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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2015, 31(7):124-131
抗菌肽又称宿主防御肽，作为生物体非特异
性免疫的一个重要组成部分，是宿主防御细菌、病
毒等病原生物体入侵的重要分子屏障，广泛分布于
动植物、昆虫和细菌等多种生物体内。Cathelicidin
是 目 前 发 现 的 一 个 最 大 抗 菌 肽 家 族， 不 同 的
Cathelicidin 前体肽结构相似，包括 pro、pre 和 C 端
成熟肽 3 个区域。Pro 区又称信号肽区，引导小肽进
入细胞内部 ；Pre 区为结构域，包含一个高度保守
收稿日期 ：2014-10-22
基金项目 ：福建省教育厅重点项目（JA13171），集美大学李尚大学科建设基金项目（ZC2013003），集美大学鳗鲡现代产业技术教育部工程
研究中心开放基金项目（ZK2013005）
作者简介 ：张东玲，女，博士，讲师，研究方向 ：水产动物免疫学 ；E-mail ：donglingzhang@126.com
通讯作者 ：喻达辉，博士，研究员，研究方向 ：水产生物技术与遗传育种 ；E-mail ：pearlydh@163.com
日本鳗鲡 I 型 Cathelicidin 基因的克隆与原核表达
张东玲1  喻达辉2
（1. 集美大学水产学院 鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心，厦门 361021 ；2. 中国水产科学研究院南海水产研究所，广州 510300）
摘 要 ： Cathelicidin 是目前发现的一个最大抗菌肽家族，具有多重生物学功能。旨在探索和利用鱼类 Cathelicidin 抗菌机制
和潜在的生物学功能。应用 RACE-PCR 技术获得日本鳗鲡 I 型 Cathelicidin（AjCathI）基因的 cDNA 全长序列。AjCathI 的 cDNA 全
长为 842 bp，开放阅读框为 570 bp，编码 189 个氨基酸。氨基酸序列分析表明，AjCathI 靠近 C 端有 4 个保守的半胱氨酸序列，抗
菌成熟肽与香鱼（Plecoglossus altivelis）抗菌成熟肽相似性最高，同源性为 65.57%。进化分析表明，AjCathI 与其它鱼类亲缘关系较
近，处于同一个分支上。将 AjCathI 基因克隆至 pET-28a 载体，转化 Escherichia coli BL21（DE3）宿主菌进行表达。结果表明，
AjCathI 以包涵体形式表达，经鎳柱纯化、Western blot 验证和透析复性，获得高纯度的重组蛋白。
关键词 ： 日本鳗鲡 ；Cathelicidin ；抗菌肽 ；RACE-PCR
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.07.018
Cloning and Prokaryotic Expression of Cathelicidin Gene from
Japanese Eel I，Anguilla japonica
Zhang Dongling1 Yu Dahui2
（1. Fisheries College，Jimei University，Engineer Research Center of Eel Modern Industry Technology，Ministry of Education，Xiamen 361021 ；
2. South China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510300）
Abstract: Cathelicidin, an utmost family of antibacterial peptide so far, possesses multiple biological functions. In order to explore and
exploit the antibacterial mechanism and potential biological functions of Cathelicidin, full-length sequence of cDNA of Cathelicidin gene from
Japanese eel Anguilla japonica I（AjCathI）was obtained by RACE-PCR. The full cDNA of AjCathI was 842 bp and the ORF contained 570 bp
encoding 189 amino acids. Analysis of amino acid sequence demonstrated that AjCathI contained 4 conservative cysteine residues at C terminal,
and the mature antibacterial peptide had the highest similarity with Plecoglossus altivelis by homology of 65.57%. Phylogenetic analysis revealed
that AjCathI shared a common evolutionary origin with other teleost fishes. AjCathI was cloned into pET-28a and expressed in Escherichia coli
BL21（DE3）. The result manifested that AjCathI protein was expressed in inclusion bodies. The protein was isolated by Ni column, identified
by Western blot and re-natured by dialysis, the protein of high purity was gained. This study laid the foundation for further verifying mature
peptide sequence of AjCathI and studying its antibacterial activities as well as other biological functions.
