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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(12):180-185
收稿日期 ：2015-03-16
基金项目 ：国家自然科学基金青年项目（41306128），国家自然科学基金面上项目（30271017）
作者简介 ：印翠，女，硕士研究生，研究方向 ：牙鲆生殖与发育 ；E-mail ：yincui082@163.com
通讯作者 ：施志仪，男，教授，博士生导师，研究方向 ：鱼类发育生物学 ；E-mail ：zyshi@shou.edu.cn
应用于 miRNA 靶标检测的双荧光素酶报告载体的
构建及鉴定
印翠  张俊玲  施志仪  孙文慧  孙近近
（上海海洋大学水产与生命学院 农业部淡水水产种质资源重点实验室，上海 201306）
摘 要 ： 以牙鲆空通气孔同源框 2 基因（empty spiracles homeobox 2，emx2）为例，构建包含 emx2 3UTR 区的野生型和突变
型双荧光素酶重组报告表达载体，以期应用于 miRNA 靶标的检测。利用 Trizol 法提取牙鲆成鱼精卵巢混合组织总 RNA，参照已
克隆出来的 emx2 基因 cDNA 序列，设计并合成 emx2 3UTR 片段的引物并进行 PCR 扩增，将得到的基因片段和 psiCHECK-2 载体
双酶切后，用 T4 DNA Ligase 酶进行连接反应，并转化入 DH5α 感受态细胞，筛选后得到野生型重组质粒 ；同时采用定点诱变法对
emx2 基因进行体外定点诱变并采用同样的方法形成突变型重组质粒。对野生型和突变型重组质粒进行双酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴
定及测序分析。成功克隆了 emx2 3UTR 区，并将 emx2 3UTR 区的 miRNA 靶点序列 GACTTGA 突变为 AGTCCAG，成功构建了野
生型和突变型包含 emx2 3UTR 区的 miRNA 靶标检测载体。通过 RT-PCR、基因重组及定点诱变技术成功构建了应用于 miRNA 靶
标验证的野生型和突变型双荧光素酶报告载体 psiCHECK-emx2-3UTR 和 psiCHECK-mutated-emx2-3UTR。
关键词 ： 牙鲆 ；miRNA ；emx2 ；定点诱变 ；psiCHECK-emx2-3UTR ；psiCHECK-mutated-emx2-3UTR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.12.026
The Construction and Identification of Dual-luciferase Reporter
Plasmids Used in miRNA Target Detection
Yin Cui Zhang Junling Shi Zhiyi Sun Wenhui Sun Jinjin
（Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources of Ministry of Agriculture，College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean
University，Shanghai 201306）
Abstract: Taking Paralichthys olivaceus empty spiracles homeobox 2（emx2）as an example, we constructed the wild-type and mutant
luciferase reporter plasmids containing emx2 3UTR region for being utilized in miRNA target detection. The total RNA was extracted from the
mixtures of testis and ovarian in adult fish with Trizol. Using previously-cloned cDNA sequences of emx2 as a reference, a pair of specific primers
for emx2 3UTR fragment were designed and synthetized, then amplified genes by RT-PCR and psiCHECK-2 vector were treated with double
restriction enzyme digestion, and then ligated with T4 DNA Ligase. The ligated fragment was transformed into the competent cells of DH5α, then
the wild-type recombinant plasmid were obtained by screening. In vitro site-directed mutagenesis of emx2 was carried out, and a site-directed
mutant plasmid was generated by the same methods. The results indicated that the emx2 3UTR of P. olivaceus was successfully cloned, and
GACTTGA, the sequence of miRNA target sites in it was mutated to AGTCCAG. The wild-type and mutant luciferase reporter plasmids used
in miRNA target detection were constructed successfully. In conclusion, with the techniques of RT-PCR, gene recombination and site-directed
mutagenesis, the wild-type luciferase reporter plasmids psiCHECK-emx2-3UTR and mutant one of psiCHECK-mutated-emx2-3UTR used in
miRNA target detection were successfully constructed, which lays the foundation for further researches on identification and function of miRNA
target emx2.
