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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第8期
随着能源危机的加重，纤维素乙醇作为一种新
型可持续发展能源，逐渐得到重视［1］。现阶段纤维
素乙醇的生产主要采用同步糖化发酵法（simulta-
neous saccharification and cofermentation，SSCF）［2］，
该技术和整合生物加工技术［3］（consolida-ted biopro-
cessing，CBP）的最大差别在于 ：SSCF 中纤维素酶
的生产和其他步骤分开进行，而 CBP 中酶的生产、
纤维素水解和单糖发酵同步完成。与 SSCF 相比，
收稿日期 : 2011-12-15
基金项目 : 国家自然科学基金项目（30800202）,留学回国人员科研启动基金 ,国家自然科学基金和英国皇家学会双边交流合作项目（31011130157）
作者简介 : 凌小芳 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 生物工程 ; E-mail: lingxf@qibebt.ac.cn
通讯作者 : 杨静 , 女 , 博士 , 副研究员 , 研究方向 : 结构生物学 ; E-mail: yangjing@qibebt.ac.cn
响应面法优化嗜热厌氧杆菌 X514产乙醇合成培养基
凌小芳1 谢天2 杨静1
（1 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 生物燃料重点实验室，青岛 266101 ；2 中国科学院成都生物研究所
应用与环境微生物中心，成都 610041）
摘 要： 嗜热厌氧杆菌 X514（Thermoanaerobacter sp. X514）能同时发酵五碳糖、六碳糖并产出乙醇，是纤维素乙醇生产中
最具潜力的菌株之一。单因子试验证明，酵母提取物中对 X514乙醇发酵起决定性影响的组分为 B族维生素，并进一步确定了 B族
维生素中对乙醇发酵有影响作用的 6种维生素。结合培养基中的其他影响因子，应用 Plackett-Burman试验设计方法，筛选出 X514
乙醇发酵的极大影响因子为 NH4Cl、烟酸及硫胺素。随后用最陡爬坡试验确定了影响因子最佳取值区域，并利用响应面方法优化
合成培养基。优化结果显示，当以 5 g/L葡萄糖为底物时，在 NH4Cl、烟酸及硫胺素的浓度分别为 1.05 g/L、6.4 mg/L及 7.0 mg/L
的条件下，X514的乙醇产出浓度达到最优理论值 34.46 mmol/L。试验验证该条件下乙醇产出浓度为 33.78 mmol/L。试验值与理论
值接近，原始矿物质培养基中乙醇产出浓度的 5.1倍，并与添加 5 g/L的酵母提取物培养基的乙醇产出浓度（34.67 mmol/L）相当。
关键词： CBP 嗜热厌氧菌 乙醇发酵 B族维生素 RSM
Optimization of the Synthetic Medium Using RSM for Ethanol
Production by Thermoanaerobacter sp. X514
Ling Xiaofang1 Xie Tian2 Yang Jing1
（1The Key Laboratory of Biofuels，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101；
2Applied and Environmental Microbiology Center，Chengdu Institute of Biology，Chinese Academy of Sciences，Chengdu 610041）
Abstract: Thermoanaerobacter sp. X514 can ferment both xylose and pentose to ethanol, which is a promising strain to be applied into
the cellulosic ethanol production. In the primary screening experiment, B family vitamins in yeast extract are found to be the main components
contributing to the ethanol production. The further experiment reveals the most important six kinds of vitamins among B family vitamins. Together
with three other factors, pH, NH4Cl, MgCl2 which contribute to the fermentation, totally nine variables are introduced in the medium optimization
process. Further study with Plackett-Burman design reveals that among all factors in the synthetic medium, NH4Cl, nicotinic acid and thiamine
are critical to the ethanol production. By means of the steepest ascent experiment and the followed Response Surface Methodology （RSM）, it is
found out that the fermentation can theoretically reach its maximum, when the concentrations of NH4Cl, nicotinic acid and thiamine reach 1.05
g/L, 6.4 mg/L and 7.0 mg/L, respectively. Under the optimal condition, with 5 g/L glucose as the substrate, the predicted ethanol production is
34.46 mmol/L, in good agreement with the experimental production in the batch fermentation 33.78 mmol/L, which is about 5.1 times the original
ethanol production of X514 in mineral medium.
