全 文 ：doi10. 16473 / j. cnki. xblykx1972. 2015. 03. 016
昆明芦荟根腐病病原菌的分离及鉴定
*
丁雅迪1，王金华1，2，缪福俊3，毛德昌1，谢恩来1，熊智1
(1. 西南林业大学，云南 昆明 650224;2. 云南农业大学，云南 昆明 650201;
3. 云南省林业科学院，云南 昆明 650201)
摘要:芦荟具有较高的经济和药用价值，研究芦荟根腐病的病原菌有利于芦荟产业的发展。采用纯培养技术对
芦荟根腐病的病原菌进行分离鉴定，并利用离体根部接种法对其进行致病性测定。结果表明，从感染芦荟的根
中分离得到一株根腐病病原菌;依据其形态结构特征和 ITS测序初步鉴定为尖孢镰刀菌。致病性测定发现，利用
分离出病原菌接种的芦荟根段均有病斑，其中刺伤和无刺伤的根段的病斑率分别高达 94. 4 %和 66. 7 %。
关键词:根腐病;致病性;ITS;尖孢镰刀菌
中图分类号:S 436. 8 文献标识码:A 文章编号:1672 － 8246 (2015)03 － 0102 － 05
Isolation and Identification of Aloe Ｒoot Ｒot Pathogens in Kunming
DING Ya-di1，WANG Jin-hua1，2，MIAO Fu-jun3，MAO De-chang1，XIE En-lai1，XIONG zhi1
(1. Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，P. Ｒ. China;
2. Yunnan Agriculture University，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China;
3. Academy of Forestry，Kunming Yunnan 650201，P. Ｒ. China)
Abstract:Aloe chinensis has high economic and medicinal value，but the occurance of root rot greatly limits the
development of the Aloe chinensis industry． Using pure culture techniques，the Aloe chinensis root rot pathogen was
isolated and identified，and its pathogenicity was further assessed using an in vitro root inoculation method． One
root rot pathogen fungus was isolated from the infected roots of Aloe chinensis;based on ITS morphological structure
characteristics and ITS gene，the fungal isolate was preliminary identified as Fusarium oxysporum． Pathogenic de-
termination showed that the inoculated strains of Aloe chinensis root segment has diseased spots． Diseased spot rati-
os were found to be 94. 4 % and 66. 7 % using the stab and no-stab root methods，respectively．
Key words:root rot;pathogenic;ITS;Fusarium oxysporum
芦荟 (Aloe chinensis)是百合科多年生草本植
物，主要分布于热带、亚热带地区。芦荟因富含多
糖、蛋白质、氨基酸、活性酶、维生素等活性物质
及有益微量元素而广泛应用于医疗、美容、保健、
食品等领域［1 ～ 2］。由于巨大的商业价值引起了许多
国家的高度重视，并在世界各地广泛栽培［3］。近
年来，我们国家对芦荟的开发应用研究从 20 世纪
末开始起步，主要集中在化妆品［4］、药用［5 ～ 7］、保
健饮料［8 ～ 9］、酒制品［10 ～ 11］、奶制品［12］等方面以及
作为植物杀菌剂［13］防治植物病害，广泛的需求催
生了芦荟的产业化种植，这种产业化种植尤以云
南、海南、四川、福建等地范围广［14］。然而，在
大规模的种植过程中，根腐病严重地制约了芦荟产
业化的发展。仅在 2004 年云南省的根腐病发病率
第 44 卷 第 3 期
2015 年 6 月
西 部 林 业 科 学
Journal of West China Forestry Science
Vol. 44 No. 3
Jun. 2015
* 收稿日期:2015 － 01 － 20
基金项目:西南林业大学科技创新基金 (1406)。
第一作者简介:丁雅迪 (1989 －)，女，硕士研究生，主要从事资源微生物开发利用研究。E-mail:1203685364@ qq. com
通讯作者简介:熊智 (1965 －)，男，教授，主要从事微生物学和分子生物学、农林产品二次资源利用研究。
E-mail:zhix@ swfu. edu. cn
