全 文 ：·综述与专论· 2012年第10期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
微生物是自然界生态系统中的重要成员之一，
参与地球物质循环和能量转化，在维持环境和生态
平衡健康方面发挥了重要的作用。在种类和数量上
看，微生物是地球上仅次于昆虫的第二类生物。微
生物生态学是研究微生物与其周围生物和非生物环
境之间相互关系的一门学科，是微生物学与生态学
结合的产物［1］。作为本身具有独特性的一门学科，
微生物生态学于 20 世纪后半叶迅速发展起来。微生
物以群落的形式存在于自然环境中，其生态特征包
括结构特征和功能特征。结构特征描述微生物群落
的组成种类、丰度及其在不同环境条件下的演替 ；
功能特征则描述微生物群落的行为，包括底物代谢
过程、与环境或宿主及群落内其他成员的相互作用
收稿日期 ：2012-04-26
基金项目 ：浙江省重点科技创新团队项目（2010R50025-7），浙江省自然科学基金（Y.12D060004），宁波市科技创新团队项目（2011B81007）
作者简介 ：沈梅丽，女，硕士研究生，研究方向 ：藻际微生物多样性 ；E-mail: lianyi6@yahoo.cn
通讯作者 ：杨锐，女，副研究员，硕士生导师，研究方向 ：藻类生物技术 ；E-mail: yangrui@nbu.edu.cn
分子生物学方法及其在海洋微生物生态中的应用
沈梅丽 杨锐
（宁波大学海洋学院 应用海洋生物技术教育部重点实验室 宁波市海洋生物工程重点实验室，宁波 315211）
摘 要： 微生物在生态系统中起着独一无二的生态作用。微生物生态学的发展和工农业、环境保护及社会科学有着紧密的
联系。海洋作为地球上最大的生境，孕育着大量的生物资源，是研究微生物生态的主要来源。综述微生物生态研究相关的分子生
物学方法及海洋微生物生态的应用进展。
关键词： 微生物生态 分子生物学方法 海洋微生物生态 应用
Molecular Biology Methods and Applications in
Marine Microbial Ecology
Shen Meili Yang Rui
（Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology，Ministry of Education，Key Laboratory of Marine
Biotechnology of Ningbo，Ningbo 315211）
Abstract: As a member of the ecological system, microbial organisms play a special ecological role. Microbial ecology develops,
associated with agriculture, industry, environmental conservation and social sciences. Marine environment makes up the largest habitat of the
earth, containing rich biological resources. Thus popular attentions are attracted by it to research marine microbial ecology. The molecular
methods have been applied to microbial ecology that is called molecular microbial biology and its applications in marine microbial ecology were
summarized in the review.
Key words: Microbial ecology Molecular biology methods Marine microbial ecology Applications
和对外界干扰的反应等［2］。微生物生态学致力于研
究微生物间的相互作用及生物与非生物环境，以阐
释微生物群落结构及其多样性的调控规律［3］。
20 世纪 70 年代之前的微生物生态学研究以细
胞学为基础，主要依赖传统的分离培养方法和显
微技术，从形态特征、培养特征和生理生化特性等
出发建立分类体系和系统进化关系。但是此类依赖
于培养的方法由于无法重现微生物的天然环境条件
和缺少微生物间相互作用等原因，致使分离到的微
生物只占总量的 0.1%-10%［4］，只能提供一小部分
有限的微生物群落信息。近二三十年来，各种自然
环境中的微生物生态研究报道层出不穷，包括沉积
物［5， 6］、土壤［7， 8］、温泉［9， 10］、海水［11］、淡水［12， 13］
2012年第10期 21沈梅丽等 ：分子生物学方法及其在海洋微生物生态中的应用
等。这类研究逐渐突破传统微生物纯培的限制，利
用分子生物学方法，将微生物研究种群从可培养扩
展到全部的生命形式（包括可培养、不可培养、难
培养和自然界环境基因组等），以此来研究微生物生
态学的基础理论问题，从而形成了一个独立的分支