Key words: CBP Thermoanaerobacter Ethanol fermentation B family vitamins RSM
2012年第8期 169凌小芳等 ：响应面法优化嗜热厌氧杆菌 X514 产乙醇合成培养基
CBP 可以减少 14.7 ¢/gal 的生产成本［4］。但目前自然
界中并无满足 CBP 技术要求的单一菌种。解决该困
境的途径之一是联合培养可分解纤维素的菌株和可
发酵单糖的菌株［5］。现有研究中可发酵单糖的菌种
主要有酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、运动发
酵单胞菌（Zymomonas mobilis）、大肠杆菌（Eschirechia
coli）以及嗜热厌氧菌（Thermoanaerobacter）等。嗜
热厌氧杆菌 X514 是从美国科罗拉多州的 Piceance
盆地深层地下环境中分离的一株菌株［6］ 。X514 在
CBP 的应用中有嗜热菌的诸多优点 ：能耐受广泛的
pH 生长范围 ；能在 60℃左右的高温下将戊糖和己
糖转化为乙醇，高温环境有利于产物乙醇的回收 ；
高温环境可以避免其他菌的污染［7］等。X514 与
该属其他菌种（如 Thermoanaerobacter tengcongensis
MB4，Thermoanaerobacter ethanolicus 39E）相比，显
示出许多优良的特性。与 MB4 相比，MB4 不能代谢
木糖或木聚糖，而 X514 却可以同时利用己糖和戊
糖［8］。与 39E 相比，X514 有更多乙醇脱氢酶基因
和木糖转运子［9］，且拥有比 39E 更优越的己糖、戊
糖共代谢机制［10］，这使 X514 在木糖的利用中显示
出极大优势 ；X514 缺少完整的甲基乙二醛旁路［11］，
该旁路在碳水化合物丰富的环境下限制能量的产
生［12］；X514 还是迄今为止为数不多的几个被成功
转录进外源基因的嗜热厌氧产乙醇菌种之一［13］。然
而，X514 在矿物质培养基中乙醇产出浓度较低，在
6 g/L 葡萄糖为底物的条件下，其乙醇产出浓度不足
5 mmol/L［14］。我们的初期试验表明，以 5 g/L 葡萄糖
为底物的矿物质培养基中加入 5 g/L 酵母提取物可以
使 X514 的乙醇发酵产量达到 34.67 mmol/L，但是在
培养基中添加酵母提取物会大幅增加菌种发酵成本，
例如，在乳酸生物发酵中，酵母提取物的成本约占
其总成本的 40%［15］，且成分复杂的培养基也不利于
该菌生化特性等研究的开展。因此，通过分析酵母
提取物中各组分对 X514 乙醇生产的影响，应用培
养基优化方法，找到成分明确、成本较低的合成培
养基替代添加酵母提取物的培养基显得很有必要。
现在普遍运用的培养基优化方法有单因子
优化法、正交试验法及响应面（Response Surface
Methodology，RSM）优化法等。其中，RSM 优化方
法集试验设计、建模、因子效应评估以及寻求因子
最佳操作条件于一体［16，17］，通过对受多个变量影响
的响应问题进行数学建模与统计分析，并针对该响
应进行优化，有助于快速建模、缩短优化时间并提
高应用的可信度。Plackett-Burman 试验是一种快速
筛选主效应试验因子的试验设计，主要针对因子数
较多，且未确定众因子相对于响应变量的显著性时，
采用的试验设计方法［18］。它通过对每个因子取两水
平来进行分析，通过比较各个因子两水平的差异与
整体的差异来确定因子的显著性。RSM 方法中的响
应面拟合方程只在考察的紧接区域里才充分近似真
实情形，而最陡爬坡法以试验值变化的梯度方向为
爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，
能快速、经济地逼近最佳取值区域 ［19］，因此在确定
了显著影响因子之后利用最陡爬坡法确定影响因子
最佳取值范围无疑是最佳选择。综合以上论述，本
研究可以利用 Plackett-Burman 试验筛选出显著影响
因子，并通过最陡爬坡试验进一步确定显著影响因
子的最佳取值区域，而后利用 RSM 方法精确估计有
主效应的因素，并以回归法作为函数估算的工具，
用多项式近似把因子与试验结果（响应值）的关系
函数化，依此对函数的面进行分析，研究因子与响
应值之间、因子与因子之间的相互关系，最终完成
优化［20］。
本研究优化培养基目的在于：简化培养基成分；
降低 X514 乙醇发酵培养基成本 ；确定培养基中对
发酵起极大影响的成分，以期在控制极大影响成分
