全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第1期
收稿日期 : 2011-07-12
基金项目 : 国家科技支撑计划项目（2007BAD45B06）, 海南省自然科学基金项目（30824）, 中央级公益性科研院所基本科研业务费专项
（2011PZS067）, 广东省自然科学基金项目（000162）
作者简介 : 任羽 , 男 , 硕士 , 副研究员 , 研究方向 : 热带花卉遗传育种和生物技术 ; E-mail: ry_hn@yahoo.com.cn
DNA 标记以其数量多、多态性高、可直接反映
生物基因组多态性等优点，目前已被广泛应用于遗
传多样性分析、连锁图谱构建、重要性状基因标记
及标记辅助选择等方面，在植物遗传育种和基因组
研究中发挥着越来越重要的作用。通过锚定生物基
因组中不同种类的位点或序列，采用一定的检测手
段，目前已发展出了多种 DNA 标记技术。如限制性
片段长度多态性（restriction fragment length polymorp
hism, RFLP）［1］、扩增片段长度多态性（amplified frag
ment length polymorphism, AFLP）［2］、切割 AFLP（cle
aved AFLP，cAFLP）［3］等锚定的是基因组上的限制
性位点，分别采用特定的方法检测这些位点上存在
的多态性 ；简单重复序列多态性（simple sequence
repeat，SSR）锚定的则是基因组上的简单重复序列，
检测其因重复次数不同产生的多态性［4］；相关序列
扩增多态性（sequence-related amplified polymorphism，
SRAP）［5］、 目 标 区 域 扩 增 多 态 性（target region
amplified polymorphism，TRAP）［6］锚定的是基因编
码区，因启动子或内含子差异产生的多态性标记 ；
反 转 录 转 座 子 间 扩 增 多 态 性（inter-retrotransposon
amplified polymorphism，IRAP）则锚定反转录转座
子，通过 PCR 扩增检测它们之间 DNA 片段长度多
态性［7］。
限制性内切酶识别位点（简称限制性位点）在
生物基因组上分布广泛。基于限制性位点，科学家
们首先创建了 RFLP 标记，该标记技术采用克隆的
RSAP 分子标记技术在园艺植物研究中的应用
任羽1 王得元2 黄少华1 徐世松1 张志群1
（1中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所，儋州 571737 ；2广东省农业科学院蔬菜研究所，广州 510640）
摘 要： 限制性位点扩增多态性（RSAP）是一种基于 PCR 的新型植物分子标记技术，具有操作简便、结果稳定、效率较高
的特点。该技术以植物基因组上广泛分布的限制性位点位为靶标，通过独特的引物设计和 PCR 扩增程序，无需限制性酶切环节，
只要一个简单的 PCR，即可产生基于植物限制性位点的多态性标记。阐述了 RSAP 的原理与流程，对该技术的优势和应用情况做
了总结，并对其前景进行了展望。
关键词： 园艺植物 限制性位点扩增多态性（ RSAP） 分子标记
RSAP Molecular Marker Technique and Its Application of
Horticulture Plants
Ren Yu1 Wang Deyuan2 Huang Shaohua1 Xu Shisong1 Zhang Zhiqun1
（1Tropical Crops Genetic Resources Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Danzhou 571737 ；2Vegetable Institute,
Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640）
Abstract: Restriction site amplified polymorphism（RSAP） , a novel PCR-based plant marker technique, features easy, reliability, and
efficient characteristic. Targeted to restriction sites dispersed among plant genomes, RSAP adopted unique primer design and PCR procedure to
generate polymorphic markers at restriction sites, without restricted enzyme digesting. This paper describesd the principle and protocol of RSAP,
analyses the advantage and the application of RSAP marker technique, and discusses the prospect of this technique.