Key words: Anguilla japonica ；Cathelicidin ；antibacterial peptide ；RACE-PCR
2015,31(7) 125张东玲等 ：日本鳗鲡 I 型 Cathelicidin 基因的克隆与原核表达
的 cathelin 区，4 个半胱氨酸靠近 C 端形成两个分子
内二硫键，直接影响到整个分子的结构 ；C 端成熟
肽是一个高度变异的抗菌区域。Cathelicidin 在信号
肽的引导下进入细胞内部，然后切除 pro 区域，剩
下 C 端成熟肽发挥抗菌功能。迄今，已陆续在盲鳗
（Myxin eglutinosa）［1］、大西洋鲑（Salmo salar）［2］、
大 西 洋 鲟（Gadus morhua）［3，4］、 茴 鱼（Thymallus
thymallus）［5］、 香 鱼（Plecoglossus altivelis）［6］ 等 多
种鱼类确认了 Cathelicidin 类抗菌肽的存在。但在鳗
鲡还未见该抗菌肽的报道，因次，有必要深入研究
该抗菌肽的结构和功能。
我国是世界上主要鳗鲡生产国之一，在多年的
养殖过程中，病害发生较为频繁，病原复杂，其中
以细菌性和寄生虫疾病最为严重［7，8］。鳗鲡人工养
殖过程中多采用化学类药物，如抗生素等，导致细
菌和寄生虫耐药性增强、水产品药残超标及对水环
境污染，这些均严重制约着我国鳗业的健康发展［9］。
抗菌肽的制备主要有天然材料提取、化学合成和基
因工程表达 3 种方法，但抗菌肽天然提取原料有限，
产量低，提取过程又非常复杂。化学合成成本高，
价格昂贵，不利于投入实际应用。因此，借助成熟
的基因工程技术获得抗菌肽，开发药用价值，是比
较切实可行的方法。Cathelicidin 抗菌肽具有高效广
谱的抗菌活性和不易产生耐药性等特点，可在鱼病
防治中起重要作用，因此倍受关注。本研究克隆和
原核表达纯化日本鳗鲡 Cathelicidin，以期为有效控
制鳗鲡细菌性疾病提供新途径，同时也为鱼类抗菌
肽的研究提供重要的参考价值。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 pMD18-T 载体购自 TaKaRa 公
司 ；pET-28a 载 体、 大 肠 杆 菌（Escherichia coli）
DH5α、大肠杆菌 BL21（DE3）均由本实验保存。
1.1.2 主要试剂 SMARTerTM RACE cDNA Amplifica-
tion Kit 购自 Clontech 公司 ；PVDF 膜为 Roche 公司
产 品 ；TRIZOL® Reagent Total RNA Isolation Reagent
购自 Invitrogen 公司 ；DAB 染色试剂盒购自上海捷瑞
生物工程有限公司 ；丙烯酰胺、N，N-亚甲基双丙
烯酰胺为 BBI 公司产品；二硫苏糖（DDT）、过硫酸铵、
TEMED 为 Amresco 公司产品 ；SDS-PAGE 低分子量
标准蛋白质 Marker、预染 Marker 购自 Fermentas 公司；
咪唑为 Sigma 公司产品 ；Western blot 一抗（His·Tag
单 抗 ） 为 Roche 公 司 产 品 ；二 抗（ 山 羊 抗 鼠 IgG-
AP）购自上海捷瑞生物工程有限公司 ；胰蛋白胨、
酵母粉、氯化钙、氯化钠、无水乙醇、Trisbase、尿素、
磷酸氢二钠等其它常用试剂均为国产分析纯。
1.1.3 实验动物 日本鳗鲡 ：购自集美大学海水养
殖试验场，体重约 300 g，外观无明显病变和损伤。
1.2 方法
1.2.1 日本鳗鲡 AjCathI 基因 cDNA 的克隆与序列分
析 采用 Trizol 试剂盒并按照说明提取日本鳗鲡肝
脏总 RNA，提取的总 RNA 用 1% 琼脂糖电泳检测完
整性。
以 RNA 为模板，SMARTer IIA oligo 和 5- RACE
CDS Primer A 为 反 转 录 引 物（ 表 1）， 采 用 SMAR-
TerTM RACE cDNA Amplification Kit 反转录 cDNA。根
据 日 本 鳗 鲡 的 AjCathI EST（GenBank ：HS106475，
ttp ：//www.ncbi.- nlm.nih.gov/）， 设 计 引 物 扩 增
AjCathI 基因 5 端。以 cDNA 为模板，5CR1 和 UPM
为引物第一轮 PCR 扩增，反应程序为 ：94℃预变
性 2 min ；94℃变性 30 s，65℃退火 30 s，72℃延伸
2 min，共 25 个循环 ；最后 72℃延伸 5 min。随后
以第一轮 PCR 产物为模板，5CR2 和 Nest 为引物第
二轮 PCR 扩增，反应程序为 ：94℃预变性 2 min ；
94℃变性 30 s，70℃退火 2 min，5 个循环 ；94℃变