Key words: Paralichthys olivaceus ；miRNA ；emx2 ；site-directed mutagenesis ；psiCHECK-emx2-3UTR ；psiCHECK-mutated-
emx2-3UTR
2015,31(12) 181印翠等：应用于miRNA 靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定
MicroRNAs（miRNAs） 是 一 类 长 约 22 个 碱 基
的非编码单链小分子 RNA，普遍存在于各种生物
中［1-4］，通过与靶基因的 3 端非翻译区（3-UTR）
的互补结合［5，6］，进而诱导靶 mRNA 的切割降解、
翻译抑制等其他调节机制在转录后水平调控基因
表达［7］。已有报道表明，多达 30% 的基因成为了
miRNA 的潜在靶基因［8，9］，因而 miRNA 靶标的检
测逐渐成为研究 miRNA 功能的重要环节。全基因组
研究已经证实了 miRNA 在哺乳动物性腺的发育中起
着举足轻重的作用。我们先前已在牙鲆（Paralichthys
olivaceus）性腺中鉴定了 141 个成熟 miRNA，有些
miRNA 如 pol-miR-143、pol-let-7a 等在精卵巢中均有
较高表达，而一些 miRNA 如 pol-miR-26a、pol-miR-
26b 等则存在明显的性别差异表达［10］。在猪的卵巢
中，miR-26b 被报道可通过直接下调 ATM 基因的表
达而体外诱导颗粒细胞凋亡［11］。我们通过公共数据
库 TargetScan、PicTar 和 miRBase 等靶基因预测软件
发现，牙鲆空通气孔同源框 2 基因（Empty spiracles
homeobox 2，emx2） 的 3UTR 区 可 与 pol-mir-26a，
-26b 完全互补结合从而可能成为其靶基因。
emx2 基因是果蝇 ems（Empty spiracles）的同源
结构域基因，含同源转录因子，在果蝇头部的早期
发育过程中发挥重要作用。脊椎动物 emx2 位于同源
盒基因（Homeoticgenes，hox）家族的外侧，在哺乳
动物发育中的大脑表达并对端脑背侧、大脑皮层和
中枢神经系统发育起着关键作用［12-14］。近几年来有
研究者发现，哺乳动物 Emx2 基因在子宫内膜上皮
细胞中是一种必需的增殖抑制基因［15］；而在发育中
的泌尿生殖系统以及能形成排泄器官和生殖系统的
原基细胞中也有表达，并呈生殖周期性变化［16，17］。
缺乏 EMX2 可使老鼠患特纳综合症即性腺发育不完
全［18］。生殖周期中自然发生的 EMX2 表达下降对正
常的增殖、蜕膜化等都是必需的。目前，对此基因
在鱼类性腺发育中的功能及其与 miRNA 的关联研究
甚少。因此，本研究以牙鲆 emx2 基因为例，克隆了
emx2 3UTR 区，并对其潜在的 pol-miR-26a-26b 可能
结合位点，即 miRNA 识别靶 mRNA 的“种子序列”
进行定点诱变的基础上，构建野生型和突变型 emx2
基因 3UTR 双荧光素酶报告载体，旨在为后续研究
miRNA 通过调节 emx2 基因的表达而调控牙鲆性腺
发育的作用机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
Trizol Reagent（Invitrogen 公司，美国）；M-MLV、
Rnasin inhibitor、Dpn I 酶和 psiCHECKTM-2 靶标克隆
载体（Promega，美国）；DL2000、1 kb DNA Ladder
Marker、PrimeSTAR HS DNA-Polymerse、T4 DNA
Ligase、Not I、Xho I、TaKaRa TaqTM（TaKaRa 公司，
日本）；DNA 凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒
（DONGSHENG BIOTECH，中国）；E.coli DH5α 菌株
为本实验室保存。
1.2 方法
1.2.1 miRNA 靶点预测 根据先前我们已测序得
到的牙鲆 miRNA 和 emx2 基因序列，通过靶基因预
测 软 件 miRBase（http://www.mirbase.org/），PicTar
WEB INTERFACE（http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/
PicTar_vertebrate.cgi），TargetScanFish 6.2（http://www.
