全 文 ：第 37 卷 第 3 期
2016 年 5 月
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 ( 自 然 科 学 版 )
Journal of Inner Mongolia Agricultural University (Natural Science Edition)
Vol． 37 No． 3
May． 2016
向日葵黄萎病菌拮抗木霉菌的筛选
* ?
徐嘉俐， 王智慧， 康静， 高颖， 赵君， 周洪友*
(内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010019)
摘要: 本研究对拮抗木霉菌(Trichoderma spp．)与大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb．)进行对峙培养，通过抗生作用测定
和不同浓度代谢提取物对病原菌抑制作用的测定，对初步筛选出的 8 株效果较好的木霉菌作进一步筛选。结果表明:菌株
XM －7 的拮抗作用表现相对稳定，且拮抗作用最强，该菌对峙培养对大丽轮枝菌(V． dahliae)的抑制率为 76． 3%。各菌株挥
发性代谢产物的抑制率大于非挥发性代谢产物，不同浓度代谢提取物之间的抑制率也有显著差异。因此 XM － 7 是一株具
有生防潜能较好的木霉菌株。
关键词: 向日葵黄萎病菌;木霉菌;拮抗作用
中图分类号: S435． 655 文献标志码: A 文章编号:1009 － 3575(2016)03 － 0021 － 05
DOI:10． 16853 / j． cnki． 1009 － 3575． 2016． 03． 004
SCREENING OF ANTAGONISTIC Trichoderma spp．
AGAINST Verticillium dahliae KLEB．
XU Jiali， WANG Zhihui， KANG Jing， GAO Ying， ZHAO Jun， ZHOU Hongyou*
(Agricultural College，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，China)
Abstract: Using confrontation test，detection of volatile and non － volatile inhibitory substances and extract concentration，we se-
lected eight Trichoderma strains which with potential biocontrol activity for further screening． Results indicated that，the strain XM －
7 shows strongly antagonist activity to Verticillium dahliae Kleb． And inhibitory efficiency of dual culture of XM － 7 against Verticilli-
um dahliae reached 76． 3% ． Inhibition rate of volatile substances of Trichoderma spp． was higher than non － volatile substances． The
inhibition rate of extract concentration has significant difference． The strain XM －7 that possed stronger potential ability to biocontrol
were selected through the antagonistic tests against Verticillium dahliae．
Keywords: Verticillium dahliae Kleb．;Trichoderma spp．;antagonism
向日葵黄萎病是向日葵上普遍发生的一种系
统性侵染病害，可使向日葵的盘茎减小，含油量降
低［1］，从而影响向日葵的产量及品质。近年来，该
病在我国东北、内蒙古及宁夏等向日葵主产区均有
发生［2，3］。该病的发生严重影响了向日葵产业的发
展，已成为向日葵产业发展的主要限制因子之一。
向日葵黄萎病既是典型的土传病害，又可以通过种
子进行传播，针对该病害的发生特点，利用生物防治
是一种比较有效且简便的措施，因此越来越受到人
们的重视。
木霉菌是自然界广泛分布的真菌，据统计生防
木霉菌至少对 18 个属 20 余种病原真菌和多种病原
* 收稿日期:2016 － 03 － 09
