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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第8期
大豆的遗传转化研究因基因型依赖性强、构建
再生体系较难等原因，使其转化率较低［1，2］。目前
大豆遗传转化方法主要有农杆菌介导法、花粉管通
道法、子房注射法、基因枪法、真空抽滤法等，其
中农杆菌介导法和基因枪法应用较多。自 1983 年
Pederson［3］等证明了大豆可作为农杆菌的合适宿主
后，农杆菌介导法得到了广泛应用，但仍存在明显
的基因型依赖性。在农杆菌介导法中，可以对大豆
的不同生长时期不同生长部位进行侵染，比如子叶
节、胚尖、未成熟胚、下胚轴、生长点等部位均可
收稿日期 ： 2013-03-05
基金项目 ：国家高技术研究发展计划“863”项目（2012AA101106）
作者简介 ：刘志敏，女，硕士研究生，研究方向 ：大豆分子育种 ；E-mail ：zhimin2005104@126.com
通讯作者 ：郭蓓，女，教授，研究方向 ：植物分子遗传育种 ；E-mail ：guobeibac@tom.com
农杆菌介导的大豆萌发种子转化技术
刘志敏1  熊鹤雯1  谢皓1  秦玉涛2  赵嫣然2  郭蓓2
（1. 北京农学院植物科学技术学院，北京 102206 ；2. 北京农学院生物科学与工程学院，北京 102206）
摘 要 ： 采用农杆菌介导的萌发种子侵染法，开展大豆遗传转化技术研究。以萌发大豆的生长点、子叶节、下胚轴 3 处为
外植体，将带有抗除草剂草甘膦基因 EPSPS 及草丁膦抗性筛选基因 Bar 的质粒借助农杆菌介导转入大豆中，通过共培养及盆栽种
植获得转化体。经过对 T0 代和 T1 代植株进行双重 PCR 检测以及两种除草剂的抗性鉴定得到转基因阳性株。试验结果表明，通过
农杆菌介导的萌发种子转化法已将抗两种除草剂基因成功的转入大豆中，其综合转化率约为 0.37%。
关键词 ： 农杆菌 萌发种子 大豆 遗传转化
The Technique for Agrobacterium-mediated Transformation via
Germinating Seeds of Soybean
Liu Zhimin1 Xiong Hewen1 Xie Hao1 Qin Yutao2 Zhao Yanran2 Guo Bei2
（1. College of Plant Science and Technology，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206 ；2. College of Biological Science and
Engineering，Beijing University of Agriculture，Beijing 102206）
Abstract:  Germination seeds were used to research the genetic transformation technology of Agrobacterium-mediated in soybean. The
growing point, cotyledon node and hypocotyl of germination seed were used as explants, and the plasmid that carried with the resistance to
the herbicide glyphosate gene EPSPS and glufosinate resistance screening gene Bar was transferred to soybean by Agrobacterium-mediated.
Transformants were obtained by co-culture and potted plant growing. After the double PCR detection as well as the two herbicide resistance
identification of transgenic T0 and T1 plants, the positive strains were acquired. The experiment results showed that two genes resistance to
herbicides have been successfully transferred to soybean via germinated seeds by Agrobacterium-mediated transformation method, with the
transformation rate of approximately 0.37%.
