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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第3期
近年来，生物脱氮在废水处理中因其高效、管
理成本低、无二次污染而成为污水净化研究的热点，
氮素的去除由硝化和反硝化两个过程来完成。硝化
作用一般在好氧条件下进行，传统认为细菌的反硝
化是一个严格的厌氧过程，反硝化作用是硝态氮或
亚硝态氮被还原成含氮气体（NO，N2O）及氮气的
过程。反硝化反应过程中，可能存在两种转化途径，
一种为同化反硝化（合成），形成有机氮化合物，将
其转化为菌体的组成部分 ；另一种为异化反硝化
（分解），最终产物是气态氮，或者其它气态氮氧化
物［1］。 自 Robertson 等［2］ 首 次 发 现 了 好 氧 反 硝 化
细菌 Thiosphaera pantotroph 后，好氧反硝化菌株已
在很多报道中出现，如 Pseudomonas aeruginosa［3］、
收稿日期 ：2012-11-23
基金项目 ：海洋公益性行业科研专项经费子课题（201305001-4）
作者简介 ：石小彤，女，硕士研究生，研究方向 ：水生生物学 ；E-mail ：shi.880902@yahoo.com.cn
通讯作者 ：康现江，男，教授，博士生导师，研究方向 ：水产动物生殖、发育及其调控 ；E-mail ：xjkang218@126.com
一株耐盐好氧反硝化细菌的分离筛选及鉴定
石小彤  李彦芹  邢国伟  康现江
（河北大学生命科学学院，保定 071002）
摘 要： 对对虾养殖池底泥进行富集分离，从 4 株反硝化细菌中筛选出一株高效的好氧反硝化菌株 F1。该菌能在好氧条件下，
40 h 内高效地将硝酸盐浓度由 442.28 mg/L 降至 58.28 mg/L，亚硝酸盐浓度由 32.79 mg/L 降至 0.98 mg/L，反硝化作用主要发生在对
数生长期。经菌落形态学特征、生理生化反应及 16S rDNA 分子鉴定，初步鉴定为盐单胞菌。
关键词 ： 好氧反硝化细菌 反硝化效率 盐单胞菌 耐盐
Screening and Primary Identification of an Aerobic Denitrifier
Isolate with Salt Tolerance
Shi Xiaotong Li Yanqin Xing Gongwei Kang Xianjiang
（College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002）
Abstract:  Selective enrichment culture method under oxygen conditions was used for screening bacteria，the 4 strains which have
capability of aerobic denitrification was isolated from a shrimp pond. A strong denitrifying effect bacteria was selected from them（F1）. The
bacterium reduced the concentrations of nitrate nitrogen rapidly from 442.28 mg/L to 58.28 mg/L, nitrite nitrogen from 32.79 mg/L to 0.98 mg/L
with 40 h in aerobic conditions. It identified as Halomonas sp. based on its biochemical and morphological characters. Phylogenetic analysis
of 16S rDNA sequences indicated that strain F1 was most closely related to Halomonas alimentaria. The denitrification mainly occurs in the
logarithmic growth phase.