的条件下使发酵结果达到一定目标，为 X514 生物
发酵工业运用中寻找廉价的发酵添加物奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 试验所用嗜热厌氧杆菌 X514 由美国俄
克拉荷马大学环境基因组学研究所保藏并提供。
1.1.2 试剂 试验中所用 NH4Cl、Na2HPO4·12H2O、
KH2PO4、葡萄糖、刃天青等购自国药集团。酵母
提取物购自 Oxoid 公司。所用的乙醇试剂盒购自
Megazyme 公司。
1.1.3 培养基 试验所用培养基是在 Wiegel 等［21］
使用培养基的基础上改进得到，每升培养基包含 ：
Na2HPO4·12H2O 4.2 g，KH2PO4 1.5 g，NH4Cl 1.0 g，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期170
Mg2Cl·6H2O 0.2 g，Wolfe’s mineral 溶液［22］10.0 mL，
葡萄糖 5.0 g，0.1%（M/V）刃天青（氧气指示剂）。
1.2 方法
1.2.1 培养方法 所有试验均在厌氧瓶中进行。厌
氧瓶分装培养基，以纯氮为厌氧保护气体充气后，
用橡胶塞塞好，压盖小铁压紧。不含葡萄糖、维生
素及还原剂的培养基在 115℃下灭菌 20 min。高浓
度葡萄糖溶液在 115℃下灭菌 20 min，维生素溶液
以及培养基中使用的还原剂通过 0.22 μm 虑菌器过
滤注入预先充入氮气并灭菌的厌氧瓶中备用。厌氧
无菌的葡萄糖，Wolin Vitamin 及还原剂在接种前用
无菌注射器注入培养基。批次发酵在 60℃培养箱中
连续培养 80 h。
1.2.2 分析测定方法 使用 Megazyme 公司的乙醇试
剂盒测量批次发酵最终产物乙醇的产量，测定步骤
按照乙醇测定试剂盒说明书进行。
1.2.3 初步筛选影响因子
1.2.3.1 筛选酵母提取物中影响 X514 乙醇发酵的关
键组分 据文献报道，酵母提取物中对生物发酵和
生长有重要作用的成分包括蛋白质氨基酸［23］、碱
基［24］及维生素［25］。Stokes 等［26］测量了酵母提取
物（USB 产）各 B 族维生素（文中测量了除了维
生素 B12 和生物素以外的 B 族维生素含量，在此假
设二者的含量为其他维生素的平均值）总含量约为
0.8%（W/W）。由 Schulze 等［27］的研究表明，酿酒
酵母 Saccharomyces cerevisiae的蛋白质氨基酸，碱基
总含量分别约占酵母干细胞重量的 50%（W/W）及
10%（W/W）。鉴于以上研究，在此对试验所用酵母
提取物中 3 种组分做出如下假设 ：酵母提取物中约
含有蛋白质氨基酸 50%（W/W），碱基 10%（W/W）
及 B 族维生素 0.8%（W/W）。试验中用到的 Wolin
维生素［22］溶液所含各维生素相对含量与 Stokes 等［26］
研究中各种维生素含量相近，被用作酵母提取物的
维生素混合物的替代物。在假设条件下，设置不同
的添加物分别为 ：0.05、0.5、2 和 5 g/L 的酵母提取
物（乙醇产出浓度为 34.67 mmol/L）；Wolin 等试验［22］
中所用 Wolin 维生素溶液浓度的 1 倍、10 倍、100 倍；
0.25 和 2.5 g/L 氨基酸 ；0.05 和 0.5 g/L 碱基。在此指
出 ：在假设条件下，试验中所用维生素浓度 100 倍，
2.5 g/L 氨基酸及 0.5 g/L 碱基分别和 5 g/L 酵母提取
物中的维生素浓度、氨基酸浓度和碱基浓度相近 ；
初始试验证明 X514 在不添加维生素的矿物质培
养基中不能生长，故在研究氨基酸和碱基对 X514
乙醇发酵的影响时，在培养基中添加 1 倍浓度维
生素。
1.2.3.2 筛选对 X514 影响乙醇发酵产量的维生
素 由上述试验结果可知，B 族维生素在 X514 乙
醇发酵中起决定性作用，且培养基中加入 100 倍浓
度维生素时，X514 乙醇发酵的产量最高。后续试验
将在 100 倍维生素浓度下，探索不同 B 族维生素对
发酵乙醇产出浓度的影响。B 族维生素包括 ：叶酸
（folic）、对氨基苯甲酸（aminobenzoic acid）、核黄素
（riboflavin）、泛酸（pantothenic acid）、烟酸（nicotinic
acid）、硫胺素（thiamine）、生物素（biotin）、VB6、
VB12、硫辛酸（lipoic acid）。试验采取逐个去除某一
种维生素的方法从 B 族维生素中筛选出对 X514 乙
