全 文 ：第 26 卷第 11 期
2006 年 11 月
生 　　态 　　学 　　报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 26 ,No. 11
Nov. ,2006
养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分离鉴定及特征
廖绍安1 , 郑桂丽3 , 王安利1 , 3 , 黄洪辉2 , 孙儒泳1
(1. 华南师范大学生命科学学院 ,广州　510631 ; 2. 农业部渔业生态环境重点开放实验室 ,广州　510300 ;
3. 广州市疾病预防控制中心 ,广州　510080)
基金项目 :广东省自然科学基金重点资助项目 (021098) ;国家农业部渔业生态环境重点开放实验室开放基金资助项目 (200323)
收稿日期 :2005212207 ;修订日期 :2006206220
作者简介 :廖绍安 (1970～) ,男 ,湖北麻城人 ,博士 ,主要从事水产养殖生态及环境微生物研究。3 通讯作者 Corresponding author. E-mail :wanganl @scnu. edu. cn
Foundation item :The project was financially supported by The Key Natural Science Foundation of Guangdong Province (No. 021098) , The Opeining Foundation of
Key Laboratory of Fishery Ecology Environment , Ministry of Agriculture (No. 200323)
Received date :2005212207 ;Accepted date :2006206220
Biography :LIAO Shao2An , Ph. D. , mainly engage in aquaculture ecology and environmental microbiology.
摘要 :利用间歇曝气选择性富集并对所获菌株的好氧反硝化活性进行检测 ,筛选到一株亚硝酸盐去除活性较高的好氧反硝化细
菌。在溶解氧 (DO)为 3180～5121 mgΠL 的培养条件下 ,该菌株 10h 内将亚硝态氮由 26118 mgΠL 降至 0 ;在盐度为 0～25 之间 20h
内均可达到同样的去除效果。通过形态学特征、生理生化反应及部分长度 16S rDNA 序列分析对筛选菌株进行鉴定 ,初步判定
它为嗜麦芽寡养单胞菌 Stenotrophomonas maltophilia。亚硝酸盐还原酶基因分析结果表明 ,该菌株只含亚硝酸盐还原酶 nirS 基
因 ,其序列与 Alcaligenes faecalis A15 (后来被重新鉴定为 Pseudomonas stutzeri)的 nirS 基因序列相似。
关键词 :好氧反硝化细菌 ;嗜麦芽寡养单胞菌 ;16S rDNA ;亚硝酸盐还原酶 nirS基因
文章编号 :100020933(2006) 1123718207 　中图分类号 :Q93 　文献标识码 :A
Isolation and characterization of a novel aerobic denitrif ier from shrimp pond
LIAO Shao2An1 , ZHENG Gui2Li3 ,WANG An2Li1 , 3 , HUANG Hong2Hui2 , SUN Ru2Yong1 　(1. College of Life Science , South
China Normal University , Guangzhou 510631 , China ; 2. Key Laboratory of Fishery Ecology Environment , Ministry of Agriculture , Guangzhou 510300 , China ; 3.
Guangzhou Center for Disease Control and Prevention , Guangzhou 510080 , China) . Acta Ecologica Sinica ,2006 ,26( 11) :3718～3724.
Abstract: Denitrifying activity of most typical denitrifiers is usually completely suppressed when anaerobiosis is insufficient ,
aerobic denitrifying bacteria has a major advantage in reducing nitrate andΠor nitrite to N2 under aerobic conditions , which is
critical for nitrite and nitrate removal from aerobic environment , such as aquaculture water. Aims : To isolate aerobic denitrifying
bacteria to enhance nitrate and nitrite removal from aquaculture system. Methods and Results : Selective enrichment culture method
under alternating oxic2anoxic conditions was used for screening bacteria that have high capability of aerobic denitrification from a
shrimp pond. A novel denitrifier X0412 was isolated and purified after 2 months of incubation. It , identified as Stenotrophomonas
maltophilia (formerly referred to as Xanthomonas maltophilia) based on its biochemical and morphological characters , is grouped
into theγsubclass of the class Proteobacteria. Phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences indicated that strain X0412 was most
closely related to S. maltophilia AB021406. Analysis of the both nitrite reductase genes nirS and nirK showed that it contained
nirS gene , which is highly homologous to nirS of Pseudomonas stutzeri (formerly referred to as Alcaligenes faecalis A15) . When
bacterial concentrations as represented by OD600 increased from 0. 044 to 01436 , the bacterium reduced the concentrations of
nitrite rapidly from 26118 mgL - 1 to an undetectable level within 10 h , with DO titer decreasing from 5121 mgL - 1 to 3180 mgL - 1 .