Key words:  Aerobic denitrifier Denitrification efficiency Halomonas sp. Salt tolerance
Pseudomonas chloritidismutans［4］、Alcaligenes piechau-
dii［5］、Bacillus licheniform［6］等。好氧反硝化细菌的
存在使得硝化与反硝化得以在同一个反应器里面进
行，降低运行成本，硝化反应的底物可直接成为反
硝化反应的底物，加速了硝化反应的过程，同时反
硝化反应释放的 OH-会补偿硝化反应消耗的碱，避
免酸性物质的积累，维持 pH 值稳定［7］。
目前海水水质处理中针对亚硝酸盐还原的好氧
反硝化细菌相关报道较少，好氧反硝化细菌大多是
从淡水环境中分离得来。本试验在盐度为 33 的情况
下筛选出一株对硝酸盐和亚硝酸盐具有较强反硝化
作的菌株，以期为好氧反硝化细菌在海水水产养殖
水质改良方面提供基础资料。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期176
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株来源 秦皇岛对虾养殖池底泥。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 反硝化富集分离培养基（DM）（g/L） Na2-
HPO4·7H2O 7.9，KH2PO4 1.5，NH4Cl 0.3，KNO3 2.0，
MgSO4·7H2O 0.1，琥珀酸钠 4.7，NaNO2 0.5，NaCl
33.0，微量元素溶液 2 mL ［微量元素溶液配方（g/L）：
EDTA 50.0，ZnSO4 2.2，CaCl2 5.5，MnCl2·4H2O 5.06，
FeSO 4·7H 2O 5.0，CuSO 4·5H 2O 1.57，（NH 4） 6-
Mo7O24·4H2O 1.1，CoC12·6H2O 1.61，pH7.0-7.5］。
1.1.2.2 初 筛 培 养 基（BTB）［8］（g/L） KNO3 1.0，
KH2PO4 1.0，FeCl3·6H2O 0.05，CaCl2·2H2O 0.2， 琼
脂 15.0，MgSO4·7H2O 1.0，1 mL BTB，NaCl 33.0，
pH7.0-7.3。
1.1.2.3 细菌培养基（g/L） 牛肉膏 3.0，蛋白胨 10.0，
H2O 1 L，NaCl 33.0，pH7.0-7.2。
1.1.2.4 反硝化性能测试培养基（g/L） A ：细菌培
养基 + KNO3 0.5 g ；B ：细菌培养基 + NaNO2 0.5 g。
1.2 方法
1.2.1 分离方法
1.2.1.1 初筛 取活性污泥 1 g 接种到装有 200 mL
灭菌的反硝化培养液的锥形瓶中，振荡使其混匀，
锥形瓶用纱布封口，摇床振荡培养 3 d，转速为 130
r/min，如此重复操作 3 次，以富集反硝化细菌。
富 集 完 成 后， 取 菌 悬 液 进 行 BTB 平 板 涂 布，
30℃温箱培养 2-3 d，待菌落长出后，挑取蓝色和蓝
色晕圈的单菌落，在固体细菌培养基上多次划线纯
化，直至其有清晰的单菌落，无杂菌和伴生菌，将
纯化好的菌落转接到试管斜面，温箱静置培养 3 d
后放冰箱 4℃保存。
1.2.1.2 复筛 定性测试 ：将保存在斜面上的菌株
接种到反硝化培养液中，室温振荡培养 2-3 d。吸取
少量菌液，滴加格里斯试剂和二苯胺试剂，进行显
色反应。将有显色反应的菌株接种到反硝化培养基
试管内，恒温培养，观察德汉氏小管内有无气体。
定量测试 ：接种斜面菌株于细菌液体培养基
中，摇床培养 48 h 作为种子，以 2% 的接种量转接
到 200 mL 反硝化培养基中，摇床振荡 3 d 后，取菌
液检测培养基的总氮含量，并计算总脱氮率，从中
筛选出总脱氮率最高的一株菌株。接种该菌株于反
硝化性能测试培养基 A 和 B，30℃下 130 r/min 振荡
培养，每隔 10 h 检测硝酸盐和亚硝酸盐浓度。
每个试验重复 3 次，每组设置 3 个平行，未接
种细菌的灭菌培养液作为空白样。
1.2.2 分析方法 总氮（TN）采用碱性过硫酸钾紫
外线分光光度法检测 ；硝酸氮（NO3
--N）用紫外分
光光度法检测 ；亚硝酸氮（NO2