targetscan.org/fish_62/） 和 computer-based RNAhybrid
（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/
submission. html）等预测 miRNA 与其靶基因 3UTR
区结合位点。
1.2.2 牙鲆总 RNA 提取、反转录及 RT-PCR 钓取基
因 根据我们已克隆的牙鲆 emx2 基因序列设计 3
UTR 区引物，上下游引物 5 端分别携带 Xho I、NotI
酶切位点。用于构建野生型靶标克隆载体的引物为
3-emx2XhoIF ：5-CCGCTCGAGGAGGAAGGCTCGGA
GTCTCAG-3，3-emx2NotIR：5-ATAAGAATGCGGCC
GCGCATTTCTGTACATGGAATACGC-3。
取刚解剖完的牙鲆成鱼精卵巢混合组织 1 g，研
磨后采用 Trizol 法提取精卵巢混合组织总 RNA，并
将其反转录为 cDNA。以 cDNA 为模板，3-emx2Xho
IF、3-emx2NotIR 为引物，进行 PCR 扩增。PCR 反
应在 25 μL 反应体系中进行，包含 2.5 μL 2 mmol/L
dNTP mixture、2.5 μL 10×KOD buffer、1.5 μL 25
mmol/L MgSO4、1.5 μL cDNA、0.3 μL KOD PLus Neo、
17.1 μL ddH2O、上下游引物各 0.3 μL。PCR 扩增条
件为 ：94℃预变性 3 min ；98℃变性 15 s，58℃退火
15 s，68℃ 延伸 1.5 min，共 30 个循环。扩增完成后
取 5 μL 产物于 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12182
的特异性。
采用 DONGSHENG 公司的 DNA 凝胶回收试剂
盒，对上述目的片段进行回收。回收的目的片段与
pMD19-T 载体连接，蓝白斑筛选阳性克隆，提取质
粒，送上海生工生物工程技术有限公司测序鉴定。
1.2.3 野生型重组报告载体的构建 分别取野生
型 emx2 3UTR PCR 回收产物和 psiCHECK-2 载体各
15 μL，用 Xho I/Not I 双酶切，在 50 μL 的酶切体系
中加入 1.5 μL Xho I、1.5 μL Not I、5 μL 10×buffer、
27 μL ddH2O。37℃ 反 应 3 h 左 右。 酶 切 产 物 采 用
DONGSHENG 公司的 DNA 凝胶回收试剂盒进行回
收。在 10 μL 目的片段和载体的连接体系中加入
3 μL 酶切回收的 PCR 产物、2 μL 酶切回收的载体
psiCHECK-2、1 μL 10×Ligase Buffer、1 μL T4 DNA
Ligase、3 μL ddH2O。16℃连接 2 h，连接物转化到
DH5α 感受态细胞，将其涂布于含氨苄青霉素（100
μg/mL）的 LB 平板上，37℃生化培养箱培养过夜，
随机挑取若干阳性克隆于 3 mL LB 管中摇床过夜培
养后，采用 G-SHUN 高纯质粒小量提取试剂盒提取
质粒，获得野生型 psiCHECK-emx2-3UTR 重组质粒。
利用双酶切和测序对阳性重组质粒进行鉴定。
1.2.4 突变型重组报告载体的构建 根据 miRBase、
TargetScanFish 6.2、RNAhybrid 预 测 出 的 miRNA 与
其靶基因 3UTR 区的结合位点的序列，对其进行定
点突变，将 emx2 3UTR 中第 971 位碱基 GACTTGA
突变为 AGTCCAG。同时结合 Primer 5.0 和 Oligo 6 来
设计包含突变序列的引物，委托上海英骏公司合成。
引 物 序 列 为 ：mutemx2F ：5-GCACGCAGCCTTTCTG
TCAGAGTCCAGCCCTCCAGTGAAAGTTGCCAAG-3 ；
mutemx2R ：5-CTTGGCAACTTTCACTGGAGGGCTGG
ACTCTGACAGAAAGGCTGCGTGC-3。
以上述构建好的野生型重组报告载体 psiCHEC-
K-emx2-3UTR 的 阳 性 质 粒 为 模 板， 质 粒 稀 释 50
倍 后取 1 μL 做 模 板。 采 用 KOD Plus neo DNA
Polymerase 进行体外定点诱变。在 0.2 mL EP 管中
进行 RT-PCR 反应。在 25 μL 反应体系中加入 2.5 L
2 mmol/L dNTP mixture、2.5 μL 10×KOD buffer、1.5
μL 25 mmol/L MgSO4、1 μL cDNA、0.3 μL KOD PLus
Neo、16.6 μL ddH2O、上下游引物各 0.3 μL。PCR 扩