Similar result was observed within 20 h at the salinity less than 25‰ . Conclusions : Stenotrophomonas maltophilia strain X0412
reduced nitrite rapidly and efficiently at a high DO concentration and across a wide range of salinity. Significance and Impact of the
study : Strain X0412 is highly promising for future potential application in the control of nitrite and nitrate concentration of
aquaculture systems.
Key words :aerobic denitrifier ; Stenotrophomonas maltophilia ;16S rDNA ;nitrite reductase nirS gene
在水产养殖过程中 ,水体中的氨、硝酸盐、亚硝酸盐、磷酸盐等营养元素含量过高所造成的富营养化情况
频繁出现。除了会改变水质与生物平衡外 ,其中氨态氮和亚硝态氮等毒性较高会对水生动物造成严重影响 ,
特别是池塘养殖条件下亚硝态氮转化速率低、毒性大 ,由此造成的养殖水产动物病害加重甚至死亡现象已多
见报道。
在氮的生物地球化学循环中 ,反硝化作用是其中重要的环节。反硝化作用是硝态氮或亚硝态氮被还原成
含氮气体 (NO ,N2O)及氮气的过程 ,硝态氮在还原成亚硝态氮后也可异化还原为氨氮而非含氮气体 ,即产铵异
化硝酸盐还原 (DNRA dissimilatory nitrate reduction to ammonia) 。反硝化过程与产铵异化硝酸盐还原过程的差异
不仅包括环境条件不同 ,参与反应的微生物也不同[1 ] 。
具有反硝化能力的细菌就目前所知分布于 50 多个属 ,约有 150 余种 ,绝大部分属于变形细菌纲
(Proteobacteria)中的α和β簇群[2 ] 。反硝化细菌能将硝态氮或亚硝态氮还原成含氮气体或氮气 ,不过并不是所
有的反硝化细菌都能进行完全的反硝化过程 ,编码亚硝酸盐还原酶的基因才是反硝化细菌的关键功能基因 ,
在进行反硝化的分子生态学研究中也主要以 nirS或 nirK基因作为分子标记[3～7 ] 。
传统上认为反硝化作用只有在厌氧或缺氧条件下发生 ,但是在水处理过程中也观察到好氧反硝化现象。
尽管有人将好氧反硝化现象的发生归因于微环境中的厌氧条件 ,但是目前已有相当数量的好氧反硝化细菌 ,
如 Microvirgula aerodenitrificans [8～11 ] 、Paracoccus denitrificans [12 , 13 ] 、Pseudomonas aeruginosa [14 , 15 ] 、Pseudomonas
stutzeri [13 ,16 ,17 ] 、Alcaligenes sp . [18 ,19 ]被分离并进行了深入研究 ,证实好氧反硝化细菌确实存在。
目前已知的反硝化细菌多是从淡水环境中分离得来 ,能用于海水养殖中水处理且主要针对亚硝酸盐还原
能力的报道极少 ,而业界迫切需要缓解养殖环境中亚硝酸盐积累的技术。本文从盐度 12 的淡化养殖虾池悬
浮生物膜中经富集、分离和纯化 ,筛选到一株在淡水及海水中均适用的亚硝酸盐还原活性较强的好氧反硝化
细菌 ,根据其形态特征、生理生化性状和部分长度 16S rDNA 序列 ,确定了其分类学和系统发育地位。
1 　材料与方法
111 　好氧反硝化细菌的富集和筛选
11111 　培养基组成 　基本培养基 :醋酸钠 20 mmolΠL ,葡萄糖 30 mmolΠL , NaNO3 10 mmolΠL , K2 HPO4 114 g ,
KH2 PO4 217 g , NaCl 215 g ,5ml 2 % MgSO4 溶液 , FeSO4 4mmolΠL ,pH 716 ,虾池水 (盐度 12) 1000ml。
富集培养基按照 2 ×基本培养基组成配制 ,121 ℃灭菌 30min 备用。
11112 　样品来源与富集及分离 　用 500ml 虾池水 (盐度 12)冲洗下一直被曝气的虾池悬浮化学纤维棉上的生
物膜 ,加入 500ml 2 ×基本培养基 ,用气石间歇曝气。在富集培养过程中 ,NaNO3 根据消耗程度补充 ,富集 2 个
