以 的 .0 05 M硼酸缓冲液 ( p H S . o ) 洗脱 , 洗脱情况见图 .1
se 帅ad ex 口一 1 0 柱分离 : 凝胶柱 2 . 5 X 6了c . , 以含O . 25 M . N a CI 的 0 . 2M 硼酸缓冲液
( p H S
.
0 ) 平衡 , 将 A峰及 B 峰洗脱液分别收集浓缩, 再用 eS p had 。拓 G · 1 0 0 柱进一步分
离 , 分离情况见图乙 一奋叶讨耐只ù侧翻嗽续.淤盆“赵柳积兴泉脚晓吸到 0。 40。 2
4 0 ` 0 9 0 I OO 1 2 O 1 4o l GO 工竺舀 1 0 日0 幼 40 肋 t , 7合 盆0
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二贫万.韦宁`|卜r,
幻曰!.512娜M目
借号圈 1 抑制荆粗制品在s e p h ad e x
G
一
50柱上的分离图谱
流速1毫升 /分 , 每管5毫升 。
实线 : 2 8 0早二吸光值 , 虚线 : 抑制剂活力 (l % )
图 2 ^ 峰浓缩液在乐曲 .d , x
柱上的分离圈谱
份0 1璐
G
一
I OQ
流速 0 . 8毫升 /分 , 每管哎毫升 。
实线 , 2 8。。二吸光值 , 虚线 : 抑制剂活力 ( 1% )
经活方树定 , 发现 A : 活力较高 , 人 , 活
力较砖可咖…掀去 , 得到抑制剂 A : 白比 A : 少
, 敌将 A : 弃
B 峰浓缩液经 S e p h a d e x G 一 1 00 柱层
析 , 只呈现一个对称峰 , 且具有一定的活
性 , 洗脱情况见图 3 .
最后 , 把分离得到的 A : 、 B 组分的洗
脱液分别浓缩 、 透析 、 制成干粉 .
对抑制剂 A : 、 B 的抑制活 力 进 行 比
较 , 以 B A P N A 为底物 , 同时进行活力测
定 , 测得A `的抑制活力为 B 的” 4倍 · 由于
B的抑希鳞节力低也予舍弃 , 最后取人 : 组分
为眉豆胰蛋 、自酶抑制剂 .
·
2
. _眉豆麟蛋白饰抑制荆 A : 的活力侧定
A 空能抑制胰蛋白酶对多种 底 物 的 水
解 . 以 B A P N A 、 B A E E 、 酪蛋自 、 血 红
圈 3 B峰浓编液在 s e p h a d e x
G
一 1 0 柱上的层析田僧
流速 0 . 8毫升 /分 , 每管准毫升 .
实线 : 2 8 0n tn 吸光值 .
虚线. 抑制剂活力 (l % ) .
《 福 建 师 范 大 学 学 报 》 自 然 科 学 版 1 98 6年 6薄
蛋 白为底物时 , A : 对结晶羊胰蛋白酶的抑制比值分别为 : 1 : 丈. “ , 1 : 。 . 93 ,l : .i’ 1 5 ,
冲J时1 : 0 . 6 0 , 抑制常数分别为 2 . 2 x l o一 “ , 5一 x l少 , , s . 2 x 1 0 一 , 3 . 4 又 1 0 ~ 。 (详见图 4一7)
( 1) A
: 对羊胰蛋自酶水解 B A P N A 的抑制曲线的测定 : 以 浓 度为 3 60 微 克 /升 ,
B A P N A 为底物时 , 羊胰蛋白酶的浓度为10 微克 /毫升 , 种制剂浓度为 1百微克 /毫并 . 侧
定时取不同体积的抑制剂分别加酶液 D . 5毫升 , 并用。 . 0脚 PH 瓦咖 T ir , 缓冲液补党蜜
r、 0耐 , 37 ℃保温 10 分钟后 ,’ 加 B A PN A溶液 2 .物 1, 盯℃反应 1。分钟后 , 立即加人。 . 5
m 1 36 呱的醋酸申止反应 , 在 41 0 n m下测定吸光值 , 测定结果见图 4 . ` · , “ ,
( 2) A : 对羊胰蛋白酶水解 B A E E 的抑制曲线的测定 : 底物 B A E E用 p H S , 。含 0 . 。 ,对
aC cl
: 的 0 . 05 M T ir s 缓冲液溶解 , 最终浓度为 。 . s x l o 一 “ M . 羊胰蛋白酶浓度为 4 0微克 /毫
升 , 抑制剂浓度为 1 0 微克子毫升 . E 十 I混合液取不同体积的抑制齐d , 用含 o . 25 M N a c l 的
o
.