性 30 s，68℃退火 30 s，72℃延伸 2 min，25 个循环；
72℃延伸 5 min。
用 DNA 胶回收试剂盒回收 AjCathI 基因的 PCR
产物，连接于克隆载体 pMD18-T，构建 pMD-AjCathI
质粒并转化至 DH5α 感受态细胞，经 PCR 阳性克隆
鉴定后送 Invitrogen 公司测序。
1.2.2 日本鳗鲡 AjCathI 原核表达载体的构建 根据
已获得的日本鳗鲡 AjCathI cDNA 序列及 pET-28a（+）
多克隆位点，设计引物 CF 和 CR（表 1），引物分别
加入 Nco I 和 Xho I 酶切位点。以日本鳗鲡 AjCathI
（cDNA）重组 pMD18-T 阳性质粒为扩增模板，以
CF、CR 为上下游引物，用 pfu 高保真 Taq 酶扩增目
的片段。PCR 反应程序 ：94℃预变性 2 min ；94℃变
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7126
性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 35 个
循环 ；72℃延伸 5 min。PCR 产物电泳回收纯化后，
经 Nco I 和 Xho I 双酶切后，克隆于表达载体 pET-
28a（+），转化至 DH5α 感受态细胞，并利用卡那霉
素抗性平板筛选阳性克隆，经 PCR 阳性克隆鉴定后
送 Invitrogen 公司测序。
1.2.3 重组蛋白诱导表达条件的优化与表达形式的
鉴定 经测序准确后，将携带目的基因的 pET-28a/
AjCathI 的重组质粒转化入表达受体菌 BL21（DE3）。
挑取单克隆，接种于 LB/KMN 培养基，37℃、250
r/min 培养过夜，次日按 1∶100 的比例加入到新鲜
的 LB/KMN 培养基中，37℃，250 r/min 剧烈震荡培
养。分别进行诱导温度、诱导剂浓度、诱导时间和
诱导菌起始生长量对重组蛋白表达量的影响。收集
菌液，SDS-PAGE 蛋白电泳检测。同时设空载体，
未加 IPTG 的重组质粒作对照。
收 集 表 达 的 菌 体， 超 声 波 破 碎， 于 4℃，
4 000×g 离心 20 min，分别收集上清和沉淀，取样
进行 SDS-PAGE 电泳检测，鉴定重组蛋白表达的
形式。
1.2.4 重组表达蛋白的纯化与 Western blot 鉴定 大
量表达重组蛋白 AjCathI 2-3 L，离心收集菌体。用
预冷的裂解缓冲液悬浮菌体，加入适当的蛋白酶抑
制剂 PMSF。冰浴下超声破碎菌体至菌液较清无黏
性（功率 400-480 W，破碎 5 s 间隔 10 s，25 min）。
4 000×g 离 心 20 min， 收 集 沉 淀， 再 用 10 mL 0.5
mol/L 尿 素，PBS 洗 涤 液 各 清 洗 一 次，4 000×g 离
心 20 min 取沉淀。沉淀用结合缓冲液充分溶解后，
10 000×g 离心 10 min，取上清用 0.45 μm 滤膜过滤，
滤液经 AKTA-purifier 100 纯化系统，金属镍螯合层
析柱纯化。用 25 mL 洗脱缓冲液洗脱目标蛋白，流
速 1 mL/min，检测波长 A280。收集洗脱峰蛋白，取
少量 SDS-PAGE 电泳。
取纯化后的重组蛋白经 SDS-PAGE 电泳后，100
mA，转移 1 h，将蛋白印迹至 PVDF 膜上。1% 牛血
清白蛋白 /TBST 封闭液 1∶6 000 稀释一抗（His·Tag
单抗），4℃孵育过夜。1∶10 000 稀释二抗（山羊抗
鼠 IgG-AP），室温孵育 1 h。DAB 显色，清水洗净，
观察结果。
1.2.5 重组表达蛋白的复性 采用透析法，将洗
脱缓冲液中的 8 mol/L 尿素逐步降低至 6、4、2 和
1 mol/L 透析重组表达蛋白，最后用 PBS 溶液透析
1 次，将目的蛋白溶液中的尿素完全去除。由于
蛋白在变性状态时疏水残基暴露，一般水溶性很
差，大多会形成可见的沉淀析出。复性后的蛋白溶
解度增加，但仍然会有一些没有复性成功的蛋白沉
淀，10 000×g 离心 10 min，收集上清。同时取少
量 SDS-PAGE 电泳检测复性后的重组蛋白是否发生
断裂。
2 结果
2.1 日本鳗鲡AjCathI基因cDNA的获得
应 用 特 异 性 引 物 5CR1、5CR2 和 SMARTerTM
RACE cDNA Amplification Kit 提供的通用引物，从
日 本 鳗 鲡 肝 组 织 扩 增 出 一 条 约 300 bp 大 小 的 片
段，经纯化、连接、转化、质粒提取和阳性克隆鉴
定，得到阳性重组子并测序。结果得到一条包含 5
UTR 和一部分编码在内的 349 bp 的片段，与日本
表 1 AjCathI 克隆和原核表达的引物
名称 序列（5-3） 目的
5CR1 GTTTGCCTGTCTGTTCGTCTGTGCGTT 5 RACE
