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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第1期
抗 坏 血 酸 过 氧 化 物 酶（ascorbate peroxidase，
APX）是植物体内酶促抗氧化系统中 ASA-GSH 氧化
还原途径的重要组分，是清除 H2O2 的关键酶，对
H2O2 有较高的亲和力，在还原底物抗坏血酸的存在
下将 H2O2 还原为 H2O。大量的研究表明，APX 的表
达受各种环境胁迫因子，如干旱、高盐、除草剂、低
温、病原菌侵染的诱导。马长乐等［1］研究表明，当
碱蓬受到 NaCl 胁迫时，其 SsAPX 的表达量增高。在
烟草叶绿体中，过量表达拟南芥 APX 基因能够清
除活性氧，提高转基因株系耐盐能力［2］。木本植物
收稿日期 ：2012-07-03
基金项目 ：山西省自然科学基金项目（2010011038-2）
作者简介 ：郭慧娜，女，硕士研究生，研究方向 ：植物分子生物学 ；E-mail: 1095341484@qq.com
通讯作者 ：曹秋芬，女，博士，研究员，研究方向 ：果树生物技术 ；E-mail: caoqiufeng@yahoo.com.cn
转 ZjAPX 基因拟南芥对 NaCl、干旱胁迫的耐性研究
郭慧娜1，2  孟玉平2  郝子琪1，2  李倩1，2  曹秋芬1，2，3
（1. 山西大学生物工程学院，太原 030031 ；2. 山西省农业科学院生物技术研究中心，太原 030031 ；3. 农业部黄土高原作物基因资源与种质
创制重点实验室，太原 030031）
摘 要 ： 旨在探讨枣树抗坏血酸过氧化物酶基因 ZjAPX 在植物渗透胁迫中的作用。将 ZjAPX 基因转入到模式植物拟南芥，
以野生型（WT）、转 ZjAPX 拟南芥株系 T2 为试材，进行不同浓度 NaCl 胁迫和干旱胁迫。结果表明，转基因株系的种子萌发、植
株生长均优于野生型株系 ；荧光定量 PCR 检测转基因拟南芥植株在干旱和盐胁迫处理 10 d 后目的基因 ZjAPX 的表达量显著高于野
生拟南芥，表明 ZjAPX 的高表达明显提高了植株的抗旱和耐盐性。
关键词 ： ZjAPX 转基因 拟南芥 NaCl 胁迫 干旱胁迫
ZjAPX Gene Improving Resistance to NaCl and Drought Stress in
Arabidopsis
Guo Huina1，2 Meng Yuping2 Hao Ziqi1，2 Li Qian1，2 Cao Qiufen1，2，3
（1. College of Biological Engineering，Shanxi University，Taiyuan 030031 ；2. Biotechnology Research Center，Shanxi Academy of
Agricultural Sciences，Taiyuan 030031 ；3. Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of
Agriculture，P.R.China，Taiyuan 030031）
Abstract:  In order to investigate the function of ZjAPX（Zizyphus jujuba ascorbate peroxidase ）in response of plant to osmotic stress.
In this study, ZjAPX gene was introduced into Arabidopsis. Wild type（WT）and transgenic type of Arabidopsis were used to the NaCl osmotic
stress and drought stress. These results suggested that transgenic seeds germination and seedlings growth were both better than the wild-type.
At 10 days to be treated with NaCl osmotic stress and drought stress, real-time quantitative PCR detection showed that the transcription level of
ZjAPX in transgenic plants was significantly higher than wide type. These results suggest that high expression of ZjAPX increased plant NaCl
osmotic stress and drought tolerance.
