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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第12期
棉花是全球最重要的经济作物之一。棉花黄萎
病是一种毁灭性的病害，广泛分布于我国乃至世界
的各产棉区，严重威胁棉花产量及纤维品质，是当
前影响棉花生产的主要病害之一［1］。近年来，棉花
收稿日期 ：2014-04-28
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31301370），国家自然科学基金项目（31301371），河北省博士后科研项目（冀人社字［2013］303 号）
作者简介 ：杨君，男，博士后，研究方向 ：棉花遗传育种 ；E-mail ：yang22181@163.com ；张艳为并列第一作者
通讯作者 ：王省芬，博士，教授，研究方向 ：棉花遗传育种 ；E-mail ：cotton@hebau.edu.cn
黄萎病菌诱导海岛棉酵母双杂交 cDNA
文库构建及评价
杨君1，2  张艳1  王伟巧1  荣伟1  王省芬1  马峙英1，2
（1. 河北农业大学农学院 教育部华北作物种质资源研究与利用重点实验室 河北省作物种质资源重点实验室，保定 071001 ；
2. 河北农业大学作物学博士后科研流动站，保定 071001）
摘 要 ： 采用 SMARTTM cDNA 合成技术，通过同源重组方法构建了海岛棉 Pima90-53 经强致病力黄萎病菌诱导的酵母双杂
交 cDNA 文库。经测定，文库容量为 2.82×106，滴度为 5.02×108 cfu/mL。菌落 PCR 显示，重组到 pGADT7-Rec 载体上的 cDNA 片
段大小集中在 500-1 500 bp 之间，重组率 93.33%。该文库完全可用于下一步互作蛋白筛选、信号转导组件确定及抗病蛋白结构和
功能分析。
关键词 ： 黄萎病菌 海岛棉 酵母双杂交 cDNA 文库
DOI ：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.017
Construction and Characterization of Yeast Two-Hybrid cDNA
Library Derived from Roots of Gossypium barbadense Inoculated with
Verticillium dahliae
Yang Jun1，2 Zhang Yan1 Wang Weiqiao1 Rong Wei1 Wang Xingfen1 Ma Zhiying1，2
（1. North China Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Education Ministry，Key Laboratory for Crop Germplasm Resources of Hebei，
Department of Agriculture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001 ；2. Postdoctoral Research Station of Crop Sciences，Hebei
Agricultural University，Baoding 071001）
Abstract: A yeast two-hybrid cDNA library derived from roots of Gossypium barbadense cv. Pima90-53 inoculated with severe virulence
Verticillium dahliae was constructed based on SMARTTM technique and homologous recombination reaction. Detection of the library indicated
that its capacity and titer were 2.82×106 and 5.02×108 cfu/mL, respectively. The result from colony PCR showed that the length of insert cDNA
fragments ranged from 500 to 1 500 bp on average and the recombination rate was 93.33%. These results demonstrate that the library meets the
demands of the standard cDNA library, which will be useful for screening interaction proteins, determining signal transduction components and
analyzing the structure and function of disease-resistant proteins in the future.
Key words: Verticillium dahliae Gossypium barbadense Yeast two-hybrid cDNA library
基因组研究取得长足进展，CottonGen（http ：//www.