5CR2 GGGTGCCACTGTCTCCCTTGTCTC
CF GCGCCATGGGCCAGCGTGGAGTGGAGTTTAG 扩增表达序列
CR GGGCTCGAG TGCAGTTCGGGTGCCACT
SMARTer IIA oligo AAGCAGTGGTATCAACGCAGAAGTAC×××× 5 cDNA 合成
5- RACE CDS Primer A （T）25VN
10× Universal Primer A Mix（UPM） Long ：CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAG RACE 通用引物
TGGTATCAACGCAGAGT
Short ：CTAATACGACTCACTATAGGGC
Nest primer AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
2015,31(7) 127张东玲等 ：日本鳗鲡 I 型 Cathelicidin 基因的克隆与原核表达
鳗鲡 AjCathI 3 Race 产物比对，两者有一个 223 bp
的重叠区，经过序列拼接和碱基校对最终得到 842
bp 全 长 的 AjCathI cDNA。AjCathI cDNA 序 列 由 69
bp 5 UTR、570 bp ORF 和 203 bp 3 UTR 三部分组
成，编码 189 个氨基酸（图 1）。经提交 GenBank 检
索表明，从日本鳗鲡肝脏分离得到的 AjCathI 基因
属于新的 Cathelicidin 家族基因，GenBank 登录号为
AFP72291。
1
61
121
18
181
68
241
58
301
78
361
98
421
118
481
138
541
158
601
178
661
721
781
841
1
60
120
180
37
240
57
300
77
360
97
420
117
480
137
540
157
600
177
660
189
720
780
840
842
17
大写字母代表 5 和 3 UTR ；小写字母代表编码区 ；阴影部分代表编码的氨基酸序列 ；阴影黑体字代表推
导的成熟肽序列 ；起始密码子 ATG 用方框标明 ；* 显示终止密码子 TAG ；3 非编码区的多腺甘酸化信号
AATAA 用斜体字标明 ；信号肽用下划线标明
图 1 日本鳗鲡肝脏 AjCathI 全长 cDNA 及由此推导出的氨基酸序列
2.2 日本鳗鲡AjCathI基因与其他动物Cathelicidin
基因编码的氨基酸同源性比对与序列分析
日本鳗鲡 AjCathI cDNA 推导的氨基酸序列与部
分已分离到的或由核苷酸推导出的 Cathelicidin 序
列比对，显示 4 个半胱氨酸保守位点高度一致，并
且同一属的鱼类，Cathelicidin 在信号肽氨基酸的
组 成 上 基 本 一 致。AjCathI 并 不 含 有 Cathelin 保 守
区，与其他动物 Cathelicidin 氨基酸同源性较低，为
25%-53%。参考已报道源于嗜中性粒细胞弹性蛋白
酶作用的位点，推测 AjCathI 成熟肽为 50 个氨基酸
（图 1）。AjCathI 抗菌成熟肽与香鱼抗菌成熟肽相似
性最高，同源性为 65.57%。系统进化分析（图 2）
表明，AjCathI 与鱼类亲缘关系较近，与大西洋鲟
Cathelicidin 同源性最高，处在同一个分支上。
2.3 日本鳗鲡AjCathI的原核表达
取单克隆阳性鉴定，测序，结果证明连接正确，
核苷酸的开放阅读框（ORF）编码连续，并连有 6
个 His 标签，最终获得正确构建的 pET-28a /AjCathI
表 达 载 体。 将 pET-28a /AjCathI 重 组 质 粒 转 化 至
BL21（DE3）， 诱 导 表 达， 表 达 产 物 经 15% SDS-
PAGE，对凝胶染色、脱色后，重组质粒和空质粒相
比，具有明显的表达蛋白带，重组质粒表达蛋白分
子量在 19.0 kD 左右，与计算的理论分子量 19.575
kD 相似（图 3）。
2.4 重组蛋白表达形式的鉴定
取表达菌体超声波破碎并离心后的上清和沉
淀， 进 行 SDS-PAGE 电 泳 结 果（ 图 4） 显 示， 可
见表达产物绝大部分以包涵体形式存在于菌体沉
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7128
70
0.05
96
62
100
100
99
78
46 99
92
98
87
91
88
86
48
Homo
Equus
Mus
MgCath29
MgCath37
AcCathIII
AcCathI
AcCathII
AyCathII
BrCathII
CsCathII
AsCathII
RtCathII
BrCathI