增 反 应 ：94℃ 预 变 性 3 min ；98℃ 变 性 15 s，58℃
15 s，68℃ 4 min 30 s，共 20 个循环。扩增完成后，
取 1 μL Dpn I 酶 37℃ 4 h 处理去除带甲基化的原始
模板链，取 1 μL Dpn I 酶处理的 DNA 转化到 DH5α
感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（100 μg/mL）的
LB 平板上，37℃生化培养箱培养过夜，随机挑取
若干阳性克隆于 3 mL LB 管中摇床过夜培养后，采
用 G-SHUN 高纯质粒小量提取试剂盒提取质粒，获
得突变型 psiCHECK-mutated-emx2-3UTR 重组质粒。
利用双酶切和测序对阳性重组质粒进行鉴定。
2 结果
2.1 miRNA靶点预测结果
为确定 emx2 与 miRNA 之间的关系，通过利用
4 种生物信息学软件（TargetScan、PicTar、miRBase
和 RNAhybrid）预测出牙鲆 emx2 是 pol-miR-26a 和
pol-miR-26b 的潜在靶基因，pol-miR-26a 和 -26b 与
emx2 结合位点图，见图 1。
2.2 靶标3UTR区克隆结果
采用 RT-PCR 法从牙鲆成鱼精卵巢混合组织中
成功扩增出 emx2 3UTR 长为 1 027 bp 的特异性扩增
条带（图 2）。与 pMD19-T 克隆载体连接后，对阳性
克隆进行酶切鉴定并进行 DNA 测序，结果显示，测
emx2
seed
C UCAGG
ACUUGA
UGAACU
U CUAA U
C
AGCCU UUCUG
UCGGA AGGAC
1624 bp
3 U˃TR: emx2
3˃ 5˃3˃5˃CDS: emx2AB pol-miR-26
A ：完整的编码区和 3UTR ；B ：pol-miR-26a 和 pol-miR-26b 的靶位点序列
图 1 牙鲆信使 RNA（mRNA）emx2 的序列鉴定
2015,31(12) 183印翠等：应用于miRNA 靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定
3 讨论
miRNA 通过与其靶基因结合从而调控靶基因的
表达。一些 miRNAs 通过下调它们作用的靶基因而
在哺乳动物性腺发育过程中发挥着重要作用，例如
已有报道称 miR-26b 通过直接下调其靶基因 ATM 可
在体外诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡 ；而且 miR-26b 的
过表达可诱导猪卵巢颗粒细胞的凋亡，在 miR-26b
的 mimic 转染组中颗粒细胞的 DNA 断裂显著上升［11］。
同样，在老鼠的卵巢中，mmu-miR-124 与精巢发育
重要基因 SOX9 直接结合。在原发性性腺细胞培养
中 mmu-miR-124 的 过 表 达 可 抑 制 SOX9 基 因 的 表
达［19］。Lin 等已详细阐述了 pol-miR-26 是性腺差异
表达的 miRNA［10，11，20］，而 Pellegrini 等发现 EMX2
调控哺乳动物性腺的发育［17，18，21］。为了研究在牙
鲆性腺发育中 pol-miR-26a、-26b 与 emx2 之间的相
互关系，本研究利用 TargetScan、PicTar 等软件成
功预测了 pol-miR-26a、-26b 的靶基因并从中选取了
性腺发育相关基因 emx2，同时预测出 pol-miR-26a、-
26b 与 emx2 的结合位点。在此基础上，本研究成功
克隆了牙鲆 emx2 3UTR 区，对其与 pol-miR-26a、-
26b 的结合位点进行了定点突变，从而构建了其野
生型和突变型的靶标报告载体。
根据罗师平等［22］的报道，盒式突变法、寡核
苷酸引物介导的定点突变法及重叠延伸聚合酶链反
应定点突变法等是比较常用的定点突变法。但与此
同时这些方法操作复杂，非特异性突变较多等，使
2000
bp bp
1027
M 1
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker ；1 ：emx2 PCR 扩增产物
图 2 牙鲆 emx2 3UTR 的克隆
序所得序列与已知序列一致。
2.3 野生型和突变型重组报告载体的鉴定
将 构 建 的 野 生 型 psiCHECK-emx2-3UTR 和 突
变型 psiCHECK-mutated-emx2-3UTR 重组报告载体，
用 Xho I/Not I 双酶切阳性克隆，得到线性质粒和
emx2 3UTR 区基因片段，经电泳分析（图 3）显示，
大小分别约为 6 000 bp 和 1 000 bp，与空质粒和牙
鲆 emx2 3UTR 基因大小一致。而图 4 的泳道 1（大
小位于 6 000-7 000 bp 之间）与图 3 泳道 1 大小接