Key words:  ZjAPX Transgenic Arabidopsis NaCl osmotic stress Drought stress
中白桦抗坏血酸过氧化物酶（APX）基因已经被克
隆，研究表明 NaCl 胁迫诱导了白桦叶片中 APX 的
表达［3］；木本果树中葡萄的 APX［4］和苹果的 APX
基因也已被克隆［5］，李颖等［6］利用农杆菌介导已经
将苹果的 APX 基因转入“嘎啦”组培苗。
枣树抗旱、耐盐碱、耐瘠薄，这些特性与其
体内的抗氧化系统有密切关系，我们从枣树结果枝
cDNA 文库中筛选出一个抗坏血酸过氧化物酶基因，
命 名 为 ZjAPX， 在 DDBJ/EMBL/GenBank 的 注 册 号
为 AB608053，并对 ZjAPX 进行了原核表达蛋白的研
2013年第1期 79郭慧娜等 ：转 ZjAPX 基因拟南芥对 NaCl、干旱胁迫的耐性研究
究［7］和 cDNA 序列生物信息学分析及完整开放阅读
框植物表达载体 PEZR（K）-LNY-ZjAPX 的构建［8］。
本研究通过冻融法将已构建的植物表达载体转入农
杆菌菌株 LBA4404，并借助农杆菌遗传转化获得转
ZjAPX 拟南芥，通过对转基因拟南芥进行 NaCl、干
旱胁迫，观察植株的表型变化、检测其体内 ZjAPX
的表达，探讨 ZjAPX 在改善植物抗旱耐盐性方面的
生物学作用，旨在为利用生物工程手段提高植物抗
旱、耐盐性提供基因资源。
1 材料与方法
1.1 材料
试验所用重组植物表达载体 PEZR（K）-LNY
由山西省农业科学院生物技术研究中心植物细胞及
胚胎学研究室保存，前期研究中已经将 ZjAPX 成
功 连 接 到 PEZR（K）-LNY 载 体 上， 构 建 了 PEZR
（K）-LNY-ZjAPX［8］， 该 载 体 携 带 筛 选 标 记 基 因
NPT-Ⅱ和黄色荧光蛋白报告基因 YFP。野生型拟南
芥株系（Arabidopsis thaliana Columbia）和根癌农杆
菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404 菌株由该研
究室保存。
卡 那 霉 素（Kanamycin，Kan） 购 自 上 海 生 工
生物工程服务有限公司 ；NaCl、YEB、1/2MS 培养
基中所用试剂均购自天津天大化工 ；拟南芥的培养
基质购自山西省农业科学院园艺作物研究所 ；饱和
酚、DEPC、RNA 和 DNA 提取过程中所用到的试剂
均购自上海生工生物工程有限公司。DL2000 Marker
购自北京全式金生物技术有限公司 ；反转录试剂盒
（PrimeScript® RT Master Mix），荧光定量 PCR 试剂盒
（PrimeScriptTM RT reagent Kit），DNase Ⅰ，荧光定量
过程中所用的 PCR 管均购自大连 TaKaRa（宝生物）
工程有限公司。用于 PCR 鉴定和荧光定量的引物
由上海生工生物技术服务有限公司合成 ；荧光定量
PCR 仪为 Applied Biosystems 的 7300 Real Time PCR
System。
1.2 方法
1.2.1 拟南芥的培养 将拟南芥种子消毒后，播于
1/2MS 固体培养基上，封口。春化 2 d 后，将其置于
21℃，16 h/8 h 光周期条件下进行培养。当拟南芥长
出两片真叶时，移栽到营养基质中继续培养。
1.2.2 农 杆 菌 工 程 菌 PEZR（K）-LNY-ZjAPX-L 的
构建及转化拟南芥 通过冻融法将构建成功的重组
质粒 PEZR（K）-LNY-ZjAPX 转入农杆菌 LBA4404，
挑取阳性菌落进行 PCR 鉴定转化子，将阳性菌株送
华大基因公司测序。
将测序证明序列正确的农杆菌菌株接种到含有
50 μg/mL Kan 的 YEB 培养基中，28℃、250 r/min 振
荡过夜培养，6 000 r/min 离心 5 min 收集菌体，用 5%
蔗糖溶液悬浮菌体，调 OD600 值为 0.8-1.0 时加黏菌
剂（终浓度为 0.05%），侵染拟南芥植株，浸染过后