--N）测定用 N-（1-
萘基）-乙二胺光度法［9］。测定 TN 时培养液不离心，
直接稀释测定，而测定 NO3
--N 和 NO2
--N 时，培养
液12 000 r/min离心10 min，将菌体去除，取上清测定。
1.2.3 好氧反硝化细菌的鉴定
1.2.3.1 菌株形态学观察 取有单菌落的培养皿，
拍照得菌落照片，对筛选菌株进行革兰氏染色，将
染色后的细菌于显微镜下观察。
1.2.3.2 菌体生长曲线 吸光度法用 721 分光光度
计在光波长为 660 nm 处测量吸光度值。在温度为
30℃、接种量为 2%、120 r/min 摇床振荡培养，每
隔 6 h 采样测定菌液 OD 值。
1.2.3.3 生理生化鉴定 参照《常见细菌系统鉴定
手册》［10］。
1.2.3.4 菌株 16S rDNA 序列分析 将筛选所得菌
株保存至斜面送交至北京基诺莱普生物技术有限
公 司 测 序，16S rDNA 扩 增 引 物 ：上 游 为 27F（5-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3），下游引物为 1492R
（5-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3），测序结果通过
GenBank Blast 进行比对分析。
2 结果
2.1 菌株的筛选
通过对细菌的富集分离纯化及显色反应，筛选
得到 35 株菌株，编号为 F1-F35。将这 35 株菌株接
种到装有德汉氏小管的反硝化培养基试管内，2 周
后有 4 个菌株内的德汉氏小管内有气体。它们分别
为 F1、F14、F26 和 F29，说明这 4 株菌株能较好地
降解硝酸盐和亚硝酸盐，反硝化过程较为彻底，反
硝化作用较强。
图 1 为 菌 株 F1、F14、F26 和 F29 的 脱 氮 率，
在 3 d 之内它们对培养基中总氮的消解率都达到了
2013年第3期 177石小彤等 ：一株耐盐好氧反硝化细菌的分离筛选及鉴定
50% 以上，没有接入细菌的对照反硝化培养液（CK）
总氮含量变化很少，这 4 株菌株中菌株 F1 的脱氮率
最高，达到 71.4%，其余 3 株分别为 51.25%、55%
和 60.7%。由于 TN 测定中包含了微生物同化的氮，
同时摇床震荡确保了好氧条件，因此，本研究中总
氮的减少主要源于微生物好氧反硝化作用所致，含
氮量越低表明菌株降解能力越强，总氮的减少程度
即代表了反硝化脱氮的效果。由此得知，菌株 F1 好
氧反硝化脱氮效果最好。
率为 76.49% ；20-40 h，培养液中亚硝酸盐浓度持续
下降，浓度低至 0.98 mg/L，脱氮速率 0.34 mg/L·h ；
从接入菌株开始至结束，即 70 h 内，脱氮速率 0.46
mg/L·h，最终 NO2
--N 的积累量仅为 0.93 mg/L，实
现了较高效率的脱氮，且反硝化速率较快 ；40 h 后
亚硝酸盐浓度一直保持在极低的水平。硝酸盐浓度
0
10
20
30
40
50
60
70
80
F1 F14 F26 F29 CK㧼Ṛ㕆ਧ
TN
৫䲔
⦷%

图 1 不同菌株总氮的去除率比较
2.2 菌株的好氧反硝化特性
将菌株 F1 接种于培养基 A 和对照组中，即以
NO3
-为唯一氮源，测定 NO3
--N 和 NO2
--N 含量，结
果见图 2 和表 1。前 10 h 内培养基中硝酸盐浓度由
442.28 mg/L 降 至 195.39 mg/L， 脱 氮 率 为 55.82%，
脱氮速率为 24.69 mg/L·h ；10-40 h 期间，硝酸盐
浓度依然持续下降，由 195.39 mg/L 低至 58.28 mg/L，
脱氮速率为 4.57 mg/L·h，脱氮率为 70.17% ；亚硝
酸盐浓度在 10 h 时增至 109.14 mg/L 然后下降，在
30 h 时低至 75.19 mg/L，降低了 33.95 mg/L，随后
NO2
--N 浓度维持在此范围左右。在此过程中反硝化
存在明显的 NO2
--N 浓度升高又降低的现象，推断菌
株 F1 并不是将 NO3
--N 直接还原为含氮气体及氮气，
NO3
--N 先被还原为 NO2
--N，NO2
--N 又被还原为气体。
菌株 F1 并非全部将 NO3
-转化为后 NO2
-才开始利用
NO2
-，而是可以同时利用 NO3
--N 和 NO2