AcCathI
GrCathI
AsCathI
BtCathI
RtCathI
AjCathI
各序列 SwissProt 或者 GenBank 登录号为 ：北极红点鲑 AchCathI（Salvelinus
alpinus，ACE96052）， 美 洲 红 点 鲑 BrCathI 和 BrCathII（S. fontinalis，CAQ-
60111，CAQ60110），大西洋鲑 AsCathI 和 ASCathII（Salmo salar，AAR13366，
NP_001117045，虹鳟 RtCathI 和 RtCathII（Oncorhynchus mykiss，AAT67998，
AAR13365）， 大 鳞 大 马 哈 鱼 CsCathII（O.tshawytscha，ABW96220）， 茴 鱼
GrCathI（Thymallus thymallus，CAQ60112），河鳟 BtCathI（S. trutta fario，AB-
W16872）， 香 鱼 AyCathII（Plecoglossus altivelis，CBV36822）， 大 西 洋 鳕 鱼
ACCathI（Gadus morhua，1ACE96051，2ACE96051，3ACE96051），盲鳗 Mg-
Cath37 和 MgCath29（Myxine glutinosa，AAQ04688，AAQ04687），小鼠（Mus
musculus，EDL09033），马（Equus caballus，CAA12227），人类（Homo sapi-
ens，EAW64854）。
图 2 日本鳗鲡 AjCathI 氨基酸序列与其它已知 Cathelici-
din 氨基酸序列系统进化树分析
116.0
kD
M 1 2 3 4 5 6 7
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.0
AjCathI
M ：低分子量标准蛋白质 Marker ；1 ：pET-28a /AjCathI 重组质粒未诱导 ；2-7 ：
依次为 pET-28a /AjCathI 重组质粒在诱导时间为 3、4、5、6、7 和 8 h 的诱
导表达蛋白
图 3 pET-28a/AjCathI 重组质粒在不同诱导时间下的表达
结果
116.0
kD M 1 2 3 4 5 6
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.0
AjCathI
M ：SDS-PAGE 低分子量标准蛋白质 Marker ；1 ：pET-28a/AjCathI 未诱导菌
体总蛋白 ；2 ：pET28a 空载体 42℃诱导 7 h ；3，6 ：pET-28a/AjCathI 诱导菌
体超声波破碎后沉淀 ；4，5 ：pET-28a/AjCathI 诱导菌体超声波破碎后上清
图 4 重组表达 pET-28a/AjCathI 蛋白 SDS-PAGE 电泳
结果
600
mAU
500
400
300
200
100
0
0 5 10 15 20 25 mL
实线代表 A280 nm 紫外吸收曲线，虚线代表咪唑浓度
图 5 亲和层析柱（IMAC）纯化目的蛋白 AjCathI
淀中，菌体上清中几乎没有可溶状态的表达产物
存在。
2.5 重组蛋白表达的纯化
为了得到 AjCathI 表达产物，将超声破碎菌体
收集的沉淀部分过镍离子螯合亲和层析柱，用咪唑
洗脱螯合的融合蛋白，280 nm 检测紫外吸收曲线，
可见到明显的洗脱蛋白峰（图 5）。收集洗脱部分
进行 SDS-PAGE 电泳（图 6），两个蛋白洗脱峰中均
含有目的蛋白 AjCathI。以 6-His-tag 单克隆抗体做
Western blot 鉴定纯化产物，结果（图 7）显示为阳
性条带。
2015,31(7) 129张东玲等 ：日本鳗鲡 I 型 Cathelicidin 基因的克隆与原核表达
2.6 重组蛋白的复性
通过黏度和浊度判断蛋白复性效果，重组蛋白
最终溶解于 PBS 溶液中，呈现透明状态，说明复性
成功。SDS-PAGE 电泳（图 8）显示均有目的条带，
说明蛋白复性过程中基本没有发生降解和断裂。
3 讨论
Cathelicidin 根 据 成 熟 肽 二 级 结 构 的 不 同 分
为 以 下 四 大 类 ：第 一 类 是 α-螺 旋 结 构（ 如 鼠 的
CRAMP）［10］；第 二 类 是 延 伸 螺 旋 结 构（ 如 牛 的
indolicidin）［11］，一般含有大量的脯氨酸（13%-49%）
和精氨酸（13%-33%）；第三类是环状结构（如牛
的 bactenecin）［12］，这一类分子由于含有一个二硫键
而形成环状 ；第四类是 β 折叠结构（如猪的 protegr-
in1）［13］，这一类分子通常含有 2-3 个二硫键，这些
分类结构有利于抗菌肽与细菌细胞膜结合［14］。抗