cottongen.org）富集了来源于不同棉种的基因数据［2］；
中国农业科学院棉花研究所完成了棉花二倍体 D 基
因 组 雷 蒙德 氏 棉（ Gossypium raimondii L.） 的 测 序
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期106
和注释［3］；转录组测序揭示了不同棉花品种在多种
因子诱导下的基因表达模式［4，5］。这些进展为解析
棉花纤维发育、抗病虫、耐涝旱等分子机理奠定了
基础。
然而，蛋白质作为基因功能的体现者和执行者，
有其自身特有的表达规律和功能模式，基因序列和
转录水平上的表达信息并不足以揭示其在生物体内
的确切功能［6］。生命活动的过程实质上是蛋白在特
定时空下的互作，大多数蛋白是通过与其它蛋白或
配体进行结合形成复合物来发挥功能，进而调控生
物学过程。植物受病原菌侵染后的抗病或感病反应
往往伴随细胞内转录重编程，即一些蛋白会出现表
达量、构象、修饰等的变化，导致蛋白间的互作状
况发生改变，从而影响植物的免疫信号转导［7］。酵
母双杂交系统（Yeast two-hybrid system）被认为是
研究蛋白质互作的一种非常有效的手段［8］，研究人
员利用此技术完成了第一个植物蛋白互作网络图谱，
即拟南芥（Arabidopsis thaliana）互作图谱［9］。目前，
近 80% 的蛋白质互作研究都是利用酵母双杂交体系
完成的［10］。
抗 黄 萎 病 遗 传 改 良 和 抗 病 机 制 研 究 一 直 是
棉花遗传育种领域的重要科学问题。构建黄萎病
菌（Verticillium dahliae）诱导的海岛棉（Gossypium
barbadense L.）酵母双杂交 cDNA 文库，应用于筛
选与已知抗病蛋白或黄萎病菌毒素（效应子）的互
作蛋白，不仅有助于已知抗病蛋白的功能注释和
受体识别蛋白的发现，而且还可为解析棉花抗黄萎
病网络和阐明抗病机制奠定理论基础。本研究采
用 SMARTTM cDNA 合成技术，通过同源重组方法构
建海岛棉 Pima90-53 经强致病力黄萎病菌诱导的酵
母双杂交 cDNA 文库，旨在为帮助棉花基因功能注
释，并推动抗病基因的发掘和抗病机制的解析奠定
基础。
1 材料与方法
1.1 材料
海岛棉品种 Pima90-53 由河北农业大学棉花遗
传育种研究室保存［11］。绿色荧光蛋白标记的黄萎
病菌 Vd-gfp77 由中国农业科学院戴小枫研究员馈
赠，该病菌致病能力与 Vd991 相当［12］。黄萎病菌
临西 2-1 株系为本实验室分离鉴定，为强致病力菌
系［13］。Plus 植物总 RNA 提取试剂盒购自天根生化
科技（北京）有限公司 ；PolyATtract® mRNA Isolation
System IV 购自普洛麦格（北京）生物技术有限公司；
Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System 和
YeastmakerTM Yeast Transformation System 2 购自 Clont-
ech 公司 ；其他培养基及生化试剂等购自宝生物工程
（大连）有限公司。引物合成及测序由生工生物工程
（上海）股份有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 棉苗培育与菌系孢子制备 据参考文献［4］，
将棉苗培育于 MS 培养基中，培养条件为 ：光照
强度 6 000 Lux，光照时间 12 h，昼温 28℃，夜温
25℃，湿度 40% ；将 4℃保存的黄萎病菌单孢菌系
接种到 PDA 固体培养基上活化，再转接到 Czapek
液体培养基震荡培养（25℃，150 r/min）10 d，通过
纱布过滤去除菌丝收集孢子。
1.2.2 接菌与组织取样 利用血球计数板，将黄萎
病菌孢子液浓度调至 107 个孢子 /mL，对刚出现第一
片真叶的棉苗进行蘸根接菌。分别在接菌后 1、2、4、
6、8、12、24、36、48、72、96 和 120 h 取棉苗幼根，