05 M硼酸缓冲液 . ( p H S . 压) 补充至 0 . 5 hi l , 再分别加入酶液。 . 5m l混合 . 对照管取酶滋
0
.
5 lm
, 加入上述缓冲液 o . s m l混合 , 2 5 ℃_放置 10 分钟 . 测定时取 E或 E + I孩合液 0 . 2m卜
加入底物 .3 o m l , 25 ℃反应 10 分钟后立即在 25 3n m 下测定光密度变化 , 测定结果见图乐
0的铃即
咨只想(闷)谊四嘟
( 3) A :对羊胰蛋 白酶水解酪蛋
白的抑制曲线的测定 : 酪 蛋 自. 用
o
.
05 M p H 7
.
8 的磷酸缓冲液配制成
Z肠溶液 , 羊胰蛋白酶浓度为 2 0微
克 /毫升 , 抑制剂浓度为40 微克 /毫
升 . 取不同体积的须瓤剂 ,分势[J甫王
述缓冲液稀释茗姆侧 l , 各加入酶
液 1 . 口叭 , 37 ℃保温 10 分钟 , 然 后各
加入酪蛋白溶液 1 . Om l . 37 ℃反应
2 0分钟后 , 加入 2 0肠的 T C A 1 . o m l
中止反应 . 过滤后各取滤液 1 . 0 m l ,
分别加入 P ol i -n 酚试 剂 3 . Om l , 30
分钟后在 6 8 On稗下侧定光 密 度变
化 , 侧定结果见图 6二 ` 厂
( 4) A : 对羊胰蛋白酶水解血红
蛋白的抑制曲线的测定 : 血红 蛋粼:
经尿素变性后用 0 . 05 从 p H 7 . 8的葬
酸缓冲液配成 ’ 含外溶液 . 羊胰蛋白
酶浓度为 20 擞克 /毫升 , 抑制剂浓
度为垂Q微克 /毫升 : 取不啾井积 阿
抑制剂分 lBJ 用上述 缓 冲 液 补充至
1
.
oml
, 各加入酶液 1 .方动 . ` ’ 37 七 `保
2 I G 吕
抑利刘“ ) . 微克
图 4 从对羊肺爱白 , 圈 5
醉水解B A P N A
的抑制曲线
,
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_ .
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、
;卜卜一: ,
0 2 寸 ` 名 3 !劝
抑初刘 “ ) ,微克
图 6 A :对羊胰蛋白
醉水解酷蛋白
的抑制曲线
图 7
一又 一 `“儡扁糯 。 库凡时革胶蛋百
醉水解血红女
白的抑制曲线
的创40叻奋只纽ǎ囚à尽翩澎灿叻柳产扩众勺ùǎ闺ùù记户洲
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温 1。夯钟亏· 燕后客加入血红蛋白溶液 1 . 。m l . 3 7七 反应、 30 分钟 后立即少加人 、 .恤 1龙。 ,
的 T C A溶液中止反应…过滤后取滤液 1 . Om l , 加入外 l i n 一 酚试荆 3 ; o m卜在 6即二 ·下测定光密度变化 , 测定结果见图 7 , “ /
2期 眉豆胰蛋白酶抑制剂的研究
3
. 眉豆胰受白阵抑制荆A 。组分的分离
A : 经聚丙烯酞胺 圆盘电泳法检验仍有五条色带 . 我们曾试图 用
D E A E
· 2 2纤维素和 一 D E A E · sep h ad ex 等为载体 进一步分 离 , 但 效
果不好 , 最后采用聚丙烯酞胺垂直板 电泳进行分离 . 分离 胶 浓 度 为
7
.
5 肠 , 浓缩胶浓度为 3% . 电泳缓冲液为 p H S . 3的 T r is 一甘氨酸缓冲液 .