菌 肽 预 测 工 具（http ：//aps.unmc.edu/ AP/prediction/
prediction_main.php）分析 AjCathI 成熟肽含有疏水
性氨基酸残基蛋氨酸 1 个，丙氨酸 2 个，疏水性比
例为 10%，电荷为 +11。DNAstar 软件分析，结果显
示整个成熟肽形成亲水性很强的区域，AjCathI 为亲
水性强阳离子抗菌肽，没有 α 螺旋结构，形成延伸
和任意卷曲的可能性比较大。Garnier 等［15］方法分
析，AjCathI 形成延伸结构的比例为 18%，任意卷曲
的比例为 82%。Geourjon 等［16］ 方法分析，AjCathI
形成延伸结构的比例为 16%，任意卷曲的比例为
84%。Frishman 等［17］ 方法分析，AjCathI 形成任意
卷曲的可能性为 100%。该抗菌肽与以往的抗菌肽结
构有一定的差异，其是否在水溶液中形成任意卷曲
结构，而在与生物膜接触时形成 α 螺旋结构有待进
一步考证，因此抗菌作用机制还有待通过圆二色谱
及定位圆二色谱法、固相核磁共振技术、中子衍射
和 X-光散射等技术进一步研究。
目前，用于原核表达系统的基因工程载体主要
分为非融合表达载体和融合表达载体，后者又以携
带 6×His Tag 和谷胱甘肽转移酶标签（GST Tag）的
载体应用最为广泛。本试验选用了高效融合表达载
体 pET-28a，pET-28a 为含有 T7 强启动子的原核高
效表达载体，可将目的序列插入多克隆位点，表达
出目的蛋白，同时载体携带有 6 个 His 标签，便于
后续的纯化。在实验中我们曾经尝试用 pGEX-4T-1
表达载体，通过控制培养条件，诸如 IPTG 浓度、培
养温度和诱导时间等来增加蛋白的表达量，但多次
实验证明了 pGEX-4T-1 质粒无法表达重组蛋白。
诱导条件对重组蛋白的表达也有不同程度的影
M
116.0
kD
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14.0
1 2
M ：低分子量标准蛋白质 Marker ；1，2 ：IMAC 洗脱 AjCathI 蛋白
图 6 IMAC 洗脱蛋白电泳
M
100
kD
70
55
40
35
25
15
1 2
M ：低分子量标准蛋白质预染 Marker ；1，2 ：硝酸纤维素杂交膜印迹
图 7 Western blot 鉴定 AjCathI
M
116.0
66.2
45.0
35.0
14.0
25.0
18.4
1
M ：低分子量标准蛋白质 Marker ；1 ：复性后的重组蛋白
图 8 重组蛋白复性分析
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2015,Vol.31,No.7130
响，如 IPTG 浓度、诱导时间、诱导温度、大肠杆
菌起始浓度、培养基的组成、pH 和溶解氧等。王沛
珍［18］报道低温 16℃可以增加 thanatin 抗菌肽表达
量和可溶性，同时诱导 9 h 为最佳诱导时间。Ramos
等［19］报道将诱导温度从 37℃降到 30℃可以增加满
月 蛤（Lucina pectinata）rHbII 的 表 达 量。Ma 等［20］
报道在 YT 培养基中加入 0.5%（w/v）的葡萄糖可以
显著增加 adenoregulin 抗菌肽的表达量。本实验发现
诱导温度和诱导时间对 Cathelicidin 蛋白的表达量有
比较显著的影响。AjCathI 在温度为 42℃，诱导时间
为 7 h 蛋白表达量最高。
在原核表达过程中导致包涵体形成的原因有很
多［21-23］。本实验最终得到目的蛋白是以包涵体的形
式存在，包涵体存在也有优点，如蛋白质表达量高，
可避免宿主细胞蛋白酶对目的蛋白降解，包涵体易
从宿主细胞中纯化，可避免毒性蛋白（如毒素蛋白）
对宿主细胞的毒性等优势。洗脱目的蛋白的方法有
两种，一种是降低 pH 洗脱，降低 pH 值可以减弱组
氨酸和镍离子之间的作用力，从而对蛋白进行洗脱，
降低 pH 值洗脱不会在洗脱的蛋白中带入高浓度的
咪唑，但很可能引起目标蛋白在等电点附近的沉淀。
另一种方法是升高咪唑的浓度，竞争目的蛋白与
Ni2+ 结合，从而洗脱蛋白。此方法简单易行，但同
时洗脱的目的蛋白含有高浓度的咪唑。此外，也有
用咪唑和降低 pH 值相结合的方法进行洗脱，Zhang
等［24］先用 60 mmol/L pH8.0 的咪唑洗脱杂蛋白，再
用 pH4.0 的缓冲液洗脱目的蛋白 hepcidin。本实验采
用了一步咪唑洗脱方法，最终得到大量的 AjCathI 蛋
白。包涵体复性的方法有很多，如稀释复性、透析
复性、超滤复性、层析柱复性、温度跳跃式复性等。
本实验采用了透析复性，最终灭菌水溶解冻干的目
的蛋白澄清，说明复性成功，SDS-PAGE 电泳检测
蛋白完整性很好。
LL-37 是人类唯一的 Cathelicidin 类抗菌肽，具