无菌水清洗后用液氮速冻，置于 -80℃保存备用。
1.2.3 组织显微观察与病菌分离 取黄萎病菌 Vd-
gfp77 侵染后的棉苗茎进行徒手切片，于荧光显微镜
下观察维管束中病菌侵染进程。按照常规组织分离
法，将临西 2-1 侵染的棉苗茎切割成长约 0.3 cm 的
小段，置于 PDA 培养基，25℃黑暗培养 3 d 后观察
病菌出现情况。
1.2.4 RNA 提取与 mRNA 分离 在液氮中对保存的
样品进行充分研磨，按照“Plus 植物总 RNA 提取试
剂盒”说明书进行 RNA 提取操作。将提取的 12 个
时间点样品总 RNA 等量混合（每个时间点 30 μg），
用 PolyATtract® mRNA Isolation System IV 分 离 纯 化
mRNA，采用紫外分光光度计测定 RNA 的浓度和纯
度，1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的质量。
1.2.5 cDNA 合成与纯化 mRNA 作为模板，参照
Make Your Own “Mate & PlateTM” Library System 说 明
书 合 成 第 一 链 cDNA 及 ds cDNA。 利 用 CHROMA
SPINTM TE-400 柱对 dscDNA 进行分级分离纯化。
2014年第12期 107杨君等：黄萎病菌诱导海岛棉酵母双杂交 cDNA文库构建及评价
1.2.6 酵母感受态细胞制备 应用 PEG（polyethyle-
ne glycol）/LiAc（醋酸锂）法制备酵母菌 Y187 感受
态细胞。具体操作按照 YeastmakerTM Yeast Transfor-
mation System 2 的说明进行。
1.2.7 酵母双杂交 cDNA 文库构建 采用 Make Yo-
ur Own “Mate & PlateTM” Library System 试 剂 盒 进 行
cDNA 文库的构建。共转化体系如下 ：20 μL（4 μg）
dscDNA、6 μL（3 μg） 线 性 化 pGADT7-Rec、20 μL
（200 μg） 变 性 YeastmakerTM Carrier DNA 及 600 μL
Y187 感受态细胞。转化后的酵母细胞液（15 mL）
涂布于直径 150 mm 的 SD/-Leu 平板上，每板涂布菌
液 150 μL（共 100 个平板），30℃倒置培养，3-5 d
后用 Freezing Medium 收集转化子，按照每管 1 mL
分装，保存于 -80℃。
1.2.8 文库容量、滴度、重组率和多态性分析 将
转化后的酵母细胞液稀释 100 倍后涂布于直径 100
mm 的 SD/-Leu 平 皿， 每 皿 50 μL， 共 涂 布 3 皿，
30℃倒置培养 3-4 d，统计平皿上的菌落数，从而计
算文库总的克隆数 = 每皿平均克隆数 / 涂布体积 ×
稀释倍数 × 转化体积（15 mL），即代表文库容量。
取收集后分装的文库菌液稀释 10 000 倍后涂布于直
径 100 mm 的 SD/-Leu 平皿，每皿 50 μL，共涂布 3 皿，
30℃倒置培养 3-4 d，统计平皿上的菌落数，从而计
算文库滴度（cfu/mL）= 每皿平均菌落数 / 涂布体积 ×
稀释倍数。挑取平皿上的菌落进行小量培养，用 1.5
μL 酵母菌液作模板，pGADT7-Rec 载体通用筛选引
物（5 primer ：5-CTATTCGATGATGAAGATACCCC-
ACCAAACCC-3 和 3 primer ：5-GTGAACTTGCGGG-
GTTTTTCAGTATCTACGAT-3， 可 扩 增 载 体 序 列 约
300 bp）进行菌落 PCR，根据扩增结果计算文库重
组率（%）= 阳性菌落数 / 检测菌落总数 ×100%，
并分析文库多态性。
2 结果
2.1 海岛棉建库材料准备
棉苗在温、光、湿可控的条件下生长健壮，整
齐一致，根系发达，且棉苗在无菌条件下免受其它