学科——分子微生物生态学。
分子微生物生态学中常用的技术主要有标记核
酸探针杂交技术、rRNA 序列同源性分析方法、PCR
扩增技术和梯度凝胶电泳方法等［14］。本文以分子生
物学方法为重点，综述了分子生物学方法及其在海
洋微生物生态中的研究进展。
1 微生物生态学研究方法
1.1 传统方法
研究微生物生态学的传统方法基本上可分为直
接测定、培养、代谢活力测定等。这些方法直观快
速、操作简单，但是反映的只是自然环境中微生物
的一小部分。近年来数学统计和数学建模发展迅速，
为在短时间内调查生态演变过程规律和预测生态演
变过程的发展趋势提供优化服务方案［1，15］。
1.2 现代分子生物学方法
1.2.1 DNA 指纹图谱分析 限制性片段长度多态性
分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）
是第一代以 DNA 指纹图谱为基础应用于微生物生
态的方法。RFLP 用限制性内切酶酶切基因组 DNA，
电泳分离后用指纹图谱比较不同基因组之间的核苷
酸差异，常与 PCR 技术相结合简化图谱带型以利于
分析。此法可以直接研究基因组成，分辨能力强且
不受环境影响，更适合种间及种内株间的分型鉴定，
因此广泛应用于环境中微生物多样性及其群落结构
的研究。
随着 16S rRNA 基因的普遍通用性，末端限制
性片段长度多态性分析（terminal restriction fragment
length polymorphism，T-RFLP）在用限制性内切酶消
化前，根据 16S rRNA 保守区设计通用引物，在其
中一个引物的 5端用荧光物质标记，扩增基因组总
DNA，使得 PCR 产物一端带有荧光标记，消化产物
用自动测序仪检测，检测结果反映微生物群落组成。
T-RFLP 技术灵敏度高，随着发展起来的图谱分析
工具［16］，在研究微生物群落结构和微生物群落动态
变化方面得到广泛应用。此法不仅可以进行微生物
种类的定性分析，还能通过图谱中峰的相对面积进
行定量分析，但是无法确定是何种微生物，一般与
rDNA 克隆文库分析或核酸杂交分析结合确定微生物
种类。
随机扩增多态性 DNA 分析（randomly-amplified
polymorphic DNA，RAPD）人工随机合成 DNA 引物，
以基因组 DNA 为模板扩增多态性 DNA 片段，通过
电泳图谱来研究微生物多样性。此法可用于种间亚
种间及菌株间的亲缘关系分析，且所需模板量少、
操作简单快速，是研究微生物生态的常用的方法之
一［17］。但重复性较差，在小试和中试规模方面应用
较多。
扩增片段长度多态性分析（amplified fragment
length polymorphism，AFLP）先用限制性内切酶将基
因组 DNA 消化后，通过接头连接和一系列 3端含
数个随机变化碱基的引物设计，特异性扩增基因组
DNA 双酶切片段，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，
显示多态性。此法分辨率高、重复性好，为研究微
生物之间尤其是原核生物属以下之间的亲缘关系提
供了一个有效的手段。
单链构象多态性分析（single strand conformation
polymorphism，SSCP）利用单链 DNA 因碱基差异而
形成不同的空间折叠构象，在非变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳（PAGE）时受阻差异而实现分离。此法操作
简便、经济，且 SSCP 分离的条带可回收用于后续
的克隆测序、印迹等试验。SSCP 结合 PCR 后能有
效提高检测的灵敏性和简便性，广泛应用于微生物
群落的结构和演替分析中。
核糖体基因间隔序列分析（ribosomal intergenic
spacer analysis，RISA）以核糖体大小亚基基因间隔
序列（intergenic transcribed sequences，ITS）为研究
对象，因该片段比核糖体大小亚基 DNA 表现出更
明显的长度特异性，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电
泳实现基因组总 DNA 的 ITS 扩增产物的分离，形成
微生物群落特异性长度多态性图谱，即 RISA 图谱。
此法简单经济、易操作，常用于分析微生物群落结
构变化，结合克隆测序可详细了解微生物群落结构
信息。尽管 RISA 只能分辨相差十几个碱基的片段，
在精度上受限，如能和其他方法（如 DGGE）互补，
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期22
不失为研究微生物生态学的好方法之一。
变性梯度凝胶电泳系统自 20 世纪 80 年代初发
明以来［18］，于 1993 年首次应用于微生物群落结构
研究［19］，之后衍生出了温度梯度凝胶电泳，两者
都是根据 PCR 扩增的核苷酸序列的不同实现片段的
分离，在揭示自然界微生物的遗传多样性和菌群异
化上具有独特的优势。不同的是，变性梯度凝胶电
泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）使