的植株遮光于人工气候箱培养 12 h 后正常培养，当
拟南芥的角果枯黄，欲开裂时，收获 T0 代种子。
1.2.3 转基因植株的筛选 将 T0 代种子消毒后，播
于含有卡那霉素的 1/2MS 抗性平板上筛选，筛选出
的抗性植株分株系收获种子，记为 T1 代。同样，将
T1 代种子抗性筛选，收获 T2 种子。将 T2 代种子消
毒后播于含有卡那霉素的 1/2MS 固体培养基上，在
平板上生长全为绿苗的为纯合的转基因植株。
1.2.4 转基因植株的分子鉴定 采用 CTAB 法提取
T2 代转基因拟南芥的基因组 DNA，通过蛋白核酸检
测仪检测其浓度和纯度 ；以提取的基因组 DNA 为
模板进行 PCR 检测，PCR 反应体系总体积为 20 μL，
其 中 ：10×PCR Buffer 2 μL，dNTPs 0.2 μL，Taq 聚
合酶 0.1 μL，上下游引物各 1 μL（20 pmol/μL），用
灭菌无离子水补足 20 μL。
APX1 正向引物 ：5-TGAATTCAGATGGGGAAG-
TGCTAC-3 ；APX2 反向引物 ：5-ATCCCGGGTAGCA-
TCAGCAAATC-3。
PCR 反应条件为 ：95℃预变性 5 min ；94℃变性
1 min，54℃退火 1 min，72℃延伸 2 min，共 30 个循
环 ；最后 72℃延伸 5 min。
1.2.5 转基因植株 T2 代种子的 NaCl 胁迫处理 种
子胁迫培养基为 ：1/2MS 培养基中分别加不同浓度
的 NaCl，即 100、200、300 和 500 mmol/L，以不加
NaCl 的 1/2MS 培养基为对照。
将 PCR 鉴定为转基因株系的拟南芥 T2 代的种
子消毒后，每一个株系在每一个浓度的培养基上均
播种约 20 颗种子，同时每个培养皿中播野生型拟南
芥种子作对照，观察种子萌发及植株生长状况。
1.2.6 转基因 T2 代植株的 NaCl 和干旱处理 将正
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期80
常生长 3 周左右的转基因拟南芥植株分别进行干旱
（不浇水）和浇 400 mmol/L NaCl 处理，以正常浇水
为对照，10 d 后调查植株生长情况，并分别取样冷
冻于液氮后保存在 -80℃超低温冰箱中，备用。
1.2.7 NaCl 和干旱胁迫下转基因拟南芥中 ZjAPX
基因的表达 用 CTAB 法［9］提取上述处理样品的
RNA，用 DNase Ⅰ除去 DNA。用蛋白核酸分光光度
计检测其 A260/280 在 1.8-2.0 之间，凝胶电泳发现 28S
和 18S 的 rRNA 条带完整，28S 条带的亮度为 18S 亮
度的 2 倍，表明总 RNA 有较好的完整性和纯度，能
满足反转录的要求。反转录成 cDNA。反转录体系 ：
5×Prime Script Buffer 4 μL、Total RNA 1 μg、总体积
15 μL。反应条件 ：37℃ 15 min，85℃ 5 s。用 Real-
time PCR 的方法分析基因的转录表达情况。本研究
采用 Real-time PCR 相对定量法，分析转基因植株不
同胁迫条件下 ZjAPX mRNA 的相对表达量。ZjAPX
的上游引物为 ：5-TCGATATCGCTGTCAGACTAC-3 ；
下游引物 ：5-TTGTCCTCTCTTCCTGGATG-3 ；可扩
增 出 145 bp 的 片 段。 以 拟 南 芥 Actin（At3g18780）
基因作内参，其上游引物 ：5-ACCTCATGAAGATCC-
TTACAG-3 ；下游引物 ：5-GATGGAAGAGCTGGTC-
TTTG-3 ；可扩增出 146 bp 的片段定量 PCR 反应体
系总体积为 20 μL，含上、下游引物各 0.4 μL（20
pmol/μL），cDNA 1 μL（100 ng），SYBR Premix EX
TaqTM Ⅱ 10 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.8
μL。反应条件为 ：95℃预变性 30 s，95℃变性 5 s，