杂菌和虫害的影响，最大程度减少了环境因素对试
验的影响（图 1-A）。为了能够对取样时间进行确定，
以黄萎病菌 Vd-gfp77 处理的棉苗为对照，结果显
示，接菌 72 h 后，棉苗根变为浅褐色（图 1-B），下
胚轴基部维管束中出现明亮的绿色荧光（图 1-C 和
图 1-D），并且棉苗均能分离出接种的病菌（图 1-E）。
这说明接菌 72 h 足以保证病菌侵入棉苗维管束，即
棉苗与黄萎病菌建立侵染关系。因此，本研究对棉
苗取样时，以接菌后 72 h 作为时间节点，外加 96 h
和 120 h，以此共计 12 个时间点的材料用于后续文
库构建。
A B
C D E
CK V.dahliae
A ：棉苗无菌培养 ；B ：黄萎病菌侵染 72 h 后的棉苗根组织 ；C，D ：
绿色荧光蛋白标记的黄萎病菌在棉苗茎中定殖观察 ；E ：茎秆组织
黄萎病菌分离验证（标尺 =150 μm）
图 1 海岛棉材料准备
2.2 总RNA提取和mRNA纯化
提取黄萎病菌处理后 12 个时间点的棉苗幼根
总 RNA，如图 2 所示，28S 与 18S rRNA 条带清楚，
比值约为 2，表明 RNA 完整度好，基本无降解 ；
A260/A280 在 1.9-2.1 之 间， 浓 度 为 2-3 μg/μL， 说 明
RNA 无蛋白和 DNA 污染，浓度较高。将 12 份材料
的等量 RNA 混合进行 mRNA 的分离和纯化，电泳
检测 mRNA 大小分布范围在 400-3 000 bp（图 3），
浓度为 320 ng/μL，A260/A280=1.92，表明 mRNA 的质
2000
bp
M 1 2
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL2000 ；1，2 ：棉苗根组织总 RNA
图 2 棉苗根组织总 RNA 电泳检测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第12期108
量和纯度较高，满足建库的要求。
2.3 dscDNA合成及分级分离
应 用 CDSIII（Oligo-dT Primer） 和 SMART III-
modified oligo 引物合成 cDNA 第一链，以之为模板
采用 LD-PCR（Long distance PCR），对扩增循环数进
行优化后，最终经过 21 个 PCR 循环获得 dscDNA。
CHROMA SPINTM TE-400 柱截留纯化，最终收集 4 个
泳道的 dscDNA（图 4 泳道 6-9），混合后检测片段
长度集中于 500-3 000 bp（图 5）。
6-A）。统计酵母转化液稀释 100 倍后涂布获得的重
组子数目（图 6-B），计算文库容量 = 94（每皿平均
克隆数）/ 50 μL×100×15×103 μL = 2.82 × 106。取
文库菌液稀释 10 000 倍后涂布（图 6-C），根据出现
的重组子数目计算文库滴度 = 2 510（每皿平均菌落
数）/0.05 mL×104 = 5.02×108 cfu/mL。随机挑取 60
个单菌落进行 PCR 检测（部分结果见图 7），显示重
组到 pGADT7-Rec 载体上的 cDNA 片段大小集中在
400-1 500 bp 之间 ；阳性菌落数为 56 个，重组率 =
93.33%。
2000
3000
5000
1500
bp
M 1
1000
750
500
250
M ：DNA Marker DL5000 ；1 ：mRNA
图 3 mRNA 纯化
2000
3000
5000
1500
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
M ：DNA Marker DL5000 ；1-16 ：分级分离获得不同片段大小的 cDNA
图 4 cDNA 分级分离
M 1
2000
3000
5000
1500
bp
1000
750
500
250
100
M ：DNA Marker DL5000 ；1 ：dscDNA