有广谱的抗菌活性、化学趋化性及促进血管生成和
伤口修复性等特点，致使许多学者采用不同的方法
体外表达重组蛋白，包括采用 GST 和 pET 系列载体
及不同的纯化方法。冯云等［25］表达了 GST-FALL-39
（最开始推测的人类 Cathelicidin 成熟肽，其比 LL-37
多两个氨基酸）抗菌肽，GST-FALL-39 存在于菌体
裂解液的上清中，通过凝胶 4B 柱及 AU-PAGE 得到
高纯度的蛋白。Moon 等［26］应用与冯云等相似的方
法表达出 GST-LL-37 融合蛋白，并发现低温 30℃，
及低 IPTG 浓度（0.1 mmol/L）可以显著增加可溶性
重组蛋白的产量。Li 等［27］应用 pET32a 载体也表达
出可溶性的 LL-37 重组蛋白，应用亲和色谱和反相
色谱去除硫氧还原蛋白及其它杂蛋白，得到含有 6
个 His-tag 的 LL-37 蛋白。鱼类 Cathelicidin 如同哺乳
动物一样只有成熟肽部分具有抗菌活性。一些学者
原核表达出 Cathelicidin prodomain，再用弹性蛋白酶
酶解重组蛋白，确认出成熟肽序列。至今大西洋鳕
鱼、虹鳟、香鱼 Cathelicidin 成熟肽已得到确认，成
熟肽均具有较强的抗菌活性。
4 结论
本研究克隆并表达了日本鳗鲡抗菌肽 AjCathI。
AjCathI 的 cDNA 全 长 为 842 bp， 编 码 189 个 氨 基
酸。将 AjCathI 基因克隆至 pET-28a 载体，pET-28a/
AjCathI 蛋白最佳表达条件为 42℃，诱导 7 h，并以
包涵体形式存在。经鎳柱纯化、Western blot 验证和
透析复性，最终获得高纯度的重组蛋白。
参 考 文 献
［1］ Uzzell T, Stolzenberg ED, Shinnar AE, et al. Hagfish intestinal
antimicrobial peptides are ancient cathelicidin［J］. Peptides,
2003, 24（11）：1655-1667.
［2］ Chang CI, Zhang YA, Zou J, et al. Two cathelicidin genes are present
in both rainbow trout（Oncorhynchus mykiss）and Atlantic salmon
（Salmo salar）［J］. Antimicrob Agents, 2006, 50（1）：185-195.
［3］ Maier VH, Dorn KV, Gudmundsdottir BK, et al. Characterisation of
cathelicidin gene family members in divergent fish species［J］.
Mol Immunol, 2008, 45（14）：3723-3730.
［4］ Broekman DC, Frei DM, Gylfason GA, et al. Cod cathelicidin ：
Isolation of the mature peptide, cleavage site characterization and
developmental expression［J］. Dev Comp Immunol, 2011, 35（3）：
296-303.
［5］ Scocchi M, Pallavicini A, Salgaro R, et al. The salmonid cathelicidin：
A gene family with highly varied C-terminal antimicrobial domains
［J］. Comp Biochem Physiol B, 2009, 152（4）：376-381.
［6］ Lu XJ, Chen J, Huang ZA, et al. Identification and characterization
2015,31(7) 131张东玲等 ：日本鳗鲡 I 型 Cathelicidin 基因的克隆与原核表达
of a novel cathelicidin from ayu, Plecoglossus altivelis［J］. Fish
Shell Immunol, 2011 ：31（1）：52-57.
［7］ Arafa SZ, Reda ES. Surface features of the monogenean gill parasites
Pseudodactylogyrus anguillae and Pseudodactylogyrus bini from the
European eel Anguilla anguilla in Egypt［J］. Parasitol Res, 2012,
110 ：127-133.