近，表明野生型和突变型重组报告载体均构建成功。
2000
bp bp
M1 1 2 M2
1000
10000
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
500
750
500
250
100
M1 ：DL2000 DNA Marker ；1，2 ：分别为野生型 emx2 的质粒与酶切产物 ；
M2 ：1 kb DNA Marker
图 3 野生型重组质粒的双酶切验证
10000
bp
1M
8000
6000
5000
4000
3000
2000
1500
1000
M ：1 kb DNA Marker ；1 ：突变型质粒 PCR 产物
图 4 突变型重组质粒的 PCR 验证
2.4 定点突变结果
野生型和突变型质粒测序结果经 BLAST 分析表
明定点突变成功，即 emx2 3UTR 区 miRNA 识别“种
子序列”GACTTGA 突变为 AGTCCAG。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.12184
定点突变的实验受到一定阻力。本研究中采用了一
种简便、快速、准确经济的基因定点突变的方法。
它非常巧妙地抓住了甲基化的模板质粒对 Dpn I 酶
十分敏感，而合成的突变质粒对 Dpn I 酶切不敏感
这一特性，通过酶切去除模板质粒，只得到突变质粒，
使之操作准确无误。此外，本研究所采用的 KOD
Plus neo DNA Polymerase 是公认最好的高保真高效率
高速的 PCR 酶之一（保真性约为 Taq 酶的 80 倍），
能快速高效的避免延伸过程中不必要的错配。本研
究采用低次数的循环延伸而非聚合酶链反应，有助
于减少无意错配。整个突变只需 20 个循环、1 次
Dpn I 酶切和 1 次转化就完成了定点突变，突变成功
率较高，尤其适于 DH5α 来源的 DNA。无需进行亚
克隆，也无需对 PCR 产物进行末端处理等，大大减
少了上述传统点突变的工作量，因而本研究通过该
种定点突变，成功将 emx2 3UTR 区 miRNA 识别“种
子序列”GACTTGA 突变为 AGTCCAG。
实验采用的靶标克隆载体 psiCHECK-2 载体［23］
是目前使用较多的靶标克隆载体，它可将 RNAi 与
荧光素酶发光相偶联，如本研究中将 RNAi 的靶片
段（emx2 3UTR 区）插入到海肾荧光素酶 hRluc 下
游的多克隆位点中 ；当 RNAi 有效时，转录的荧光
素酶 RNA 被降解，无发光反应 ；当 RNAi 无效时，
转录的荧光素酶 RNA 被翻译成荧光素并参与发光反
应，通过检测发光即可反应 RNAi 的效果。双报告
基因用于实验系统，通常一个报告基因用于内对照，
使另一个报告基因的检测均一化。此前使用萤火虫
荧光素酶可结合 β-半乳糖苷酶（β-Gal）、葡萄醛酸
糖苷酶（GUS）或氯霉素乙酰转移酶（CAT）等作
为双报告基因，但 β-Gal、CAT 等检测方式复杂、可
检测范围和灵敏度均较差，不是理想的内参。本研
究应用的 psiCHECK-2 载体，以海肾荧光素酶作为
主要报告基因，还引入一个萤火虫荧光素酶表达归
一化，二者反应都为发光反应，检测方式一致、检
测范围和灵敏度相近，且二者发光反应的底物不同，
不会相互影响，是目前理想的双报告基因系统。此
外，psiCHECK-2 载体含有单纯疱疹病毒胸苷激酶启
动子（HSV-TK）、多聚腺苷酸加尾信号［SV40 Late
poly（A）］和质粒所需的其他组成部分，可在哺乳
动物细胞中稳定高表达外源插入片段，是目前研究
miRNA 与 mRNA 功能较为理想的表达载体。
4 结论
本研究运用 RT-PCR、基因重组和定点突变技
术成功构建了牙鲆 emx2 基因的野生型（psiCHECK-
emx2-3UTR） 和 突 变 型（psiCHECK-mutated-emx2-
3UTR）双荧光素酶报告载体 , 为检测牙鲆 emx2 基因
与 miRNA 间的作用关系奠定了基础。。
参 考 文 献
［1］Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of
ケਈර761䟾⭏ර721ケਈර820䟾⭏ර781ケਈර880䟾⭏ර841ケਈර940䟾⭏ර901ケਈර999䟾⭏ර960ケਈර1059䟾⭏ර1019
819
780
879
840
939
900
998
959
1058
1018
mutant emx2 3 -˃UTR⍻ᒿ㔃᷌
emx2 3 -˃UTRᒿࡇ10671027
图 5 野生型与突变型质粒的比对结果
2015,31(12) 185印翠等：应用于miRNA 靶标检测的双荧光素酶报告载体的构建及鉴定
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（责任编辑 马鑫）