60 ℃ 延 伸 31 s，40 个 循 环。 基 因 相 对 定 量 表 达
分析采用 2-ΔΔCt 法，ΔΔCt = 转基因［Ct（ZjAPX）-Ct
（Actin）］- 野 生 型［Ct（ZjAPX）-Ct（Actin）］， 每
个样品重复 3 次。
2 结果
2.1 农杆菌工程菌株的构建
将构建好的植物表达载体 PEZR（K）-LNY-ZjA-
PX 转入农杆菌 LBA4404，涂布于含有卡那霉素的
YEB 固体培养基上，28℃过夜培养，挑选生长良好
的单菌落，进行 PCR 检测，产生一条大小约为 750
bp 的特异条带（图 1），两个菌株测序表明，重组载
体上的序列与原克隆序列完全相同，证明含 PEZR
（K）-LNY-ZjAPX 的农杆菌工程菌构建成功。
图 2 筛选的转 ZjAPX 拟南芥植株
M ：Trans2k Marker ；1，2 ：阳性克隆
图 1 工程菌 PEZR（K）-LNY-ZjAPX-L 的 PCR 鉴定
1000
750
750
bpbp
M1 2
2.2 转基因植株的筛选
将 T0 代种子播在含有卡那霉素的 1/2MS 培养基
上筛选，未转化的拟南芥种子长出两片子叶后黄化
死亡，只有转基因拟南芥种子能够继续正常生长，
如图 2 所示。经过抗性筛选共获得 24 个转基因株系，
24 个株系整体生长状况良好，没有发现异常形态及
性状。
2.3 转基因植株的PCR检测
将筛选获得的 24 个 T0 转基因株系继续分别用
含有卡那霉素的 1/2MS 培养基筛选至获得 T2 代种子，
播种其中的 5 个株系 3、8、9、11、20 进行 PCR 鉴
定证明，5 个株系均扩增出了 750 bp 的条带（图 3），
表明 5 个株系均为转 ZjAPX 基因植株。
2.4 转基因株系种子对NaCl的耐性
播种后第 7 天，300 mmol/L 和 500 mmol/L NaCl
培养基上种子没有发芽长出子叶，而 0 mmol/L NaCl
和 100 mmol/L NaCl 的培养基上子叶展开，10 d 长出
两片真叶，但含 100 mmol/L NaCl 培养基上的幼苗叶
子卷曲 ；15 d 转基因拟南芥的幼苗的长势明显好于
野生拟南芥 ；30 d 野生型植株幼苗根系短小、叶片
发黄接近死亡，而转基因株系幼苗的根系和叶片明
䖜ZjAPXสഐᤏই㣕
2013年第1期 81郭慧娜等 ：转 ZjAPX 基因拟南芥对 NaCl、干旱胁迫的耐性研究
显优于野生型植株，如图 4 所示。 长最好，ZjAPX 的相对表达量也最高 ；株系 9 在胁
迫条件下生长最弱，ZjAPX 的相对表达量也最低 ；
证明转 ZjAPX 植株的耐 NaCl 和耐干旱性与 ZjAPX
的高表达呈正相关，ZjAPX 的高表达提高了植株耐
NaCl 和耐干旱的能力。
图 5 NaCl、干旱胁迫后不同转基因株系 ZjAPX 的
相对表达量
图 3 转基因拟南芥 DNA 检测
M ：Tran2k Marker ；1-5. 分别为株系 3、株系 8、株系 9、株系 11、株系 20
图 4 NaCl 培养基上生长 30 d 的拟南芥植株
1000
750 750
bpbp
M 1 2 3 4 5
䖜สഐṚ㌫ 䟾⭏රṚ㌫
2.5 转基因株系的耐NaCl、耐旱性
对转基因植株进行 NaCl 和干旱胁迫处理 15 d
后观察，与正常浇水的对照相比 NaCl 处理的植株均
表现叶片变黄，但转基因株系比野生型植株更健壮、
叶片大、叶色稍绿。干旱处理的转基因株系均正常
生长，株系 3 和株系 11 叶片表现为深绿色，株系 8
叶色正常并已经抽苔，株系 9 长势稍差，而此时野
生型植株已干枯死亡。
2.6 NaCl和干旱胁迫下转基因植株中ZjAPX基因的
表达
荧光定量 PCR 分析结果表明，NaCl 和干旱胁
迫 10 d 的转基因株系的 ZjAPX 表达量均显著高于野
生型株系，如图 5 所示。其中以株系 3 表达量最高，
相对表达量分别为 114% 和 146%，其次株系 8 分别
为 73% 和 76%，株系 11 分别为 17% 和 20%，株系