Key words:  Agrobacterium Germinating seed Soybean Transformation
作为外植体进行遗传转化。其中以子叶节法和胚尖
法被广泛地应用，前者获得的植株嵌合体相对较少，
但对操作技巧有一定要求，转化率低，后期筛选工
作量较大 ；后者转化率相对较高，但嵌合体较多 ；
而未成熟胚和下胚轴两种方法由于转化率低未得到
广泛的应用。
利用大豆生长点转化的方法始于 Chee 等［4］，
称为萌发种子侵染法或微注射法。这种方法是以萌
发大豆的生长点、子叶节、下胚轴三处为外植体，
形成伤口后进行农杆菌侵染，然后种植在土壤中进
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期84
行后续筛选试验。此方法可以在短期内形成生根的
植株，不可育植株少，外植体来源不受时间限制，
可免去组织培养等复杂的操作，同时不需要在转化
之前建立植株再生体系。近年来在多种植物转化中
都有尝试，其中在豆科植物中也有应用［5-8］。
本研究以大豆品种中黄 10、中品 661 及北农
103 为材料，通过萌发种子法对大豆进行转抗除草
剂基因的研究，并对该方法做适当改进，以期建立
一个相对简便和高效的大豆遗传转化体系，对改善
大豆转化困难的现状进行有益的尝试。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 植物材料及试剂 大豆品种中黄 10 、中品
661 由中国农业科学院作物科学研究所提供 ；北
农 103 来自北京农学院 ；壮观霉素（spectinomycn，
Spec） 购 自 Inalco 公 司 ；链 霉 素（streptomycin，
Strep） 购 自 Amresco 公 司 ；利 福 平（rifampicin，
Rif）、 草 甘 膦（glyphosate） 和 草 丁 膦（glufosinate）
购自 Sigma 公司。
1.1.2 载体及菌株 载体质粒（带有抗除草剂草甘
膦基因 EPSPS 及草丁膦抗性筛选基因 Bar）由中国
农业科学院作物科学研究所邱丽娟研究员惠赠 ；大
肠杆菌菌株 JM109 和农杆菌菌株 EHA105 为本实验
室留存。
1.2 方法
1.2.1 外植体的制备 大豆种子消毒与萌发 ：挑选
数粒表面光滑无菌斑的成熟的大豆种子，置于干净
的培养皿中，先用 75% 酒精进行表面消毒，用纸
擦干后，将其放在干燥器中，使用氯气灭菌法（25
mL 次氯酸钠溶液加 1 mL 浓盐酸）［10］灭菌 24 h。将
灭菌后的大豆种子用无菌水浸泡 15 min，去除表面
离子，放入盛有无菌水浸湿滤纸的培养皿中，暗
培 养 24 h， 培 养 温 度 25-28 ℃， 光 照 强 度 为 150
μmol·m-2· s-1。
制备外植体 ：将萌发的大豆种子除去种皮，在
不伤害胚芽的前提下，把两片子叶小心分开，胚轴
连着的胚根被一分为二，连在子叶上，保留带有胚
芽的那片子叶，把生长点、子叶节及二者连接处用
刀尖轻轻划伤口，以备侵染。
1.2.2 工程菌制备 大肠杆菌转化及质粒提取 ：利
用热激转化法将质粒转入大肠杆菌菌株 JM109 中，
挑取单克隆，PCR 检测，将阳性单克隆扩大培养，
使 OD600 值达到 1.0 以上，提取质粒。农杆菌转化
及制备 ：利用电激转化法［11，12］ 将上述质粒转入
农杆菌菌株 EHA105 中，接种于 YEP 固体培养基
（50 mg/L Rif、50 mg/L Spec、50 mg/L Strep）上暗培
养 36-48 h，挑取单克隆接种于 5 mL 加有相应抗生
素的液体培养基中，28℃恒温振荡培养 12 h（150
r/min），使菌种达到饱和状态。之后将培养好的菌液
以 1∶50 转移至新鲜的 YEP 液体培养基中，活化培
养 6-8 h，使 OD600 值达到 0.6-0.8 之间，用于侵染。
1.2.3 侵染及共培养 将上述菌液用微量注射器注
射到外植体伤口中去，之后将外植体置于共培养基
（B5）上，于培养室中暗培养 3 d。