月。
向基本培养基中加入 18gΠL 琼脂粉 ,加热溶解后 121 ℃灭菌 20min ,制作分离平板培养基。富集培养物被
系列稀释后涂布平板 ,32 ℃培养。根据菌落特征差异挑选单菌落再次培养。
11113 　好氧反硝化细菌的筛选 　基本培养基按照 100mlΠ培养瓶 (250ml) 分装 ,盖上透气硅胶塞 ,灭菌 ,冷却后
接种挑选的菌株 ,32 ℃下 150 rΠmin振荡培养 5d ,检测 NO -3 2N 和 NO -2 2N 浓度。根据 NO -2 2N 积累及去除速率 ,
筛选其中反硝化活性最强的菌株 ,涂布到分离培养基平板上于 32 ℃再次培养。
112 　分离菌株的好氧反硝化活性测定
用去离子水配制盐度 12 的人工海水配制反硝化活性测定培养基。培养基成分 :醋酸钠 20 mmolΠL ,葡萄
糖 30 mmolΠL ,NaNO2 2 mmolΠL , NH4 Cl 20 mmolΠL , K2 HPO4 114 g , KH2 PO4 217 g , 5ml 2 % MgSO4 溶液 , FeSO4
4mmolΠL ,pH716 ,人工海水 (盐度 12) 1000ml。
917311 期 廖绍安 　等 :养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分离鉴定及特征 　
用制成备用的反硝化活性测定培养液 100ml ,无菌洗下 11113 中平板培养物 ,混匀。取 5ml 接种到 150ml
液体培养基中 (250ml 带硅胶塞) ,32 ℃下 180rΠmin 振荡培养。检测溶解氧浓度、亚硝酸盐浓度和 OD600 。溶解
氧用电极法 (Hach , sensION156) 、亚硝酸盐用盐酸萘乙二胺法、OD600 用分光光度法 ( Hach , DRΠ4000U) 分别测
定。
图 1 　菌株 X0412 反硝化中细菌生长 (A) 及亚硝酸盐 (B) 和溶解氧
(C)浓度变化
Fig. 1 　Dynamics of X0412 growth (A) , concentrations of nitrite (B) and
dissolved oxygen(C) during denitrification
113 　筛选菌株在不同盐度条件下的反硝化活性
用去离子水配制盐度分别为 0、10、15、20、25、30 的人工海水 ,加入 112 所述培养基成分制作液体培养基 ,
接种和培养按照 112 所述。每 5h 检测 1 次亚硝酸盐 ,记录亚硝酸盐完全去除所需时间。
114 　好氧反硝化细菌的鉴定
11411 　形态观察 　对筛选菌株进行革兰氏染色和鞭毛染色。
11412 　生理生化反应 　参照伯杰氏手册对筛选菌株做进一步鉴定。
11413 　16S rDNA 序列分析 　从平板上直接挑取一环单菌落菌苔 ,加至 100μl 去离子水中 ,吹打混匀 ,100 ℃水
浴 10min ,12 ,000rΠmin ,4 ℃离心 10min ,取上清于 4 ℃保存 ,直接作为 PCR 扩增模板。16S rDNA 扩增引物为 :上
游引物 BSF8Π20 ,5′2AGA2GTT2TGA2TCC2TGG2CTC2AG23′;下游引物 BSR814Π21 ,5′2TAC2AGC2GTG2GAC2TAC2CAG2
GGT23′,由上海生工生物工程有限公司合成。扩增体系 :2 ×Premix Taq ( Ex TaqTM Version ,TaKaRa 公司) 25μl ,
引物各 015μmolΠL ,模板 1μl ,灭菌去离子水补至 50μl。采用 PE2400 PCR 扩增仪 ,反应程序为 :94 ℃变性 10min ;
94 ℃变性 40s ,56 ℃退火 50s ,72 ℃延伸 1min ,30 个循环 ;
72 ℃延伸 10min ,4 ℃保存。PCR 产物以含 0115μgΠml 溴
化乙锭的 1 %琼脂糖凝胶电泳检测 ,凝胶图像分析系统
(Bio2Rad Gel Doe 2000) 记录结果。用 Microcon2PCR
Purification Kit (Millipore) 纯化扩增产物 ,由 Invitrogen 公
司采用 ABI 377 DNA 测序仪完成测序 ,测序引物为
BSF8Π20。测序结果提交 GenBank 采用 BLASTN 程序 ,及
EMBL 采用 FASTA 程序进行同源性检索。利用 MEGA3
软件 ,将筛选菌株与部分参考菌株基于 16S rDNA 序列