Key words: Horticulture Plants Restriction site amplified polymorphism（RSAP） Molecular marker
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期38
cDNA 或基因组探针，通过 Southern 杂交来检测限
制性位点之间的多态性，具有稳定可靠、共显性等
优点，但由于检测 RFLPs 的 Southern 杂交耗时费力，
使其广泛应用受到一定限制［1］。AFLP 结合了限制
性酶切的可靠性和 PCR 操作的简便性，采用衔接子
和对应引物，避开对序列信息的依赖来检测限制性
位点的多态性，具有较高的产率，成为目前被广泛
应用的 DNA 标记技术之一。但该技术存在程序复
杂、步骤繁多等不足，整个过程包括了基因组 DNA
或 cDNA 的酶切，寡核苷酸衔接子的连接，连接片
段的选择性扩增等，其中 DNA 的不完全酶切还会导
致检测时带型不一致，影响 AFLP 指纹分析的准确
性 ；当采用甲基化敏感的内切酶时，基因组的甲基
化又会导致假多态性出现［2］。随后一些研究者分别
对 AFLP 进行了不同程度的改良，如 TE-AFLP［8］,
cAFLP［3］，这些技术虽然不同程度地或增加了检出
的多态性或简化了步骤，但仍离不开限制性内切酶
酶切和随后的复杂步骤。
针对目前基于限制性内切酶识别位点的各种分
子标记技术在操作中存在的问题，杜晓华等［9］开发
出了一种新型基于限制性内切酶识别位点的分子标
记技术——限制性位点扩增多态性（restriction site
amplified polymorphism, RSAP）标记技术。基于限制
性位点，该标记技术采用独特的引物设计和 PCR 扩
增程序，无需限制性酶切及其他复杂步骤，仅一个
简单 PCR 即可实现对限制性位点多态性的检测。目
前，RSAP 标记技术已成功地应用于辣椒自交系遗传
距离估算、辣椒遗传连锁图谱构建、产量相关性状
的 QTL 定位和辣椒株高的动态 QTL 分析，并在苦瓜
和水稻上也得到了成功扩增。
1 原理
RSAP 的原理是利用生物基因组上广泛分布的
限制性位点，通过引物与模板的模糊匹配，扩增产
生多态性标记。该技术采用 2 条长度均为 18 个碱基
的引物，引物的 3 端为 4-6 个碱基的限制性酶切位
点序列，接着是 12-14 个碱基的随机序列，2 条引
物分别采用不同的限制性位点和随机序列。PCR 扩
增开始采用较低的退火温度（35℃），使引物通过模
糊匹配与模板结合，经过 5 个循环扩增，即可认为
引物 5 端 12-14 个碱基的随机序列已与模板结合 ；
随后在较高的退火温度（48℃）下进行 35 个循环，
可保证扩增的特异性和结果的稳定性［9］。RSAP 通
过对 2 个不同限制性位点之间 DNA 片段的扩增，产
生基于限制性位点多态性的分子标记。
2 技术流程
2.1 引物的设计
采用 2 条长度均为 18 个碱基的引物。引物的 3
端为 4-6 个碱基的限制性位点序列，接着是 12-14
个碱基的随机序列，结构组成即为 12-14 bp 的随机
序列＋某限制性内切酶识别位点（4-6 bp）；张明科
等［10］对引物进行了重新设计，在其 3 端增加 3 个
选择性碱基，5 端设计为 10-12 个碱基的随机序列，
设计了 14 条长为 19 bp 的限制性位点扩增多态性
（RSAP） 新引物，其扩增出的条带的多态性、稳定性、
重复性更好。2 条引物的限制性位点和随机序列须
不同。引物的设计同时需遵循一般的引物设计原则，
即 40％－ 50％的 G+C 含量，不形成发夹或其他二
级结构。
2.2 PCR扩增
首 先 94 ℃ 变 性 5 min， 然 后 进 行 5 个 循 环 的