图 5 dscDNA 电泳检测
2.4 酵母双杂交cDNA文库构建和质量评估
根据同源重组的原理，将合成的棉苗 dscDNA
和 pGADT7-Rec 载体共转化酵母 Y187 感受态细胞，
经过 SD/-Leu 平板筛选，4 d 后获得阳性重组子（图
A B C
A ：酵母转化液涂布（150 μL/ 皿）筛选阳性重组子 ；B ：酵母转化液稀释
100 倍后涂布（50 μL/ 皿），重组子数用于文库容量计算 ；C ：文库菌液稀释
10 000 倍后涂布（50 μL/ 皿），菌落数用于文库滴度计算
图 6 文库构建与质量评估
3 讨论
生产上的棉花品种主要是陆地棉（Gossypium
hirsutum L.），其对黄萎病基本表现为感病或耐病，
还没有高抗黄萎病的陆地棉品种。陆地棉中多为微
效多基因抗病位点，受环境影响大，难以进行基因
聚合育种。众多学者认为海岛棉和部分野生棉种中
存在对黄萎病高抗或免疫的材料，并且抗性表现为
单基因或少数主效基因控制［11，14，15］。此外，大量
的研究表明受黄萎病菌胁迫后，在防御酶类、抗病
及参与次生代谢合成相关基因的表达速率或表达量
方面，抗病海岛棉显著高于感病陆地棉［4，16，17］。因
此，本研究以高抗黄萎病的海岛棉 Pima90-53 作为
建库材料。
棉花黄萎病是由黄萎病菌引起的土传真菌维管
束病害。在适宜条件下，黄萎病菌的微菌核或分生
孢子萌发产生菌丝侵入棉花根部，经过皮层进入导
管并繁殖产生大量的菌丝和分生孢子，分生孢子随
导管中的液流上升而扩散到整个植株。因而，根作
为黄萎病菌侵入棉花的首要组织器官对于研究棉花
2014年第12期 109杨君等：黄萎病菌诱导海岛棉酵母双杂交 cDNA文库构建及评价
M ：DNA Marker DL2000 ；1-24 ：插入片段 PCR 产物
图 7 PCR 检测文库插入片段
2000
bp
1000
750
500
250
100
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
抗病机理更具有意义。虽然棉花抗黄萎病侵染机制
还存在争议，但可以肯定的是其抗病过程包括免疫
识别、信号转导和抗病基因表达等［1］。为此，本研
究以多达 12 个时间点的棉花根组织作为建库材料，
保证了文库包含的抗病相关基因数量的最大化。
在过去的一年中，生物基因组测序呈现爆炸式
增长，研究和注释这些基因功能也就成了后续重要
而紧迫的任务［18］。蛋白质是基因功能的执行者和体
现者，研究已知功能蛋白质和未知功能蛋白质相互
作用是揭示未知蛋白功能的重要手段之一。酵母双
杂交 cDNA 文库技术具有研究成本较低、可以检测
到一些微弱的蛋白质互作、在酵母细胞内验证互作
而无需纯化蛋白质等优点，成为当前高通量筛选蛋
白质互作的主要方法［19］。目前，二倍体棉花——雷
蒙德氏棉全基因组图已绘制完成，预测出 40 976 个
蛋白质编码基因［3］。本研究所在课题组前期已构建
黄萎病菌诱导的海岛棉 Pima90-53 全长 cDNA 文库，
获得了 23 126 个 Unigenes。虽然这些基因已通过
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）定
位于各种信号转导和代谢通路，但其在棉花细胞内
的实际功能还有待验证和发掘［4］。因此，本研究构
建的黄萎病菌诱导下的棉花酵母双杂交 cDNA 文库，
不仅有助于棉花基因功能注释，还将推动抗病基因
的发掘和抗病机制的解析。
4 结论
本研究构建了海岛棉 Pima90-53 经强致病力黄
萎病菌诱导的酵母双杂交 cDNA 文库。文库容量为
2.82×106，滴度为 5.02×108 cfu/mL，重组 cDNA 片
段大小集中在 500-1 500 bp 之间，重组率 93.33%。
该文库完全可用于下一步互作蛋白筛选、信号转导
组件确定及抗病蛋白结构和功能分析。
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（责任编辑 马鑫）