的 ClustalW多重比对结果 ,采用 UPGMA 方法构建系统
发育树。
115 　亚硝酸盐还原酶基因序列分析
参照文献[3 ] ,选择针对亚硝酸盐还原酶结构基因
nirS 、nirK的特异引物 ,分别进行 PCR 检测。引物序列
分别为 : nirS1F ,5′2CCT2A ( CΠT) T2GGC2CGC2C (AΠG) C2A
(AΠG) T23′, nirS6R , 5′2CGT2TGA2ACT2T (AΠG) C2CGG2T2
3′,产物长度为 890bp ; nirK1F ,5′2GG(AΠC)2ATG2 GT( GΠ
T)2CC ( CΠG)2TGG2CA23′, nirK5R , 5′2GCC2TCG2ATC2AG
(AΠG)2 TT(AΠG)2TGG23′,产物长度为 514bp ,由上海生
工生物工程有限公司合成。模板提取方法同上。扩增
体系 : 2 ×Premix Taq ( Ex TaqTM Version , TaKaRa 公司 )
25μl ,引物各 015μmolΠL ,模板 1μl ,灭菌去离子水补至
50μl。同上采用 PE2400 PCR 扩增仪 ,扩增程序为 :94 ℃
变性 10min ;94 ℃变性 40s ,54 ℃退火 50s ,72 ℃延伸 1min ,
30 个循环 ;72 ℃延伸 10min ,4 ℃保存。PCR 产物同上进
行电泳检测及纯化 ,由 Invitrogen 公司采用 ABI 377 DNA
0273　 生 　态 　学 　报 26 卷
测序仪完成测序 ,测序引物为 nirS1F 和 nirS6R ,同上进行同源性检索。
2 　结果
211 　好氧反硝化细菌的筛选及好氧反硝化活性测定
图 2 　不同盐度下亚硝酸盐完全去除所需时间
Fig. 2 　Time needed for removal of nitrite by strain X0412 under aerobic
different salinity
通过在典型好氧反硝化细菌富集条件下从虾池水
及生物膜中分离获得 1 株高活性反硝化细菌 ,结合筛选
过程的培养条件 ,初步推测该菌株具有好氧反硝化能
力。实验结果表明 ,以氨氮为氮源时它在好氧条件下有
相当高的亚硝酸盐还原活性 ,检测结果见图 1。结果显
示 ,在 10h 内培养液 OD600从 01044 到 01436 的过程中 ,
溶解氧浓度从 5121mgΠL 缓慢下降到 318mgΠL ,而亚硝酸
盐浓度从 26118mgΠL 下降至 0。亚硝酸盐被快速去除的
过程中 ,溶解氧浓度一直维持在较高的水平。
212 　不同盐度条件下的反硝化活性
不同盐度下筛选菌株完全还原亚硝酸盐所需时间
如图 2 所示。盐度 0～25 条件下 ,20h 内亚硝酸盐浓度
从 26118mgΠL 降为 0 ,随着盐度升高完全还原亚硝酸盐
所需时间也相应延长 ,推测较高盐度对该菌株的反硝化活性有抑制作用。
213 　菌株的鉴定
21311 　形态特征 　菌株 G- ,极生鞭毛 ,在选择性平板上菌落较大 ,黄色并有皱褶。
21312 　生化反应 　该菌的主要生化反应特征表现为 ,氧化酶试验阴性、分解葡萄糖和麦芽糖、葡萄糖 OΠF 为
氧化型、并具有硝酸盐还原能力。
表 1 　筛选菌株生物学特性
Table 1 　Biological characteristics of the selected strain
生化反应 Test or characteristics 生化反应 Test or characteristics 生化反应 Test or characteristics
氧化酶 Oxidase - 葡萄糖 Glucose + 精氨酸 Arginine -
葡萄糖 OΠF Glucose OΠF O 麦芽糖 Maltose + 鸟氨酸 Ornithine -
动力 + 木糖 Xylose - 枸橼酸盐 Citrate -
硝酸盐还原 Nitrate reduction + 甘露醇 Mannitol - 尿素酶 Urease -
明胶液化 Geltine hydrolysis + 赖氨酸 Lysine + 胆汁七叶苷 Bile aesculin +
FLN acid -
　　“+ ”表示反应呈阳性 positive ,“ - ”表示反应呈阴性 negative
21313 　16S rDNA 序列分析 　部分长度 16S rDNA 序列在 GenBank 的登记号为 DQ359944 ,分析结果 (见图 3) 表