1.2.4 盆栽培养 将外植体上的农杆菌洗净，转移
到花盆中，其土壤成分比例为草炭土∶营养土∶蛭
石 =1∶1∶1，前期用保鲜膜罩盖。后期定时浇水，
每两周浇灌一次营养液。
1.2.5 转基因植株的 PCR 检测 使用 CTAB 法提取
转基因植株幼嫩叶片的 DNA 进行 PCR 检测［13］。反
应 体 系（20 μL）：ddH2O 9.6 μL，10×buffer 2 μL，
25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.6 μL，引
物各 2 μL，模板 DNA 1 μL（50-100 ng），Taq 酶 0.2
μL（5 U/μL）。反应程序 ：95℃预变性 5 min ；94℃
变性 30 s，62℃退火 45 s，72℃延伸 1 min，30 个循
环 ；72℃延伸 10 min ；4℃保温。反应产物用 1% 的
琼脂糖凝胶电泳检测。
用于检测 Bar 基因的引物为 BarFwd ：5-CAA-
TCCTCGAGTCTACCATGAGCCCAGAAC-3 ；BarRev ：
5-GAATCCTCGAGTCAAATCTCGGTGACGGGCA-3，
扩增片段约为 510 bp。用于检测 EPSPS 基因的引物
为 EP-F2 ：5-GTGTTAGAGCTACTGCCTCCG-3 ；EP-
R2 ：5-AGCTCAGCTCTGGTGTCAGAG-3，扩增片段
约为 430 bp。
1.2.6 植株除草剂抗性检测 首先以 Bar 基因为筛
选基因。由于 Bar 基因编码的草丁膦乙酰转移酶
（PAT）对草丁膦有很高的专一性，因此可在植株叶
面上直接涂抹草丁膦进行筛选［9］。对 PCR 检测阳性
植株的叶片涂抹草丁膦，观察结果。为了能够明显
2013年第8期 85刘志敏等 ：农杆菌介导的大豆萌发种子转化技术
看出抗性效果，对叶片分半涂抹，只涂抹有标记的
半片叶片。为进一步检测转基因植株的除草剂抗性，
对 PCR 阳性的抗草丁膦的 T1 代植株再进行草甘膦
（41%）喷施。
2 结果
2.1 大豆萌发种子转化过程
首先选用约 300 粒大豆品种中黄 10 为转化受
体，分批侵染、培养、种植，对存活的 T0 代植株进
行 EPSPS 及 Bar 双基因 PCR 检测，阳性植株继续进
行草丁膦抗性鉴定，通过筛选得到的抗性阳性株，
继续培育至结实，收获种子（图 1）。种植 T1 代植株，
继续做 PCR 双重检测以及两种除草剂抗性的检测，
以观察目标性状是否能够稳定遗传。试验后期又选
用了中品 661 和北农 103 两个品种为转化受体，鉴
别该方法是否存在基因型依赖性。
对 T0 代提取幼嫩叶片 DNA 的 PCR 检测阳性率为
11.3%。继续对阳性株进行草丁膦抗性检测，具有抗
性的比例为 41.9%。综合 PCR 和草丁膦抗性的试验
结果得到阳性比例为 4.8%。
为了验证转基因的遗传稳定性，把收获的 T0 代
种子（PCR 检测阳性，同时具有草丁膦抗性）播种
培育得到 T1 代，对 T1 代植株的幼嫩叶片提取 DNA，
再次进行 Bar 基因及 EPSPS 基因的双重 PCR 检测
（图 3），同时对叶片继续进行除草剂抗性试验，找
出 PCR 检测为阳性且具有除草剂抗性植株，最终转
化率为 0.37%。
A B C D
A ：外植体制备 ；B ：共培养 3 d 后的外植体 ；C ：幼苗 ；D ：结实
图 1 大豆萌发种子转化法过程
2.2 PCR检测结果及转化率
对转化后的存活株进行 Bar 基因及 EPSPS 基因
的双重 PCR 检测（图 2），获得的阳性植株记为 T0 代。
其中种子萌发率为 92.5%，转化成活率为 51.6%，
M + 1 2 3 WT 
750
bp
500
M + 1 2 3 WT 
750
bp
500
A
B
M ：DNA marker DL2000 ；＋ ：阳性对照 ；1-3 ：T0 代样品 ；
WT ：野生型 ；- ：阴性对照
图 2 T0 代 植 株 Bar 基 因（A） 和 EPSPS 基 因（B）
的 PCR 鉴定结果
M + 1 2 3 WT 