参照上述五条色带的部位分别切割电泳凝胶 , 捣碎后用含0 . 5M N a cl
的 p H S . 0硼酸缓冲液溶解 . 将多次分离后的相同组分收集在一起 , 用
砂芯漏斗抽滤 , 滤液作为眉豆抑 、 剂的五个不同组分的样品琳 冻干成粉末 . 分别定为 A 。 一 a , A : · b , A Z一。 , A , 一 d , A : 一。 , 它们的电泳谱图见
图 8 .
牛述五个黔都能抑制结晶羊胰蛋白酶对BA NP A 的水解 , 抑制活力分别为 1 : 0 4 7 , 1 : 1 . 1 1 , l : 1 . 14 , 1 : 1 . 1 0 , l : 0 . 2 6 . 抑制常
数 ( K i )分别为 1沂 g X l o 一 ’ , . 1 . 4 9 x z o 一 “ , 5 . 6 s x x o一 , , .一 4 9 x r o 一 , ,
厂
, , . . .
. 口 . 心
, . . . . . .
. . . . . 响 . 叨`
图 9 十}商稀吸番难胶电泳材图
’ 、 冲 产
1
.
9 1 x 1 0一
.4 A : 五个组分的分子 t 科定 , 一 ,
分子量测定基本上按w e b o r方法〔5 ’ , 采用 S D S聚丙烯酞胺垂直板电泳法 . 标准蛋白
为细胞 色素 C ( MW i 2 5 0 o ) 、 结晶胰蛋白酶 ( MW 2 3 3 0 0 ) 、 卵清蛋白 ( MW 4 5 0 0 0 ) 、
牛血清白蛋白 ( M w 6 7 0 0 。 ) . 用含有 l 外 s D s 、 1帕琉基乙醇 、 10 肠甘油 、 0 . 02 肠澳 酚
蓝的 o . 01 M磷酸缓冲液 ( p H 7 . 2 ) 溶解 , 浓度为 0 . 5毫克 /毫升 . 移取样品 各。 . 4m l ,加入
(卜盆à矛一
。 . l m l 样品溶解液 (其浓度比标准蛋白溶
解液高5倍 ) . 将试管放入佛水浴中加热 3分
钟 , 使蛋白质的二硫键还原 , 氢键和疏水
键断开 , 形成蛋白。 5 0 5 夏合物 . 电 泳缓
冲液为含 0 . 2呱 S D S 的 0 . 2M磷酸缓冲液
( p H 7
.
2 )
. 加样后将电流调至 50 m A , 电泳
后进行染色 、 脱色 , 均得到单一的色带 .
以迁移率 ( R ) 为横坐标 , 以 19 (M W )
为纵坐标绘制标准曲线 , 『求得 A王五个组分
的努子量为犷 A :一 3 0 550 , A :沁 2 7 8 6伪
A
: 一 e 2 6 3 0 0 , A
: · d 1 4 4 5 0 ; A :
一
e < 1 4 0 0 0
(详见图 9 ) .
广 \阵图 9 四种标准蛋白 迁移积叭 ’
_
一 在s D s凝胶上的标准曲续
.1 细胞色素只 “ A : 一 “ .
2
. 胰蛋白酶 b A Z一 b
3
。 卵清蛋白 c A Z一。 -
乞 牛血清蛋白 d A屠一 d ,
四 、 一 讨 论
据文献报导 , 大豆中存在三种胰蛋白酶抑制剂 [6 、 7 ’ , 绿豆中存在两种抑制 剂 14 ’ . 通
过本研究 , 我们从眉豆中分离出五种胰蛋白酶抑制剂 , 进一步说明一种植物种子里同时
存在两种 以上抑制剂的现象是相当普遍的 ,
《 福 建 师 范 大 学 学 报 》 自 然 科 学 版 1 9 8 6年 6月
这五种抑制剂是单功能或多功能抑制剂? 它们的结构有何异同等问题 , 有待于进一
步研究 .
致谢 本文承蒙林梅英老师指导 , 在 电泳制备分离工作中曾得到吴旭初 同 志 的 帮
助 , 谨此致谢 !
参 考 . 文 南丸
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S t u d i e s o n T r y p s i n I n h i b i t o r f r o m t h e S e e d o f
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