明 ,筛选菌株与多株 Stenotrophomonas maltophilia (嗜麦芽寡养单胞菌) 菌株 16S rDNA 序列相似性均达 99 %以
上 ,与菌株 AB021406 同源性达 99174 % ,利用 MEGA3 软件 ,将筛选菌株与部分参考菌株基于 16S rDNA 序列构
建系统发育树 (如图 4) ,结合菌株形态学及生理生化特性 ,基本确定筛选菌株为 Stenotrophomonas maltophilia ,
命名为 Stenotrophomonas maltophilia strain X0412。
214 　亚硝酸盐还原酶序列分析
菌株 S1 maltophilia strain X0412 亚硝酸盐还原酶基因 nirS 、nirK基因扩增结果见图 5。nirS 扩增产物大小
约为 900bp ,与预期相符 , nirK扩增结果阴性 ,表明该菌株为 nirS + 和 nirK - 。nirS 片断测序后长度 903bp (见图
6) ,同源检索结果发现其与 Alcaligenes faecali A15 nirS 基因序列相似度最大 ,达 9817 %。
3 　讨论
由于好氧反硝化细菌在环境中本来就很少且很难成为优势菌 ,故采用一般筛菌方法不易将其筛选出来。
对于好氧反硝化细菌而言 ,在好氧条件下可同时利用氧和硝酸盐或Π和亚硝酸盐为电子受体 ,但由于有氧呼吸
127311 期 廖绍安 　等 :养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分离鉴定及特征 　
图 3 　菌株 X0412 部分长度 16S rDNA 序列
Fig. 3 　Partial 16S rDNA sequence of strain X0412
图 4 　菌株 X0412 与参考菌株基于 16S rDNA 序列构建的系统发育树
Fig. 4 　Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of strain X0412 and the references
图 5 　菌株 X0412 亚硝酸盐还原酶基因 nirS 、nirK扩增结果
Fig. 5 　Amplification of nirS and nirK gene from strain X0412
产生的能量一般远大于利用硝酸盐或Π和亚硝酸盐产生的能量 ,因此一般情况下有氧呼吸占优势 ;在厌氧条件
下以硝酸盐或Π和亚硝酸盐为电子受体 ,此时其生长速率一般又较低 ,故好氧反硝化细菌的筛选比较困难 ,在
筛菌及保存过程中条件控制非常重要 ,稍不合适就很难
获得反硝化活性强的菌株 ,或在应用过程中菌株反硝化
活性难以长期保持。而利用间歇曝气法 ,由于频繁的好
氧Π缺氧环境转换使得完全好氧和厌氧细菌不能正常生
长 ,增加了好氧反硝化菌成为优势菌的可能性 ;此外 ,间
歇曝气一方面提供了细菌生长所需氧气 ,使细菌维持了
一定的生长速率 ,另一方面间歇的厌氧条件又诱导了细
菌反硝化过程酶的活性 ,而间歇的有氧条件并不会很快
使其反硝化活性受到抑制 ,从而同时保证了细菌的生长
和反硝化活性的表达 ,因此该方法目前得到许多研究者
的青睐[11 ] 。孔庆鑫等通过该方法分离出好氧反硝化菌
Pseudomonas sp . Y221 ,该菌硝酸盐去除率随溶解氧升高
而降低 ,但仍具有较强的去除能力[20 ] 。通过间歇曝气
富集筛选 ,亦从虾池悬浮生物膜中分离到多个亚硝酸盐
去除率较高的好氧反硝化细菌菌株 ,同样证实了该方法
的有效性。
2273　 生 　态 　学 　报 26 卷
图 6 　菌株 X0412 nirS 基因扩增产物序列
Fig. 6 　Sequence of amplified nirS gene product from strain X0412
尽管 16S rDNA 序列分析在菌种鉴定上仍有不足之处 ,但比传统的鉴定方法能更快捷地获得更明确的鉴
定结果 ,也可以作为种和亚种水平上鉴定的依据 ;虽然 16S rDNA 全序列在鉴定某些新种时是必要的 ,但起始
的 500bp 片断对大多数菌株的鉴定已提供了足够丰富的信息[21 ] 。La Scola 等认为该方法比传统方法在鉴定
Bartonella sp . 内各菌株时更准确。尽管对鉴定到种水平的 16S rDNA 序列相似度标准还没有统一 ,但一般以
≥99 %作为种水平上的鉴定标准[22 , 23 ] 。分离的菌株 16S rDNA 序列 FASTA 及 BLASTN 检索结果均与