PCR 扩增（94℃ 变性 1 min，35℃退火 1 min，72℃
延伸 1 min），而后再进行 35 个循环的 PCR 扩增（94℃
变性 1 min， 48℃退火 1 min，72℃延伸 1 min），最
后 72℃延伸 10 min。开始 5 个循环 PCR 扩增采用非
严谨退火温度，允许一些错配，便于引物与靶 DNA
的结合，后 35 个循环 PCR 扩增采用严谨退火温度，
保证了扩增产物的特异性。扩增产物采用 6% 的变
性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染检测。
3 RSAP 技术的优势
3.1 操作简单
RSAP 标记技术是一个基于 PCR 的标记技术，
引物设计简便，整个操作流程简单，只需一个简单
PCR 即可完成［9］。因此，它具有 RAPD，SRAP 等
技术操作简单、易于建立的特点。
3.2 重复性好
对于易于建立的分子标记，其重复性是倍受关
注的问题，某种程度上重复性的好坏决定了该分子
2012年第1期 39任羽等 ：RSAP 分子标记技术在园艺植物研究中的应用
标记技术的应用潜能。RSAP 技术使用了 18 个碱基
的较长引物（RAPD 仅为 9-10 个碱基）和较高的退
火温度（后 35 个循环 48℃，RAPD 为 36℃），理论
上应该具有较好的重复性。杜晓华［9］以不同辣椒自
交系为材料，分别采用 2 个以上不同的 RSAP 引物
组合，在不同时间进行扩增，2 次扩增谱带图完全
一致，这说明在实践中 RSAP 技术可获得良好的重
复性。
3.3 效率高
经多次应用研究和在多种作物上的试验，RSAP
标记技术在大多数情况下，可在一个 PCR 反应中
扩增出多达 50 个以上的可统计片段，片段大小在
50-1 000 bp 之间，可与 AFLP 的扩增谱带图相媲美。
杜晓华等［11］ 通过将 RSAP 应用于辣椒（Capsicum
annuum var. longum）优良自交系遗传距离估计中发
现，在遗传关系较为狭窄的 10 个尖椒自交系中，41
对引物组合可扩增出 2 121 个条带，其中多态性条
带为 538 个，平均每对引物组合产生 51 个条带，多
态性条带数为 13 个。在辣椒长椒变种（C. annuum
var. longum）内连锁图谱构建中，24 对 RSAP 引物
组合，共得到 94 条多态性条带，平均每个引物组合
产生 3.96 个多态性条带。
3.3 基因组分布广泛
限制性位点在生物基因组上的分布较为广泛，
不仅存在于基因编码区，而且也存在于重复区等基
因组的其他区域［12］，因此与 SRAP，TRAP 仅揭示
基因编码区的多态性［5, 6］、SSR 仅反映高度重复区多
态性［4］相比，RSAP 对基因组多态性的反映更为全面。
与以上几种标记单独使用相比，当用来进行遗传多
样性分析时，RSAP 对基因组差异的反映会更全面 ；
若用作图谱构建，RSAP 标记在染色体上的分布会更
均匀。
4 RSAP 技术的应用
4.1 构建遗传图谱
RSAP 技术操作简便，重复性好，多态性丰富，
效率高，基因组分布广泛，是遗传图谱构建的理想
分子标记。杜晓华［12］将 RSAP 技术应用到辣椒分子
图谱的构建上，以长椒类的 2 个自交系为亲本（P1
为亚蔬中心 PBC830，P2 为广州当地的地方品种）
杂交产生的 93 株 F2 代为材料，依据 10 个限制性位
点设计合成了 10 条 RSAP 引物，组成引物对，24 个
PCR 反应中产生了 94 条多态性条带，其中 35 个被
定位在 8 个连锁群上。
4.2 重要性状的QTL定位
对控制重要农艺性状的基因进行标记和定位，
是实现作物标记辅助选择育种和基因的图位克隆的
重要步骤。杜晓华［12］ 利用 RSAP 标记技术，在构建
了辣椒的种内遗传图谱基础上，结合表型统计，成