醇发酵影响重要的维生素。
1.2.4 Plackett-Burman 试验 1.2.3.2 试验确定 B 族
维生素中对 X514 乙醇发酵产量有影响的 6 种维生
素 ：生物素、对氨基苯甲酸、烟酸、硫胺素、VB12
和硫辛酸。前期单因子试验发现 pH 在 6.5-8 之间，
NH4Cl 在 0.2-1.5 g/L 之 间，MgCl2 在 0.1-1.0 g/L 之
间对 X514 乙醇发酵有重要影响，因此本部分利用
Plackett-Burman 设计一个包含 9 种影响因子的试验，
各影响因子取高（+1），低（-1）两个水平，响应值
为乙醇产出浓度。
1.2.5 最陡爬坡试验 响应面方法在考察区近邻域
内才能充分近似真实情形，要建立有效的响应面拟
合方程，必须先逼近最大产乙醇区域。本部分基于
Plackett-Burman 试验结果设计最陡爬坡试验。
1.2.6 RSM 优化试验设计 最陡爬坡试验逼近最大
产乙醇区域后，采用 Box-Behnken 中心组合试验设
计法对关键因子进行进一步探究，每个影响因子取
3 个水平，编码分别为 +1，0，-1。根据对应的试验
设计对数据进行二次回归拟合，得到带交互项和平
方项的二次方程 ：


其中 Y 是预测响应值，即乙醇产出浓度，Xi 是
2012年第8期 171凌小芳等 ：响应面法优化嗜热厌氧杆菌 X514 产乙醇合成培养基
影响因子编码，β0、βi、βii、βij 是待估计参数偏移值。
对拟合所得模型进行分析，并在一定范围内求出最
佳值。
2 结果
2.1 影响因子的初步筛选
2.1.1 筛选酵母提取物中促进 X514 乙醇发酵的组
分 图 1 是 X514 在加入不同浓度酵母提取物，L-
氨基酸、碱基及 B 族维生素培养基中的乙醇产出浓
度。如图 1 可知，在酵母提取物为 5 g/L 时，X514
发酵的乙醇产出浓度最高。不同浓度的酵母提取物
及维生素对 X514 发酵结果的影响较大，而不同浓
度的 L-氨基酸和碱基对发酵结果影响甚微。由此可
见，酵母提取物中 B 族维生素是决定 X514 乙醇发
酵产量的关键因素。图 1 中 100 倍浓度的 B 族维生
素对 X514 乙醇发酵的促进作用最大，接近添加 5 g/L
酵母提取物培养基中的乙醇产出浓度，后续试验将
据此进行培养基优化。
图 1 X514在不同添加物培养基中的乙醇产出浓度
图中纵轴标注代表不同的培养基添加物
2.1.2 筛选影响 X514 乙醇发酵产量的维生素 作为
叶酸的合成前体，对氨基苯甲酸在 X514 的乙醇发
酵中所起的作用相当于叶酸，后续的试验舍弃叶酸
而保留对氨基苯甲酸（图 2）。对图 2 中的结果进行
Ducan 多重比较分析（P<0.05）可知，核黄素、VB6
及泛酸对乙醇发酵产量的影响不显著。后续的将不
再添加此 3 种维生素，培养基优化试验将着重研究
烟酸、对氨基苯甲酸、硫胺素、生物素、VB12 和硫
辛酸对 X514 乙醇发酵的影响。
图 2 X514在不同维生素缺乏型培养基中的乙醇产出浓度
图中纵轴图标代表缺乏不同维生素的混合维生素溶液添加类型
2.2 Plackett-Burman试验
Plackett-Burman 设计试验的影响因子及变量水
平详见表 1，试验结果见表 2。Pr ＞ |t| 值＜ 0.05 表
明该影响因子对响应值有显著影响。因此可以确定
对 X514 乙醇发酵有极大影响的影响因子是 X2、X5
和 X6，对应的影响因素分别为氯化铵、烟酸和硫
胺素。
表 1 Plackett-Burman试验设计的变量水平及效应分析
（α=0.05，置信度 95%）
影响因子 变量水平 估值 t Pr > |t|
-1 +1
X1 pH 7.0 7.5 0.6267 1.881 0.2007
X2 NH4Cl（g/L） 0.6 1.0 1.863 5.593 0.03050*
X3 MgCl2（g/L） 0.2 0.6 -0.2300 -0.6903 0.5613
X4 生物素（mg/L） 0.6 1.0 0.3900 1.171 0.3624
X5 盐酸（mg/L） 3.5 5.5 1.767 5.303 0.03380*
X6 硫胺素（mg/L） 3.5 6.5 1.880 5.643 0.03000*
X7 氨基酸（mg/L） 2.0 2.5 -0.1400 -0.4202 0.7152
X8 硫辛酸（mg/L） 2.0 2.5 0.1233 0.3701 0.7468
X9 VB12 （mg/L） 0.3 0.5 1.087 3.261 0.08250
表中 t值代表 t检验的值，Pr 表示预测值大于 t的概率。Pr ＞ |t| 值表明各