Pseudomonas beteli AB021406 最为接近 (相似性达 99. 74 %) , Pseudomonas beteli AB021406 最早被归于假单胞菌
属 ,2000 年被 Anzai 等根据 16S rDNA 基因的部分序列相似度 9915 %及系统发育分析将其更名为嗜麦芽寡养
单胞菌 Stenotrophomonas maltophilia [24 ] 。嗜麦芽寡养单胞菌广泛存在于自然界中 ,并在污染物降解转化中发挥
重要作用。Romano 等发现 S . maltophilia 在市政水处理的出口水中占 G- 菌的 318 %[25 ] 。郭全友等对东海几
个养殖场大黄鱼进行细菌多样性分析 ,即发现嗜麦芽寡养单胞菌是鱼体第二优势菌群 ,占 2110 %[26 ] 。Dungan
等报道了从含硒的排污塘沉积物中分离的 S . maltophilia 对硒酸盐和亚硒酸盐有很强的去除能力[27 ] ,Chen 等
也发现 S . maltophilia 是被表面活性剂 Triton X2100 (曲拉通)污染土壤中的土著种并且在通氧及添加氮源和碳
源条件下可以提高其数量[28 ] , Ivanov 等则报道了从市政废水处理厂经富集分离到 S . maltophilia 不仅还原
Fe3 + 还可以除磷[29 ] 。S . maltophilia 不仅在处理污染物上具有重要作用 , 而且从农作物根际中分离的 S .
maltophilia 还具有固氮能力[30 ] 。
从淡化养殖虾池悬浮生物膜中分离的嗜麦芽寡养单胞菌在溶解氧浓度为 3. 80～5121 mgΠL 条件下 ,可在
10h 内将亚硝酸盐从 26118mgΠL 还原至 0。Finkmann 等报道本属中的 Stenotrophomonas nitritireducens 也有反硝
化能力 ,但是缺乏 N2O 还原酶[31 ] ;关于 S . maltophilia 的反硝化能力则未见报道。同时该菌株在盐度 0～20 之
间显示有较高的反硝化活性 ,不过较高盐度对反硝化活性表现出抑制作用。嗜盐反硝化细菌数量较少 ,主要
包括古细菌中的 Haloarcula、Halobacterium 、Haloferax 及细菌中的 Halomonas 和 Bacillus 等几个属的某些种[2 ] 。
Yoshie 等指出盐度降低了污水处理系统中亚硝酸盐还原酶基因的多样性[32 ] 。Psudomonas 和 Stenotrophomonas
两个属中的反硝化细菌在不同盐度下的反硝化能力也未见报道。盐度对反硝化细菌的分布和反硝化活性可
能有一定的影响 ,本文所分离的菌株在较高盐度下仍有一定的反硝化活性可能与来源有关 ,此特点使得该菌
株具有了在生活污水和养殖水处理等多种场合应用的巨大潜力。
在对菌株好氧反硝化活性及盐度对反硝化活性影响评估的基础上 ,本文进行了亚硝酸盐还原酶基因
nirSΠnirK的 PCR 检测。nirSΠnirK PCR 结果表明该菌株为 nirS + , nirS 为含有血红素 cd1 的亚硝酸盐还原酶
(cd12nir)基因 ,目前尚未发现 nirS 基因和 nirK基因出现在同株菌体中 ,但是它们对应的还原酶具有相同的功
327311 期 廖绍安 　等 :养虾池好氧反硝化细菌新菌株的分离鉴定及特征 　
能。菌株 X0412 nirS 基因序列同源分析结果证实其与 Alcaligenes faecalis A15 序列的相似性达 9817 %。
Vermeiren 等根据表型特征、脂肪酸分析及 DNA 杂交等多种手段 ,认定 Alcaligenes faecalis A15 就是目前报道较
多的反硝化细菌 Pseudomonas stutzeri [33 ] 。
尽管亚硝酸盐可以通过亚硝酸盐氧化、产铵异化还原和反硝化还原这三种生化转化途径去除 ,但反硝化
仍然是从水环境中去除亚硝酸盐的最好途径。前两种方法分别产生的硝酸盐和铵都会滞留在水体中 ,而反硝
化作用是将亚硝酸盐或硝酸盐还原成气体使之完全从水体中去除。本文所分离的好氧反硝化细菌 X0412 还
原亚硝酸盐的特征已确定 ,但它在反硝化过程中是否以温室气体 N2O 为主要产物仍需进一步研究。
References :
[ 1 ] 　Maier R M. Biochemical cycling. In : Maier R M ed. Environmental Microbiology. San Diego : Academic Press , 2000. 319～346.