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(201503109) ;国家向日葵产业体系(CARS － 16) ;国家自然科学基金(31260445，31572049) ;内蒙古农业大学
科技创新培育团队(NDPYTD2013 － 2) ;内蒙古农业大学学生科技创新基金。
作者简介:徐嘉俐(1990 －) ，女，硕士研究生，主要从事植物病害生物防治的研究。
* 通讯作者:E － mail:hongyouzhou2002@ aliyun． com．
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2016 年
细菌有拮抗作用［4］。国内外关于利用木霉菌防治
植物真菌病害，特别是根腐病、枯萎病、菌核病和纹
枯病等土传病害的报道很多，且均取得了良好的防
效［5，6］。木霉菌是当前研究最广泛、应用最多的生
防真菌。但是，目前对木霉菌防治向日葵黄萎病的
研究还鲜有报道，因此本试验通过对分离到的的木
霉菌进行进一步的研究，从而得到拮抗作用较好且
稳定的生防木霉菌株，为利用木霉菌防治向日葵黄
萎病提供参考和生防资源。
1 材料与方法
1． 1 供试菌株
向日葵黄萎病菌:大丽轮枝菌(Verticillium dahl-
iae Kleb．)由内蒙古农业大学植物病理实验室分离
纯化保存。
木霉菌(Trichoderma spp．) :试验所用 8 种野生
木霉菌株是从向日葵及马铃薯根茎部分离得到。
1． 2 平板拮抗活性测定
采用平板对峙培养法将恒温培养 3d 后的木霉
菌分别接到已经生长 5 ～ 6d 的向日葵黄萎病菌(菌
饼提前放在距离平板中央 2 ～ 3cm 处)的平板中。
用直径为 5mm的打孔器打取木霉菌菌丝块，放在接
有靶标菌的 PDA平板的另一侧，保持菌丝块间距离
5 ～ 6cm进行对峙培养，以只接种向日葵黄萎病菌的
平板作为对照，每个处理重复 3 次。逐日观察木霉
菌和黄萎病菌的生长情况，当木霉菌与病原菌菌丝
接触相交后，记录木霉菌对病原菌的抑制、包围和
覆盖等情况。并于接种后第 10d 记载，并计算抑制
率，抑制率用以下公式计算:
抑制率(%)=［(对照菌落直径 －处理菌落直
径)/对照菌落直径］× 100%
1． 3 挥发性代谢物对病原菌的抑制作用
采用对扣法［7］，在活化 3d 的木霉菌菌落边缘
打取直径为 5mm的菌饼，接种于 PDA平板中央，然
后对扣 1 个大小相等，且接种有直径 5mm的向日葵
黄萎病菌菌饼的平板，用封口膜密封后，置于黑暗
条件下 25℃恒温培养。以未接种供试木霉菌的空
白 PDA平板和接种病原菌的平板对扣处理作为对
照，每处理重复 3 次，3d 后观察木霉菌和病原菌的
生长情况，并于 10d 测量病原菌菌落直径并计算抑
制率，方法同 1． 2。
1． 4 非挥发性代谢物对病原菌的抑制作用
非挥发代谢产物抑菌作用参照圆盘滤膜法［8］
测定:在直径 9cm的 PDA平板上平铺灭菌的圆形玻
璃纸(直径约 9． 2cm) ，将活化 3d 的木霉菌菌饼(直
径 5mm)置于平板玻璃纸中央，25℃恒温培养，每处
理重复 3 次。3d后去除玻璃纸，在平板中央接入向
日葵黄萎病菌菌饼(直径 5mm)。以未接种供试木
霉菌只接种向日葵黄萎病菌的处理为对照，恒温培
养 3d后，观察抑制情况，10d 测量病原菌菌落直径，
并计算抑制率，方法同 1． 2。
1． 5 不同浓度代谢提取物对病原菌的抑制作用
代谢物的提取:将恒温培养 3d的各野生木霉菌
落边缘打菌饼，放入已经灭菌的 PDB 培养液中，在
25℃下 150 r /min 培养 6 ～ 8d，用灭菌的双层纱布过
滤，滤液置于 50mL 离心管中，4 000 r /min 离心
10min，上清液用 0． 2μm 的滤膜过滤两次。代谢提
取物设 4 个浓度，分别为 100%、75%、50%、25%，
各吸取 1 000μL打入 PDA平板中，每个浓度设 4 个
重复，设无菌水为空白对照，24h 后将病原菌的菌饼
置于平板中央，于 25℃下培养 20d，记录病原菌的生
长情况并计算抑制率，方法同 1． 2。
2 结果与分析
2． 1 平板拮抗活性测定
在木霉菌与黄萎病菌对峙培养的过程中发现
(见表 1) ，供试木霉菌大多都可以迅速占领生长空
间，对峙培养 2 ～ 3d后木霉菌与黄萎病菌开始接触，
交界处黄萎病菌的菌丝受到抑制，停止生长，木霉菌
则继续生长，直到把黄萎病菌完全覆盖，木霉菌与黄
萎病菌接触处病原菌菌丝塌陷，4 ～ 5d 后木霉菌完
全包围或覆盖黄萎病菌，除了 PT － 13 和 PT － 31 菌
株外，多数木霉菌在黄萎病菌的菌落上可以产孢，而
菌株 PT － 13 和 PT － 31 可在黄萎病菌菌落周围产
孢。从表 1 可见，8 种木霉菌对黄萎病菌的抑制率