--N，由此得
知两者之间并不存在激烈的竞争。
将 菌 株 F1 接 种 于 培 养 基 B 和 对 照 组， 即 以
NO2
-为唯一氮源，由图 3 和表 1 得知，亚硝酸盐浓
度初始为 32.79 mg/L，20 h 后降至 7.71 mg/L，脱氮
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 10 20 30 40 50 60 70
ᰦ䰤˄h˅
⎃ᓖ
mg
/L

NO3

NO2

图 2 A 培养基内 NO3
--N 和 NO2--N 浓度变化
0
5
10
15
20
25
30
35
0 10 20 30 40 50 60 70
时间（h）
⎃ᓖ
mg
/L

NO3

NO2

图 3 B 培养基内 NO3
--N 和 NO2--N 浓度变化
时间
（h）
A 中 NO3
--N
浓度（mg/L）
A 中 NO2
--N
浓度（mg/L）
B 中 NO3
--N
浓度（mg/L）
B 中 NO2
--N
浓度（mg/L）
0 442.28 0.14 0.78 32.79
10 195.39 109.14 1.15 15.28
20 103.19 77.85 1.85 7.71
30 67.61 75.19 1.29 3.76
40 58.28 85.92 1.38 0.98
50 51.07 74.81 1.28 1.25
60 49.34 75.3 1.44 0.75
70 50.15 74.57 1.96 0.93
表 1 培养基 A 和 B 中 NO3
--N 和 NO2--N 浓度变化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期178
在培养过程中并没有发生变化，说明菌株 F1 直接将
NO2
--N 转化为气体。
对照组中硝酸盐和亚硝酸盐浓度均没有发生
变化。
2.3 菌株的鉴定
2.3.1 菌株形态学观察 菌株 F1 在细菌平板上，菌
落形态为圆形，乳白色，边缘整齐清晰，表面光滑，
中心凸起，F1 的单细胞呈短杆状或杆状，革兰氏阴
性（图 4）。
到最高，进入稳定期，48 h 后随着培养时间的继续
延长，细菌吸光度降低。
2.3.3 菌株的生理生化鉴定 根据细菌菌落及菌体
的形态特征结合其生理生化试验（表 2），初步推断
菌株 F1 为盐单胞菌属（Halomonas sp.）。
图 4 菌株 F1 光学及菌落图
2.3.2 菌株生长曲线 菌株接种到液体细菌培养基
后，细菌的生长会使澄清的培养液逐渐变浑浊，在
特定波长下，菌悬液中的细菌数量与相应吸光度成
正比。细菌生长曲线一般表现出 4 个不同的生长时
期 ：迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。菌株 F1 生
长曲线，如图 5 所示。在好氧条件下，盐度为 33 时，
菌株 F1 的迟缓期很短，接种后迅速进入对数生长期，
6-24 h 为菌株 F1 的指数生长期，24 h 后菌体浓度达
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
0 6 12 18 24 30 36 42 48ᰦ䰤˄h˅
O
D
66
0n
m
图 5 菌株 F1 的生长曲线
表 2 菌株 F1 的生理生化功能鉴定
项目 F1 项目 F1
氧化酶 + 甲基红 -
接触酶 + 运动性 -
葡萄糖 + 淀粉水解 -
乳糖 + 10% NaCl +
蔗糖 + 15% NaCl +
柠檬酸盐 + V-P 测定 -
甘露醇 - 吲哚测定 -
+ ：阳性 ；- ：阴性
2.3.4 序列分析 将所测序列在 NCBI 上进行 Blast
序列比对，结果显示，菌株 F1 与 Halomonas alimen-
taria 的同源性最高，为 99%，登录号为 NR_025054。
由此可知，菌株 F1 属于盐单胞菌属。采用 MEGA4.1
分析软件，构建系统发育树（图 6）。
3 讨论
反硝化细菌在分类学上并没有专门的类群，而
是分散于原核生物的众多属中。好氧反硝化现象仅
在细菌中发现，主要存在于假单胞菌属（Pseudomo-
nas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoc-
cus）和芽孢杆菌属（Bacillus）等［11］。嗜盐反硝化