9 均为 11% ；NaCl 胁迫条件下野生型植株 ZjAPX 表
达量很低为 0.1% 几乎为 0，而干旱胁迫 10 d 采样时
野生型植株已经死亡。这一结果与上述 2.5 中的外
部形态观察结果基本一致，株系 3 在胁迫条件下生
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Ṛ㌫3 Ṛ㌫8 Ṛ㌫9 Ṛ㌫11 䟾⭏ර
䖜สഐṚ㌫
⴨ሩ
㺘䗮
䟿%
 NaCl㛱䘛ᒢᰡ㛱䘛
3 讨论
植物在受到盐、干旱等逆境胁迫时会产生大
量 的 活 性 氧（ROS），ROS 的 种 类 包 括 过 氧 化 氢
（H2O2）、羟自由基（OH
-）、超氧阴离子（O2
-）。当
ROS 代谢平衡遭到破坏、产生的量超出植物体本身
的清除能力时，过剩的 H2O2 会生成破坏力更强的
HO-，从而导致膜脂的过氧化，破坏生物膜的结构
与功能，蛋白质和 DNA 等生物大分子受到伤害，细
胞物质交换平衡遭到破坏，生理生化代谢出现紊乱，
使植物生长受到抑制［10］。因此，能否及时清除过量
积累的活性氧，缓解胁迫对植物细胞造成的伤害，
在一定程度上反映了植物耐盐、耐旱等抗逆性的强
弱。研究表明，在高等植物中，抗坏血酸（Ascorbic
acid，ASA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循环是
植物叶绿体和胞质中清除 H2O2 的主要系统，而 APX
是这个系统的关键酶［11］，因此 APX 的表达量高低
直接影响植物在逆境中的生存能力。
对 APX 的研究发现，在干旱、臭氧、乙烯、除
草剂、冷热等逆境条件，以及病原体侵染以及果实
成熟过程中，均能引起 APX 的 mRNA 水平及其活
性的增加［12］。本研究证明在 NaCl 胁迫条件下，转
ZjAPX 拟南芥的种子萌发和萌发后幼苗的生长、根
系明显优于野生型植株，说明转 ZjAPX 改善了拟南
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第1期82
芥种子及幼苗对 NaCl 的耐性。在 NaCl 和干旱胁迫
条件下，转 ZjAPX 拟南芥植株的生长势均明显优于
野生型植株，荧光定量 PCR 分析也证明 ZjAPX 基因
在 mRNA 水平的表达量明显高于野生型植株 ；同时
研究还表明转基因株系之间抗胁迫能力存在差异，
株系 3、8、11 生长势优于株系 9，ZjAPX 基因表达
量也表现出明显的不同，依次为株系 3、8、11、9。
这一结果说明 ZjAPX 基因在植物体内高表达量清除
了活性氧，提高了植株对 NaCl 和干旱胁迫的抗性 ；
由于不同株系中导入的基因拷贝数、基因整合的位
置存在差异，因而株系之间对 NaCl 和干旱的耐性也
表现不同。
Gueta-Dahan 等［13］对耐盐和盐敏感的柑橘中抗
氧化酶的活性发现，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还
原酶等的活性在两者之间差别不大，而耐盐柑橘中
的 APX 活性大大高于盐敏感柑橘 ；Tsugane 等［14］也
发现与野生型拟南芥相比，在盐胁迫条件下能进行
光合自养的拟南芥隐性突变体中 APX 的活性显著增
强，而其他几种抗氧化物酶的活性差别不大，因此
认为 APX 是决定耐盐与否的关键酶。本研究结果也
证明了这一点。
增强植物抗逆性的重要途径之一是提高植物体
内活性氧清除酶类的活性及抗氧化代谢水平。利用
基因工程手段将一些具有抗逆功能的转录因子导入
植株中，是目前普遍使用的提高植物抗逆性的策略。
4 结论
本研究利用农杆菌介导法将 ZjAPX 基因转入到
模式植物拟南芥，转 ZjAPX 拟南芥 T2 株系的种子萌
发和植株生长均较野生型株系耐盐、耐旱，荧光定
量 PCR 检测转基因植株在干旱和盐胁迫处理 10 d 后
目的基因 ZjAPX 的表达量显著高于野生拟南芥，证
明转 ZjAPX 能够提高植物的耐盐和耐旱性。
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（责任编辑 马鑫）