都在 50%以上，其中菌株 XM － 7 抑制率最为显著，
抑制率为 76． 3%，菌株 PT － 5 抑制率次之，为
62． 7%，PT － 13 的抑制率最低为 50． 8%，各供试木
霉菌株对黄萎病菌的抑制效果之间存在差异显著
性，说明了各木霉菌株对黄萎病菌具有较好的拮抗
效果。
22
第 3 期 徐嘉俐等:向日葵黄萎病菌拮抗木霉菌的筛选
表 1 对峙培养时木霉菌对向日葵黄萎病菌生长的抑制作用
Table 1 Inhibitory activity of Trichoderma spp． strains on colony growth of Verticillium dahliae Kleb． dual culture
菌种
Strains
菌落直径(cm)
Colony diameter(cm)
抑制率(%)
Inhibition rate(% )
差异显著性(p = 0． 05)
Significant difference
拮抗级别［9］
Antibiosis
PT － 5 2． 2 62． 7 g 1
PT － 12 2． 5 57． 6 d 2
PT － 13 2． 9 50． 8 b 3
PT － 15 2． 5 57． 6 d 2
PT － 25 2． 8 52． 5 c 2
PT － 31 2． 3 61． 0 f 3
PT － 34 2． 4 59． 3 e 2
XM －7 1． 4 76． 3 h 1
CK 5． 9 － － a － －
2． 2 挥发性代谢物对病原菌的抑制作用
通过采用对扣法测定木霉菌挥发性代谢产物
对黄萎病菌的抑制作用，结果见表 2。从表中可见，
8 种木霉菌的挥发性代谢产物对病原菌抑制作用都
在 60%以上，其中抑制效果最好的为 PT － 13，抑制
率达到 76． 1%，其次为 PT － 12、PT － 15、和 XM － 7，
其抑制率均为 73． 9%。
表 2 木霉菌挥发性代谢物对向日葵黄萎病菌生长的抑制作用
Table 2 Inhibition rate of volatile substances of Trichoderma spp． on the growth of Verticillium dahliae Kleb．
菌株
Strains
菌落直径(cm)
Colony diameter(cm)
抑制率(%)
Inhibition rate(% )
差异显著性(p = 0． 05)
Significant difference
PT － 5 1． 3 71． 7 c
PT － 12 1． 2 73． 9 c
PT － 13 1． 1 76． 1 c
PT － 15 1． 2 73． 9 c
PT － 25 1． 8 60． 9 b
PT － 31 1． 8 60． 9 b
PT － 34 1． 6 65． 2 bc
XM －7 1． 2 73． 9 c
CK 4． 6 － － a
2． 3 非挥发性代谢物对病原菌的抑制作用
参照圆盘滤膜法测定非挥发性代谢物对病原
菌的抑制作用，结果表明，非挥发性代谢物相比挥
发性代谢物对病原菌的抑制率较低。其中 XM － 7
表现出较好抑制作用，抑制率为 59． 6%，除菌株 PT
－ 5、PT － 12 和 PT － 13 之间没有显著差异外，其余
各菌株之间均表现出显著性差异(见表 3)。
32
内 蒙 古 农 业 大 学 学 报 (自 然 科 学 版 ) 2016 年
表 3 木霉菌非挥发性代谢物对向日葵黄萎病菌生长的抑制作用
Table 3 Inhibition rate of non － volatile substances of Trichoderma spp． on the growth of Verticillium dahliae Kleb．
菌株
Strains
菌落直径(cm)
Colony diameter(cm)
抑制率(%)
Inhibition rate(% )
差异显著性(p = 0． 05)
Significant difference
PT － 5 2． 8 46． 2 d
PT － 12 2． 8 46． 2 d
PT － 13 2． 8 46． 2 d
PT － 15 2． 6 50． 0 e
PT － 25 3． 1 40． 4 b
PT － 31 3． 0 42． 3 c
PT － 34 2． 5 51． 9 f
XM －7 2． 1 59． 6 g
CK 5． 2 － － a
2． 4 不同浓度代谢提取物对病原菌的抑制作用
木霉菌不同浓度代谢提取物对病原菌的抑制
结果见图 1。从图中可见各菌株的代谢提取物的浓
度越大，其对病原菌的抑制率越大，当代谢提取物
浓度为 100%时，其抑制率达到最大。菌株 XM － 7
在浓度为 100%时的抑制率最大，为 33． 75%，其次
分别为 PT － 15、PT － 34 和 PT － 25，其中菌株 PT －