达到 42. 54 %、死亡率高达 26. 36 %［15］，研究芦
荟根腐病及其防治已成为目前的研究热点。有关芦
荟根腐病方面的研究还鲜有报道。故本研究对芦荟
根腐病病原菌进行分离纯化研究，结合形态与 ITS
测序方法鉴定其病原菌，并采用回接方法对其致病
性进行测定分析，为芦荟根腐病的生物防治提供理
论基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
采自云南省林业科学院、西南林业大学具典型
根腐病症状的芦荟及健康芦荟各 10 株作为分离样
品，采集后置于 4℃冰箱内保存备用，并观察记载
田间症状表现。
马铃薯琼脂培养基 (PDA)，配方见参考文
献［16］。Ezup 柱式基因组 DNA 抽提试剂盒 (真
菌)、2 × Taq PCＲ Master Mix 等均由生工生物工程
(上海)股份有限公司提供。
1. 2 方法
1. 2. 1 病原菌的分离和纯化
取芦荟根腐病样品根段，在病健组织处取
样［17］，样品表面经流动自来水冲洗干净后，用75 %
乙醇处理 30 s，无菌水 2 ～ 3 次，用 0. 1 %升汞溶
液消毒 2 min，无菌水刷洗 4 ～ 5 次，再用灭菌滤纸
将根上的水吸干，用无菌解剖刀将根切成 5 mm 长
的根段，接种于 PDA 培养基上，每个培养皿放 4
个根段，28℃下恒温培养，初步鉴定分离纯化后转
管，保存于 4℃冰箱中备用。健康芦荟样品根段按
照上述方法分离纯化并与患病样品根段分离出的真
菌进行对比。
1. 2. 2 病原菌致病性测定
采用离体根部接种法［17］进行病原菌的致病性
测定，即选取芦荟 1 年生健康幼根作为接菌材料，
将上述幼根截为 6 cm 长的根段，将经过分离纯化
得到的芦荟病原菌打成菌饼，分别做刺伤和无刺伤
接菌，幼根段采用刺伤接菌法均匀接 3 个菌饼，每
个 PDA平板中接两个根。3 次重复，共 18 个接种
点。无刺伤接菌法采用同种方法处理。将刺伤和无
刺伤不接菌幼根段分别接种于 PDA 平板中作为对
照。对上述所有处理根段两端用脱脂棉包裹，置于
25℃培养箱中无菌水保湿 48 h 后观察发病情况，
第 10 天统计发病率。并从发病部位再次分离病原
菌，与初次所接病原菌的异同。
1. 2. 3 病原菌的形态观察
参照真菌分类鉴定方法，将致病性接种确定的
病原菌在 PDA 培养基中活化后，挑取适量菌体制
成切片，置于光学显微镜下观察。同时结合菌株菌
落形态特征，包括性状、颜色、质地、分生孢子大
小、边缘特征、生长率等情况，初步确定病原菌的
种属地位。
1. 2. 4 菌株 DNA提取及 ITS PCＲ扩增
采用 Ezup 柱式基因组 DNA 抽提试剂盒 (真
菌)提取根腐病病原菌基因组 DNA，经 1. 2 %琼
脂糖凝胶电泳检测合格后，将其作为 ITS序列 DNA
扩增的模板。ITS序列 PCＲ扩增采用通用引物 ITS1
和 ITS4 〔生工生物工程 (上海)股份有限公司提
供〕［18］。PCＲ 反应体系为模板 DNA 1 μL、2 × Taq
Master Mix 12. 5 μL、正、反引物 (10 μmol /L)各
1 μL，补充去离子水至 25 μL。PCＲ 扩增条件:
95℃预变性 5 min;95℃变性 30 s;56℃退火 45 s;
72℃延伸 1 min，30 个循环;最后 72℃ 延伸 10
min。取 5 μL的 PCＲ 扩增产物进行 2 %琼脂糖凝
胶电泳检测经 4S Green Nucle Acid染色，在凝胶成
像系统上检测并拍照。
1. 2. 5 ITS序列测定及系统发育分析
PCＲ扩增产物送至上海生工生物工程股份有
限公司纯化并测序。序列提交至 GenBank 核酸序
列数据库并得到登录号，应用 Blast 程序对所测得
菌株 ITS-rDNA 序列进行相似性检索。采用
MEGA 5. 1软件进行多序列的比对，比对结果进行
系统发育分析。
2 结果与分析
2. 1 根腐病症状描述
芦荟根腐病主要危害根部和茎基部。初呈水渍
状病变，后褐色腐烂。主根腐烂或坏死，容易拔
出，由下往上发展，地上部由基部叶的边缘开始变
为红褐色，逐渐发展为全株叶片呈失水状柔软下
垂，叶片和茎干枯。严重时可导致植株萎蔫死亡
(图 1)。
301第 3 期 丁雅迪等:昆明芦荟根腐病病原菌的分离及鉴定
图 1 芦荟根腐病症状
Fig. 1 The symptoms of aloe root rot
2. 2 病原菌的分离及致病性测定
从芦荟病株根部分离得到 1 个菌株，而从健康
芦荟根段并未分离出此菌株，说明这个菌株是芦荟
病株特有菌株，命名为 YNLH06。经形态学观察这
个菌株初步鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxyspo-
rum)。将这株菌(YNLH06)进行致病性测定(表 1)，
对照组刺伤、无刺伤不接菌饼的根段均无病斑。刺
伤、无刺伤接种 YNLH06 菌饼的根段均有病斑，病
斑率分别为 94. 4 %和 66. 7 %，显示的根腐病症状
与初次分离病根发病情况相似，并从接种后发病部位
分离的病原菌与接种所用病原菌为同种病菌，符合
科赫法则，说明菌株 YNLH06为芦荟根腐病病原菌。
表 1 菌株 YNLH06 致病性测定
Tab. 1 Determination of pathogenic strains YNLH06
根段处理法
刺伤
接种病菌 对照
无刺伤
接种病菌 对照