[ 2 ] 　Zumft W G. Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiol . Mol . Biol . Rev. , 1997 , 61 (4) : 533～616.
[ 3 ] 　Braker G, Zhou J , Wu L , et al . Nitrite reductase genes ( nirK and nirS ) as functional markers to investigate diversity of denitrifying bacteria in pacific
northwest marine sediment communities. Appl . Environ. Microbiol . , 2000 , 66 (5) : 2096～2104.
[ 4 ] 　Braker G, Ayala2del2Rio H L , Devol A H , et al . Community structure of denitrifiers , bacteria , and archaea along redox gradients in Pacific Northwest
marine sediments by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of amplified nitrite reductase ( nirS) and 16S rRNA genes. Appl . Environ.
Microbiol . , 2001 , 67 (4) :1893～1901.
[ 5 ] 　Liu X , Tiquia S M , Holguin G, et al . Molecular diversity of denitrifying genes in continental margin sediments within the oxygen2deficient zone off the
Pacific coast of Mexico. Appl . Environ. Microbiol . , 2003 , 69 (6) : 3549～3560.
[ 6 ] 　Taroncher2Oldenburg G, Griner E M , Francis C A , et al . Oligonucleotide microarray for the study of functional gene diversity in the nitrogen cycle in the
environment . Appl . Environ. Microbiol . , 2003 , 69 (2) : 1159～1171.
[ 7 ] 　Prieme A , Braker G, Tiedje J M , et al . Diversity of nitrite reductase ( nirK and nirS ) gene fragments in forested upland and wetland soils. Appl .
Environ. Microbiol . , 2002 , 68 (4) : 1893～1900.
[ 8 ] 　Patureau D , Bernet N , Delgenes J P , et al . Effect of dissolved oxygen and carbon2nitrogen loads on denitrification by an aerobic consortium. Appl .
Microbiol . Biotechnol . , 2000 , 54 (4) : 535～542.
[ 9 ] 　Patureau D , Godon J J , Dabert P , et al . Microvirgula aerodenitrificans gen. nov. , sp . nov. , a new gram2negative bacterium exhibiting co2respiration of
oxygen and nitrogen oxides up to oxygen2saturated conditions. Int . J . Syst . Bacteriol . , 1998 , 48 (3) : 775～782.
[10 ] 　Patureau D , Helloin E , Rustrian E , et al . Combined phosphate and nitrogen removal in a sequencing batch reactor using the aerobic denitrifier ,
Microvirgula aerodenitrificans . Water Res. , 2001 , 35 (1) : 189～197.
[11 ] 　Patureau D , Zumstein E , Delgenes J P , et al . Aerobic Denitrifiers Isolated from Diverse Natural and Managed Ecosystems. Microb. Ecol . , 2000 , 39 (2) :
145～152.
[12 ] 　Robertson L A , Kuenen J G. Aerobic denitrification : a controversy revived. Arch Microbiol . , 1984 , 139 : 351～354.
[13 ] 　Takaya N , Catalan2Sakairi M A , Sakaguchi Y, et al . Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide. Appl . Environ. Microbiol . ,
2003 , 69 (6) : 3152～3157.
[14 ] 　Ka J O , Urbance J , Ye R W , et al . Diversity of oxygen and N2oxide regulation of nitrite reductases in denitrifying bacteria. FEMS Microbiol . Lett . ,
1997 , 156 (1) : 55～60.
[15 ] 　Chen F , Xia Q , Ju L K. Aerobic denitrification of Pseudomonas aeruginosa monitored by online NAD ( P) H fluorescence. Appl . Environ. Microbiol . ,
2003 , 69 (11) : 6715～6722.
[16 ] 　Vollack K U , Hartig E , Korner H , et al . Multiple transcription factors of the FNR family in denitrifying Pseudomonas stutzeri : characterization of four fnr2
like genes , regulatory responses and cognate metabolic processes. Mol . Microbiol . , 1999 , 31 (6) : 1681～1694.
[17 ] 　Su J J , Liu B Y, Lin J , et al . Isolation of an aerobic denitrifying bacterial strain NS22 from the activated sludge of piggery wastewater treatment systems in
Taiwan possessing denitrification under 92 % oxygen atmosphere. J . Appl . Microbiol . , 2001 , 91 (5) : 853～860.