750
bp
500
M + 1 2 3 WT 
750
bp
500
A
B
M ：DNA marker DL2000 ；＋ ：阳性对照 ；1-3 ：T0 代样品 ；
WT ：野生型 ；- ：阴性对照
图 3 T1 代植株 Bar 基因（A）和 EPSPS 基因（B）的
PCR 鉴定结果
2.3 除草剂处理
首先在野生型大豆上涂抹不同浓度的草丁膦，
从而确定大豆的草丁膦适宜鉴定浓度为 135 mg/L。
同时对 T0 代转化体和野生型植株的一半叶片涂抹
135 mg/L 草丁膦。1 周后，转化体维持正常状态（图
4-B），而野生型大豆叶片开始变黄（图 4-A）；一段
时间后，野生型植株整株都枯黄，而转基因植株基
本没有发生变化（图 5）。为了验证转基因表现的稳
定性，对 T1 代的 PCR 检测阳性植株依然进行草丁
膦检测，得到与 T0 代相似的结果（图 4-C、D）。为
了进一步明确转基因植株的抗除草剂能力，对草丁
膦抗性植株的叶片继续喷施草甘膦，部分植株依然
维持抗性（图 4-F）。由此可以初步确定已将 EPSPS
基因及 Bar 基因成功的转入大豆植株中。
3 讨论
经过反复试验后发现，萌发无菌大豆的时间以
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第8期86
24 h 左右为宜，时间过长将会使胚芽从子叶上脱离，
没有子叶提供营养会导致受伤的胚芽无法成活 ；但
也不宜时间太短，胚芽过分幼嫩不利于操作。制备
外植体时，要格外小心，此过程很容易因操作手法
不当而对外植体产生伤害，如子叶完全切掉，胚根
碰断，去除种皮时一片子叶断裂等。由于侵染涉及
多个部位（生长点，子叶节，下胚轴），对外植体造
成的伤口较多，如力度过大会使植株无法成活，使
侵染成活率降低，但过小则不利于农杆菌侵染。为
保证农杆菌侵染效率，试验增加了共培养步骤，在
共培养结束后，应该用无菌水小心清洗残留的农杆
菌，过多的农杆菌会导致植株死亡。
农杆菌介导的萌发种子侵染法并没有去掉种子
原来的生长点，避免了再生环节。该方法不用经过
大量组培试验，不需要太多无菌操作，节省时间，
方便快捷，试验成本低。但不经过植株再生容易在
T0 代产生嵌合体，故假阳性率较高。由于嵌合体的
存在，需要对植株进行分枝鉴定，我们同时对植株
进行双重 PCR 和两个除草剂抗性的检测以保证试验
的准确性。本试验在较短的时间内得到了第 2 代转
基因阳性株，方法可行，效果较好。
本试验在后期又使用了另外两个大豆品种（中
品 661 和北农 103），得到的转基因 T0 代转化率与中
黄 10 的转化率相近，但尚未得到 T1 代。初步结果
证明此方法可以在一定程度上解决大豆遗传转化的
基因型依赖问题，转入基因能够稳定遗传。
试验所用材料为成熟种子，取材方便，周期短，
耗材少，效率较高，是一个较为实用的转化方法。
因此，利用萌发种子实现大豆转化，对利用转基因
技术培育大豆新品种具有一定的实践意义。
4 结论
通过农杆菌介导大豆种子萌发法，将含有两种
抗除草剂基因的质粒成功地转入大豆中。大豆种子
萌发成活率为 92.5%，转化成活率为 51.6%，T0 代
DNA 的 PCR 检测阳性率为 11.3%，同时具有草丁膦
抗性的比例为 41.9%。综合 PCR 和草丁膦抗性的试
验得到阳性比例为 4.8%。根据 T1 代 PCR 检测为阳
性且具有除草剂抗性植株，最终转化率为 0.37%。
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A B C
D E F
A ：WT ；B ：T0 叶片涂抹草丁膦 ；C ：WT ；D ：T1 叶片涂抹草丁膦 ；E ：WT ；
F ：T1 叶片喷施草甘膦
图 4 野生型大豆与转基因大豆除草剂抗性检测
A B
A ：野生型 ；B ：转基因植株
图 5 涂抹草丁膦后植株表现
2013年第8期 87刘志敏等 ：农杆菌介导的大豆萌发种子转化技术
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（责任编辑 李楠）