接种位点数 18 18 18 18
病斑数 17 0 12 0
病斑率 /% 94. 4 0. 0 66. 7 0. 0
2. 3 菌落形态特征
在 PDA培养基上，菌落凸起，菌落初为白色、
粉红色，6 天后菌落中间逐渐变成紫红色，绒状角
变，正反面颜色差异较大，反面分泌紫色色素。菌
落高 3 ～ 5 mm，小型分生孢子较多，单胞或双胞，
卵圆形、肾脏形，大小 5 ～ 12 um × 2 ～ 3. 5 um;大
型分生孢子较少，多胞，多有 3 个分隔，镰刀形，
大小 19. 6 ～ 39. 4 um × 3. 5 ～ 5. 0 um;厚垣孢子球
形 (图 2)。参照真菌分类学［19］ 鉴定方法和
Booth［20］镰刀菌属的分类系统初步鉴定菌株 YN-
LH06 为尖孢镰刀菌。
图 2 病原菌菌落特征和菌丝体光学显微特征
注:A、B为在 PDA培养基的菌落形态 (正反面);C为小型分生孢子 (虚线箭头)及厚垣孢子 (实线箭头);
D为大型分生孢子 (实线箭头)
Fig. 2 Colony and mycelial microscopic characteristics of the pathogen
401 西 部 林 业 科 学 2015 年
图 3 菌株 YNLH06 的 rDNA ITS区段 PCＲ产物电泳结果
M:Marker;1 为菌株 YNLH06 的 rDNA ITS序列
PCＲ扩增结果
Fig. 3 Electrophoresis of PCＲ product of the rDNA ITS section
amplified from YNLH06 strain
2. 4 菌株 ITS区的 PCＲ扩增及序列测定
以引物 ITS1和 ITS4对 YNLH06菌株的 rDNA ITS
区段进行扩增，获得 PCＲ 产物约 545 bp (图 3)。
此序列已在 GenBank中注册，登录号为 KP267760。
2. 5 菌株系统发育树的分析
序列提交至 GenBank 进行 Blast 同源比对，选
取同源性较高的部分菌株序列通过 MEGA5. 1 构建
系统发育树，确定该菌株的种属地位 (图 4)。白
粉寄生孢菌 (Ampelomyces quisqualis)(HQ108042)
为外类群，从系统发育树中可以看出菌株 YNLH06
与尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)(KM005088、
KM005080、KC196121、JN859433、JN232195)在同一
系统发育分支，相似度为 100 %。该菌株与轮状镰刀
霉菌 (Fusarium verticillioides) (KM396284)、大刀镰
刀菌(Fusarium culmorum)(DQ453700、DQ450880)、马
铃薯枯萎病菌(Fusarium avenaceum)(KM189441)和腐
皮镰孢霉菌(Fusarium solani)(HQ905461)同源性分别
为 92. 2 %，90. 9 %，90. 1 %，86. 9 %，85. 2 %。进
一步判定菌株 YNLH06 为尖孢镰刀菌。
图 4 基于 rDNA-ITS序列构建菌株的系统发育树 (邻接法)
Fig. 4 Phylogenetic tree (Neighbor-joining Tree) inferred from the fungal rDNA ITS sequences
3 结论与讨论
3. 1 结论
从芦荟新鲜病株根中分离纯化出 1 个菌株 YN-
LH06，致病性测定其为芦荟根腐病病原菌，形态
结构观察结果表明其与尖孢镰刀菌的形态结构特征
相同;ITS序列分析表明，该菌株与尖孢镰刀菌在
同一系统发育分支，相似性为 100 %。因此认定尖
孢镰刀菌为芦荟根腐病病原菌。
3. 2 讨论
在致病性测定中，常采用灌根接种法［17］、蘸
根接种法［17］、根部切伤接种法［21］。但相较于上述
几种方法，离体根部接种法具有周期性短，便于观
察，成本低，不需培育幼苗就可观察到病原菌的致
病性等优势。离体根部接种法中，刺伤接菌的发病
率比无刺伤接菌的发病率高 27. 7 %。说明病原真
菌更容易通过伤口侵入植物。因此我们可以通过改
良芦荟培育方法对芦荟根腐病进行防治。
近年来研究发现根腐病普遍存在于大豆［22］、
豌豆［23］、芹菜［24］、黄芪［25］等作物中，并迅速蔓
延，有逐年恶化的趋势，对作物的生产造成致命的
危害。通常根腐病由多种病原菌复合侵染引起［26］，
已鉴定出的种类主要有，层出镰孢菌 (Fusarium
501第 3 期 丁雅迪等:昆明芦荟根腐病病原菌的分离及鉴定
proliferatum)、茄镰刀菌 (F. solani)、尖孢镰刀菌
(F. oxysporum )、立枯丝核菌 (Ｒhizoctonia solani)、
终极腐霉 (Pythium ultinum)、串珠镰孢霉 (F.
moniliforme)等［27 ～ 29］。芦荟的根腐病病原菌侵染
是否与其它植物根腐病病原菌的侵染情况一致，由
多种病原菌复合侵染引起，及这种复合侵染对芦荟
根腐病的影响效应。这些都有可能受到采样时间、
地点、生态环境并与升汞灭菌时间、所用培养基配
方等条件的限制，仍然有待于进一步反复摸索和不
断探究找出合理科学的研究方法。
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