15 和 PT － 25 各处理间存在显著性差异，菌株 PT －
12、PT － 13 和 PT － 31 各处理间不存在差异显著性。
图 1 木霉菌不同浓度代谢提取物对向日葵黄萎病菌生长的抑制率
Fig． 1 Inhibition rate of extract concentration of Trichoderma spp． on the growth of
Verticillium dahliae Kleb．
3 讨论
本研究结果显示，木霉菌 XM －7 平板对峙抑菌
效果较好，且与其他菌株都有显著差异，在对峙培
养时，由于木霉菌生长速度较快，而黄萎病菌生长
较为缓慢，所以在培养过程中需要先将病原菌培养
5 ～ 6d，再进行对峙培养。菌株 PT － 13 挥发性代谢
产物对黄萎病菌的抑制效果较好，但与 XM －7 没有
显著差异;在测定挥发性代谢产物的抑制率时，木
霉菌气生菌丝比较发达，如用二分格培养皿则效果
较差，所以应采用对扣法测定。菌株 XM －7 非挥发
性代谢产物对黄萎病菌的抑制率最大，且与其他菌
株之间都有显著差异。总体而言，各菌株挥发性代
谢产物的抑制效果均优于非挥发性代谢产物，所以
在与黄萎病菌对峙培养过程中，各菌株的挥发性代
谢产物可能起着关键的作用。
从各木霉菌株不同浓度代谢提取物对黄萎病菌
的抑制作用结果可以看出，总体上表现出代谢提取
物的浓度越大，其对病原菌的抑制率越大，这与前人
的研究结果基本一致［10］。菌株 XM － 7 与其它菌株
相比，在浓度为 100%时其对病原菌的抑制率最大。
42
第 3 期 徐嘉俐等:向日葵黄萎病菌拮抗木霉菌的筛选
以上结果表明，菌株 XM － 7 表现相对稳定，具
有潜在的生防潜能，但其对黄萎病菌的生防机制仍
需进一步研究。采用不同筛选方法，同一木霉菌株
表现的抑制效果是不同的，这可能是由于木霉菌实
现生物防治的机制和途径有多种，不同木霉菌株的
生防机制是不同。因此，为了获得有效、相对稳定
的木霉菌株，需要通过多种筛选方法来获得。
参 考 文 献:
［1］Hoes J A． Losses due to Verticillium wilt in sunflower［J］．
Phytopathology，1972，62:764．
［2］薛伟． 向日葵黄萎病病圃建立及抗性品种筛选鉴定
［J］．安徽农学通报，2013，19(21):39 － 40．
［3］曹雄，任杰，张贵． 土壤因子对向日葵黄萎病菌生长的
影响［J］． 内蒙古农业大学学报(自然科学版)，2014，4
(35):35 － 39．
［4］Harman G E，Howell C R，Viterbo A，et al． Nature Re-
view Microbiology［J］． 2004，2:43 － 561．
［5］朱廷恒，邢小平，孙顺娣．木霉 T97 菌株对几种植物病原
真菌的拮抗作用机制和温室防治试验［J］．植物保护学
报，2004，31(2):139 － 144．
［6］李琳，张雅梅，张祥辉，等．生防棘孢木霉 T31 菌株的
分离筛选及其生物学特性研究［J］． 植物保护学报，
2014，41(1):54 － 60．
［7］Whipps J M，Magan N． Effects of nutrient status and water
potential of media on fungal growth and antagonist － patho-
gen interactions［J］． Bulletin OEPP，1987，17(4):581
－ 59．
［8］ Dennis C，Webster J． Antagonistic properties of species
groups of Trichoderma I． Production of non － volatile anti-
biotics［J］． Transactions of the British Mycological Society，
1971，57(1):25 － 39．
［9］曹玉桃，姚革，文成敬，等．木霉拮抗黄瓜枯萎病菌菌株
的筛选［J］． 西南农业学报，2007，20(3):408 － 411．
［10］Hernández C F D，Flores F W，Castillo R F，et al． Anti-
biosis In vitro of Trichoderma Strains Metabolic Extract on
Mycelial Growth and Reproductive Capacity of Fusarium
oxysporum Isolated from Pepper Plants(Capsicum annuum
L．) ［J］． British Biotechnology Journal． 2014，4(4):387
－ 399．
52