功实现了辣椒 15 个产量相关性状的 QTL 定位。共
鉴定出了 15 个性状的 49 个 QTL，其中 6 个性状鉴
定出了效应超过 40% 的主效 QTL。同时，基于所
构建的辣椒种内图谱，结合不同生长时期株高的表
型数据，进行了辣椒株高的动态 QTL 分析，获得了
不同生长时期株高的 11 个非条件和 QTL 6 个条件
QTL。
4.3 种质资源的多样性研究
借助分子标记揭示种质材料之间 DNA 水平上的
遗传差异，可为生物遗传多样性研究和杂交育种提
供重要的参考。RSAP 标记检测的限制性位点多态性
在基因组中的分布较为广泛，因此对基因组遗传差
异的反映较为全面，更适合遗传多样性的研究。杜
晓华等［11］采用 RSAP 技术分析了 10 份辣椒自交系
之间的遗传距离，10 个引物在 41 个 PCR 反应中扩
增出 2 121 个条带，其中多态性条带为 538 个。用
RSAP 标记数据建立的系统分类树与采用 SRAP 和
SSR 联合建立的分类结果有较高的相似性，依据其
估计的遗传距离预测的杂种优势与育种实践相吻合。
乔利仙等［13］利用所建立的适合于紫菜 RSAP 分析的
PCR 反应体系和反应条件，使用 30 对引物对 15 个
紫菜系 DNA 进行了 PCR 扩增，经过 3 次重复验证，
有 12 对引物能够扩增出清晰且稳定的条带。这 12
对引物共扩增出 413 条带，其中 408 条为多态性条
带，多态性比例 96% ，平均每对引物产生 34 条多
态性条带，片段大小在 50-500 bp 之间。利用这 413
条带进行聚类分析，产生了这 15 个紫菜系的进化
树。15 个紫菜系在 0. 69 相似系数水平上分为两大类：
一类包括坛紫菜 ；另一类包括条斑紫菜和少精紫菜。
选 2 对引物 R1/R6 和 R3/R4 所扩增的 10 条稳定且
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第1期40
重复性好的条带，构建了这 15 个紫菜系的 RSAP-
DNA 指纹图谱。在该指纹图谱中，每个紫菜系都有
其独一无二的指纹模式 , 能够很容易地与其他紫菜
系相区分。
4.4 品种鉴定
商品化生产（种子、特别是杂交种子等的生产）
需要新品种保护权的保护，品种的国际登录需要对
品种的鉴定和确认，因为通过外部形态无法辨认的
品种通过分子标记迎刃而解。而分子标记检测杂交
种子纯度已经成为快速有效的种子质量检测方法。
刘泽发等［14］ 应用 SRAP 标记和 RSAP 标记对印度南
瓜品种杂交种子纯度进行鉴定试验。结果表明 , 筛
选出的引物 E1M5 和 R1R7 可较好地区分出红栗二
号、红栗、锦栗二号和锦栗南瓜 , 利用 RSAP 分子标
记 R1R7 可检测出锦栗杂交种子纯度 , 分子标记检测
结果与田间检测结果吻合率达到 90%。
5 展望
综上所述，RSAP 标记技术是一个简单、高效、
适用性较广的一种分子标记技术，已经在植物的多
种研究中成功应用。它适用于包括图谱构建、基因
QTL 定位、种质资源的多样性研究、品种鉴定和标
记辅助选择育种等多种研究目的。RSAP 标记技术
不但具有 RAPD 技术的易于操作［15］的特点，而且
具有 AFLP 技术强大功能［2］的优势。从操作步骤
上讲，RSAP 技术是 AFLP 的极大简化 ；从对基因
组多态性检测的区域上讲，RSAP 比 SRAP、TRAP、
SSR 等单独使用覆盖面更广，在遗传多样性研究和
图谱构建中具有一定的比较优势。此外，RSAP 一
次检测位点多，操作简便，从而降低了每次分析的
成本，具有一定的推广应用价值。随着 RSAP 标记
的推广应用，将进一步推动园艺植物遗传育种和基
因组研究的发展。
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（责任编辑 李楠）