个考察因素的显著水平。* 表示极大影响因子
2.3 最陡爬坡试验
由表 2 中 P-B 试验结果可知，在第 6 组条件下
响应面最高。所以除极大影响因子外，其余影响因
子条件控制在第 6 组水平。表 1 中相关系数估计值
（Estimate）决定最陡爬坡试验的方向，系数为正时
影响因子增大，系数为负时影响因子减小，以第 6
组试验中极大影响因子中心点的值为起点，以显著
效应大小为依据设计最陡爬坡试验。最陡爬坡试验
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期172
结果见表 3，第 3 组试验中，响应面最高，选择第 3
组试验条件值作为中心组合设计的试验中心点。
表 2 Plackett-Burman试验设计及结果
RUN X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 Y
1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 27.68±2.108
2 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 1 30.74±0.9879
3 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 1 31.17±1.490
4 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 -1 29.35±1.966
5 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 -1 30.72±2.196
6 1 1 1 -1 1 1 -1 1 -1 32.21±1.933
7 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 1 31.03±2.123
8 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 -1 28.56±1.051
9 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 1 31.46±1.583
10 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 1 31.87±2.362
11 -1 1 -1 -1 -1 1 1 1 -1 30.41±1.585
12 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 1 26.18±2.121
表 3 最陡爬坡试验及结果
RUN X2（g/L） X5（mg/L） X6（mg/L） Y（mmol/L）
1 0.8 4.5 5.0 29.89±2.330
2 0.9 5.0 5.5 31.43±1.777
3 1.0 5.5 6.0 33.42±2.152
4 1.1 6.0 6.5 33.13±1.727
5 1.2 6.5 7.0 32.15±2.530
2.4 RSM试验优化发酵
根据最陡爬坡试验，以第 3 组条件为中心
点，表 1 中的因素效应大小为依据设计试验步长设
计中心组合试验。RSM 试验设计参数及变量水平
见表 4，试验结果见表 5。以乙醇产出浓度为响应
值，拟合得变量编码水平的二次回归方程为 ：Y=
3 4 . 3 6 + 0 . 4 *X 2 + 0 . 5 6 8 7 5 *X 5 + 0 . 4 2 3 7 5 *X 6 -
2.3875*X2*X2 -0.2825*X2*X5 -0.4525*X2*X6 -
1.18*X5*X5-0.835*X5*X6-0.725*X6*X6，模型方程的
相关系数为 95.80%，3 个因素间相互作用对响应的
影响可通过图 3 所示的响应面图直观反映，由响应
面也可以确定拟合曲面有最大值。由方程分析得模
型预测最大产量值为 34.46 mmol/L，此时，NH4Cl
约为 1.05 g/L，烟酸约为 6.4 mg/L，硫胺素约为 7.0
mg/L，该条件下的试验验证值为 33.78 mmol/L，可
见该模型能较好地预测产物产量。
表 4 RSM试验设计参数及变量水平
表 5 RSM中心组合设计及试验结果
参数 变量水平
-1 0 +1
X2 NH4Cl （g/L） 0.9 1.0 1.1
X5 烟酸 （mg/L） 5.0 5.5 6.0