[18 ] 　Otani Y, Hasegawa K, Hanaki K. Comparison of aerobic denitrifying activity among three cultural species with various carbon sources. Water Sci .
Technol . , 2004 , 50 (8) : 15～22.
[19 ] 　Ozeki S , Baba I , Takaya N , et al . A novel C12using denitrifier alcaligenes sp . STC1 and its genes for copper2containing nitrite reductase and azurin.
Biosci . Biotechnol . Biochem. , 2001 , 65 (5) : 1206～1210.
[20 ] 　Kong Q X , Li J W , Wang X W , et al . A new screeningmethod for aerobic denitrification bacteria and isolation of a novel strain. Ch. in J . Appl . Environ.
Biol . , 2005 , 11 (2) : 222～225.
[ 21 ] 　Clarridge J E Ⅲ. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin. Microbiol .
Rev. , 2004 , 17(4) : 840～862.
[22 ] 　Bosshard PP , Abels S , Zbinden R , et al . Ribosomal DNA sequencing for identification of aerobic gram2positive rods in the clinical laboratory (an 182month
evaluation) . J . Clin. Microbiol . , 2003 , 41 (9) : 4134～4140
[23 ] 　Drancourt M , Bollet C , Carlioz R , et al . 16S ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and clinical unidentifiable bacterial
isolates. J . Clin. Microbiol . , 2000 , 38 (10) : 3623～3630.
[24 ] 　Anzai Y, Kim H , Park J Y, et al . Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence. Int . J . Syst . Evol . Microbiol . , 2000 , 50
(4) : 1563～1589.
[25 ] 　Romano G, Stampi S , Zanetti F , et al . Occurrence of gram2negative bacteria in drinking water undergoing softening treatment . Zentralbl . Hyg.
Umweltmed , 1997 , 200 (2～3) : 152～162.
[26 ] 　Guo Q Y, Xu Z , Yang X S. Bacterial diversity in cultured Pseudosciaena crocea from the East China Sea. Marine Fisheries , 2005 , 27(3) : 241～245.
[27 ] 　Dungan R S , Yates S R , Frankenberge W T Jr. Transformations of selenate and selenite by Stenotrophomonas maltophilia isolated from a seleniferous
agricultural drainage pond sediment . Environ. Microbiol . , 2003 , 5 (4) : 287～295.
[28 ] 　Chen H J , Huang S L , Tseng D H. Aerobic biotransformation of octylphenol polyethoxylate surfactant in soil microcosms. Environ. Technol . , 2004 , 25
(2) : 201～210.
[29 ] 　Ivanov V , Stabnikov V , Zhuang W Q , et al . Phosphate removal from the returned liquor of municipal wastewater treatment plant using iron2reducing
bacteria. J . Appl . Microbiol . , 2005 , 98 (5) : 1152～1161.
[30 ] 　Park M , Kim C , Yang J , et al . Isolation and characterization of diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of agricultural crops of Korea.
Microbiol Res. , 2005 , 160 (2) : 127～133.
[31 ] 　Finkmann W , Altendorf K, Stackebrandt E , et al . Characterization of N2O2producing Xanthomonas2 like isolates from biofilters as Stenotrophomonas
nitritireducens sp . nov. , Luteimonas mephitis gen. nov. , sp . nov. and Pseudoxanthomonas broegbernensis gen. nov. , sp . nov. Int . J . Syst . Evol .
Microbiol . , 2000 , 50 (1) :273～282.
[32 ] 　Yoshie S , Noda N , Tsuneda S , et al . Salinity decreases nitrite reductase gene diversity in denitrifying bacteria of wastewater treatment systems. Appl .
Environ. Microbiol . , 2004 , 70 (5) : 3152～3157.
[33 ] 　Vermeiren H , Willems A , Schoofs G, et al . The rice inoculant strain Alcaligenes faecalis A15 is a nitrogen2fixing Pseudomonas stutzeri . Syst . Appl .
Microbiol . , 1999 , 22 (2) : 215～224.
参考文献 :
[20 ] 　孔庆鑫 , 李君文 , 王新为 , 等. 一种新的好氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现. 应用与环境生物学报 ,2005 ,11 (2) :222～225.
[26 ] 　郭全友 ,许钟 ,杨宪时. 东海养殖大黄鱼细菌多样性分析. 海洋渔业 ,2005 , 27(3) :241～245.
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