［8］ Cao HP, He S, Wei RP, et al. Bacillus amyloliquefaciensG1 ：A
potential antagonistic bacterium against eel-pathogenic Aeromonas
hydrophila［J］. Evid Based Complement Alternat Med, 2011,
82104 ：1-7.
［9］ Bergwerff AA, Scherpenisse P. Determination of residues of
malachite green in aquatic animals［J］. J Chromatogr B Analyt
Technol Biomed Life Sci, 2003, 788 ：351-359.
［10］ Chen K, Xiang Y, Huang J , e t a l . The fo rmylpep t ide
receptor 2（Fpr2）and its endogenous l igand cathelin-
related antimicrobial peptide（CRAMP）promote dendritic cell
maturation［J］. J BiolChem, 2014, 289（25）：17553-17563.
［11］ Végh AG, Nagy K, Bálint Z, et al. Effect of antimicrobial peptide-
amide ：indolicidin on biological membranes［J］. J Biomed
Biotechnol, 2011 ：670589.
［12］ Lee JY, Yang ST, Kim HJ, et al. Different modes of antibiotic
action of homodimeric and monomeric bactenecin, a cathelicidin-
derived antibacterial peptide［J］. BMB Rep, 2009, 42（9）：
586-592.
［13］ Baumann A, Démoulins T, Python S, et al. Porcine cathelicidins
efficiently complex and deliver nucleic acids to plasmacytoid
dendritic cells and can thereby mediate bacteria-induced IFN-α
responses［J］. J Immunol, 2014, 193（1）：364-371.
［14］ Ramanathan B, Davis EG, Ross CR, et al. Cathelicidin ：
microbicidal activity, mechanisms of action, and roles in innate
immunity［J］. Microbes Infect, 2002, 4（3）：361-372.
［15］ Garnier J, Gibrat JF, Robson B. GOR method for predicting protein
secondary structure from amino acid sequence［J］. Methods
Enzymol, 1996, 266 ：540-553.
［16］ Geourjon C, Déleage G. SOPMA: Significant improvements in
protein secondary structure prediction by consensus prediction from
multiple alignments［J］. CABIOS, 1995, 11（6）：681-684.
［17］ Frishman D, Argos P. Incorporation of non-local interactions
in protein secondary structure prediction from the amino acid
sequence［J］. Protein Eng, 1996, 9（2）：133-142.
［18］ 王沛珍 . Thanatin 的原核表达、纯化及其抗菌活性的检测［D］.
广州 ：南方医科大学 , 2010.
［19］ Ramos C, Pietri R, Lorenzo W, et al. Recombinant hemoglobin II
from Lucina pectinata ：A large-scale method For hemeprotein
expression in E. coli［J］. Protein J, 2010, 29（2）：143-151.
［20］ Ma YS, Cao W, Zhou YX, et al. Expression and purifcation of
antimicrobial peptide adenoregulin with C-amidated terminus in
Escherichia coli［J］. Protein Expr Purif, 2005, 40（2）：404-
410.
［21］ Villaverde A, Carril M. Protein aggregation in recombinant
bacteria ：biological role of inclusion bodies［J］. Biotechnol Lett,
2003, 25（17）：1385-1395.
［22］ Ventura S. Sequence determinants of protein aggregation ：tools to
increase protein solubility［J］. Microb Cell Fact, 2005, 4（1）：
11-18.
［23］ 王增 , 马会勒 , 张文 , 等 . 包涵体蛋白的分离和色谱法体外
复性纯化研究进展［J］. 中国生物工程杂志 , 2009, 29（7）：
102-107.
［24］ Zhang JJ, Yan QP, Ji RX, et al. Isolation and characterization of
a hepcidin peptide from the head kidney of large yellow croaker,
Pseudosciaena crocea［J］. Fish Shell Immunol, 2009, 26 ：864-
870.
［25］ 冯云 , 杨云霞 , 黄宁 , 等 . 人抗菌肽 FALL-39 在大肠杆菌中高
效表达［J］. 生物医学工程杂志 , 2003, 20（4）：634-637.
［26］ Moon JY, Henzler-Wildman KA, Ramamoorthy A. Expression and
purification of a recombinant LL-37 from Escherichia coli［J］.
Biochim Biophys Acta, 2006, 1758（9）：1351-1358.
［27］ Li Y, Li X, Wang G. Cloning, expression, isotope labeling, and
purification of human antimicrobial peptide LL-37 in Escherichia
coli for NMR studies［J］. Protein Expr Purif, 2006, 47（2）：
498-505.

（责任编辑 马鑫）