X6 硫胺素 （mg/L） 5.5 6.0 6.5
RUN X2 X5 X6 Y
1 -1 -1 0 29.76±2.449
2 -1 1 0 30.83±1.791
3 1 -1 0 31.32±1.901
4 1 1 0 31.26±1.954
5 0 -1 -1 30.12±2.050
6 0 -1 1 33.02±1.920
7 0 1 -1 33.56±2.123
8 0 1 1 33.12±1.824
9 -1 0 -1 30.26±1.585
10 1 0 -1 31.77±2.066
11 -1 0 1 31.63±2.037
12 1 0 1 31.33±1.541
13 0 0 0 34.24±1.868
14 0 0 0 34.83±2.946
15 0 0 0 34.01±2.031
3 讨论
在培养基碳源作为固定成分的条件下，氮源的
添加量（C/N 比）［28］成为影响生物发酵目标产物产
量的重要因素。在 X514 的合成培养基中，NH4Cl 成
为维持 X514 生长及发酵的仅有氮源，其重要性由
此可见一斑。生物利用烟酸来合成 NAD+、NADH、
NADP+ 和 NADPH 等还原力载体，用于体内的氧化
还原反应及生物的生长和代谢［29］。这一点可能是烟
酸对 X514 乙醇发酵有重要作用的原因。有文献［30］
报道硫胺素能提高提供乙醇合成前体物相关的酶，
如 ：pyruvate dehydrogenase 或 pyruvate decarboxylase
的活性，提高葡萄糖的消耗和乙醇的产出。在 X514
乙醇发酵中可能也存在同样的机制。虽然烟酸和硫
胺素对 X514 的乙醇发酵作用的更深层次的原因还
有待试验的进一步证实，但通过宏观发酵所得的结
论为该菌的进一步探索指明了一个新的方向。
合成培养基所含的成分以及他们的量都是确切
可知的。合成培养基的确定及优化能够简化培养基
成分，为研究其他因素对生物体的作用提供便利［31］。
2012年第8期 173凌小芳等 ：响应面法优化嗜热厌氧杆菌 X514 产乙醇合成培养基
同时，通过改变不同的培养条件，合成培养基还可
以用来做代谢途径的分析研究［32］等。在本研究所
得合成培养基的最佳发酵条件下，每升矿物质培养
基中添加 6 种维生素（6 种维生素共计 18.8 mg）时，
X514 的乙醇发酵达到了添加 5 g 酵母提取物的效果，
从而降低了培养基的成本。由最终的优化结果可知：
在合成培养基中，通过控制添加的氯化铵，烟酸及
硫胺素的量就可以达到优化 X514 乙醇产出浓度的效
果。不难作出这样一个假设：在 X514 的乙醇发酵中，
烟酸和硫胺素的作用也可能有其他的廉价物质，或
者含有烟酸和硫胺素的廉价物质代替。该研究结果
为微生物发酵工业应用中寻找廉价培养基提供了思
路和理论基础。
4 结论
首先，通过研究酵母提取物中不同组分对 X514
乙醇发酵的影响试验证明酵母提取物中 B 族维生素
对 X514 的乙醇发酵起决定性作用，而酵母提取物中
的碱基，氨基酸则对 X514 的乙醇发酵产量影响甚微。
其次，在筛选影响 X514 乙醇发酵产量的维生
素的试验中，本研究通过对不同 B 族维生素的发
酵试验进行 Ducan 多重比较分析得知 ：烟酸，对
氨基苯甲酸，硫胺素，生物素，VB12，硫辛酸等对
X514 乙醇发酵的影响不可忽略。在随后的 Plackett-
Burman 设计试验中，从上述 6 种维生素及 NH4Cl，
MgCl2，pH 等影响因子中筛选出 X514 乙醇发酵的关
键影响因子为 NH4Cl，烟酸及硫胺素。
最后，通过最陡爬坡试验和 RSM 方法，本研究
确定了 X514 乙醇发酵合成培养基的最佳培养条件。
在最佳发酵条件下，X514 的乙醇产出浓度和添加 5
g/L 酵母提取物时的乙醇产出浓度达到同等水平。
参 考 文 献
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图 3 影响因子对 X514发酵乙醇产出浓度交互影响曲面图
a. NH4Cl 和烟酸对 X514 发酵乙醇产出浓度交互影响曲面图 ；b. NH4Cl 和硫胺素对 X514 发酵乙醇产
出浓度交互影响曲面图 ；c. 烟酸和硫胺素对 X514 发酵乙醇产出浓度交互影响曲面图
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第8期174
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（责任编辑 马鑫）