细菌数量较少，主要分布于细菌中的 Bacillus、Halo-
monas 及古细菌 Halobacterium 和 Haloarcula 等几个属
中 ［12］。廖绍安［13］利用间歇曝气选择性富集，筛选
到一株 10 h 内将亚硝态氮由 26.18 mg/L 降至 0 的好
氧反硝化细菌，在盐度为 0-25 之间 20 h 内均可达
到同样的去除效果。Li［14］发现菌株 GQ-42 在盐度
为 50-100 内 NO3
--N 去除率保持在 90% 以上 ；当盐
度超过 150，随着盐度的增大，NO3
--N 去除率下降
得较为明显。盐度对反硝化的活性可能有一定的影
响。该试验分离的菌株 F1 是一株能利用硝酸盐和亚
硝酸盐的好氧反硝化菌，经过形态特征、生理生化
试验和 16S rDNA 序列分析，初步鉴定该菌株属于
盐单胞菌属。它与目前所报道的好氧反硝化菌均不
2013年第3期 179石小彤等 ：一株耐盐好氧反硝化细菌的分离筛选及鉴定
相同，表现了自然界中好氧反硝化菌的生物多样性，
对揭示好氧反硝化菌的生态学有重要的意义。
从图 2 和图 3 可以看出，不管氮源是硝酸盐还
是亚硝酸盐，反硝化主要发生在 0-30 h 之间。结
合菌株的生长曲线，可以得出，好氧反硝化作用主
要发生在对数生长期，而迟缓期、稳定期和衰亡期
NO3
--N 和 NO2
--N 并没有明显的浓度变化，说明此期
间并没有明显的反硝化过程。好氧反硝化作用主要
发生在对数生长期，这是因为细菌在此期间生长速
率最快，细胞代谢旺盛，细胞合成所需要的能量和
还原力主要在这一阶段被消耗，所以指数生长期是
反硝化效率最高的时期，这与周丹丹等［15］报道的
菌株情况相似。
水体中亚硝酸盐浓度积累到一定程度后，将对
水体中养殖的鱼虾类产生毒害，它主要是诱导血液
中的血红蛋白转变为高铁血红蛋白，抑制血液载氧
能力，出现组织缺氧，甚至导致鱼虾类缺氧窒息而
死。一般试验中反硝化性能测试时常用硝酸盐为氮
源，而该试验 B 培养基以 NO2
--N 为唯一氮源，培养
基 NO2
--N 浓度由初始的 32.79 mg/L 在 70 h 后降低为
0.93 mg/L，降解率达到 97.16%，此间亚硝态氮最高
脱氮速率可为 1.25 mg/L·h（0-10 h）。
影响反硝化脱氮率的因素有碳源、碳氮比、溶
氧量、温度、pH 和初始氮浓度等，接下来将对该菌
株在这些方面进行研究，得出最佳反硝化条件，为
今后实现硝化反硝化工艺的研究提供依据。
4 结论
从对虾养殖池底泥中分离纯化得到 4 株好氧反
硝化细菌，分别为 F1、F14、F26 和 F29，其总氮去
除率为 71.4%、51.25%、55% 和 60.7%。菌株 F1 在
盐度为 33 时，能有效降解硝酸盐和亚硝酸盐，40 h
内脱氮率达到 86.82% 和 97.01%，是一株高效的反
硝化细菌，反硝化过程主要发生在对数生长期，初
步鉴定为盐单胞菌。
参 考 文 献
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100
58
100
85
100
34
40 38
71
57
Halomonas hydrothermalisAF212218
Halomonas venustaAJ306894
Halomonas boliviensisAY245449
Halomonas gomseomensisAM229314
Halomonas subterraneaEF144148
F1
Halomonas alimentariaAF211860T
Halomonas campisalisAF054286
Halomonas desiderataX92417
Halomonas eurihalinaX87218
Chromohalobacter canadensisAJ295143
Halomonas halocynthiaeAJ417388
Carnomonas nigrifaciensY13299
0.01
图 6 菌株 F1 的系统发育树
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第3期180
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（责任编辑 马鑫）