用含尿素和甲酰胺的变性梯度聚丙烯酰胺凝胶，将
存在碱基差异的片段在相应变性浓度下部分解链，
最终因构象变化使得电泳迁移率不同而形成差异的
条带 ；温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel
electrophoresis，TGGE）则使用固定浓度的变性剂促
进解链，片段在线性温度梯度的聚丙烯酰胺凝胶中
迁移，因解链时间的不同而形成差异的条带。一般
DGGE 操作前，会在其中一个 PCR 引物的 5加上富
含 GC 碱基的片段，即 GC 夹子，使 PCR 产物的一
端不能解链形成单链 DNA。理论上 DGGE 的分辨率
达到一个碱基的差异，但由于 16S rRNA 可能是多拷
贝的，会出现多条带同种的情况 ；此外，假如不同
片段表现为相同的解链行为，则会出现同条带异种
的情况［20］。同时，电泳片段长度受限，一般为小于
500 bp 的小片段，不利于之后的系统进化分析和探
针设计。尽管有以上的不足，DGGE 和 TGGE 在微
生物生态研究方面的前景还是备受关注的，广泛应
用于微生物群落丰度与复杂性、微生物群落动态演
替和优势菌群的鉴定及分离等研究。
DNA 指纹图谱分析技术成熟，容易操作且结果
直观便于分析，但是还不能较好完整地体现微生物
多样性，常多种指纹图谱综合应用或者结合其他分
子生物学方法分析。Sigler 等［21］研究了两个冰川前
沿中的微生物多样性，结合RISA和DGGE两种方法，
证实两地的微生物群落在数量及组成上不同，微生
物活性也存在差异。Gernert 等［22］利用 16S rDNA
克隆文库与 PCR-RFLP 技术结合研究了淡水海绵
Spongilla lacustris上的微生物多样性，发现有一半的
细菌 Actinobacteria 及 Betaproteobacteria和水体中的
一样，并发现了两株低相似度的 Alphaproteobacteria。
Edwards 等［23］利用 T-RFLP 结合 16S rRNA 克隆文
库，比较了 3 处的微生物多样性，16S rRNA 克隆
文库测序比较发现 Proteobacteria、Cyanobacteria 和
Bacteroidetes为优势菌群，但是 T-RFLP 结果则显
示冷冰尘穴和两处高温性冰尘穴的群落差异显著，
这可能与有机物、温度和微生物代谢活性有关。
Uphoff 等［24］结合应用 FISH 和 RAPD 技术，发现
γ-Proteobacteria、β-Proteobacteria、α-Proteobacteria
和 Cytophaga/Flavobacterium/Bacteroides（CFB）的细
菌为优势菌群，且其中的大部分在当时为未知菌。
Hernandez-Raquet 等［25］ 综合利用 DGGE、RISA 和
AFLP 技术，研究了 Etang de Berre 油污染生物垫的
微生物多样性，显示各处的多样性丰度基本一致。
Zinger 等［26］利用 16S rDNA 文库和 SSCP 技术分析
高山冻原初定的土壤微生物多样性发现，雪盖的时
空变化影响微生物群落结构及多样性。
1.2.2 基因克隆文库（16S rDNA clone library） 自
Woese 等［27，28］发现 16S rRNA 在生物进化过程中
的高度保守性，16S rRNA 已成为系统发育分析的
分子标记［29］，依据保守性和特异性确定系统发
育的相关性。16S rDNA 克隆文库的构建以样品总
DNA 为模板，使用通用引物扩增 16S rRNA 基因序
列，再将扩增产物克隆到载体中，转化到易于培
养的工程菌中，最后通过测序与已知 16S rRNA 基
因序列库比对，确定分类地位。尽管该法耗时耗
财，但 16S rDNA 克隆文库是目前比较准确的方
法之一，在微生物生态学的研究中占有重要地位。
Olsen 等［30］首先将 rRNA 用于微生物群落的多样性
分析，开创了从进化发育角度研究微生物生态的新
时代。Fang 等［31］利用 16S rDNA 克隆文库分析了
日本相模湾冷渗沉渣中的微生物群落结构发现，占
优势的细菌为 Gammaproteobacteria（57%-64%）和
Deltaproteobacteria（27%-29%），但古生菌的组成大
不相同。Dick 等［32］研究了瓜伊马斯盆地深海热液
口及其周边海水的微生物多样性，构建 16S rDNA 克
隆文库测序后发现，两者在细菌和古生菌多样性上
基本一致，占优势的分别都是 Gammaproteobacteria
和 Crenarchaeota。 Manickam 等［33］ 通 过 构 建 16S
rDNA 克隆文库，分析印度多处含氯农药污染土壤
的微生物群落多样性发现，其复杂性及多样性与
生物降解的菌群很相似，且生物降解相关基因 linA
的存在确证了该微生物群落有降解农药 HCH 的
2012年第10期 23沈梅丽等 ：分子生物学方法及其在海洋微生物生态中的应用
能力。
宏基因组学（metagenomic）技术是近年来发展
迅速、前景可观的一种新方法。此法直接从环境样
品中提取微生物基因组 DNA，克隆到不同的载体后
重组转移到合适的宿主中建立宏基因组文库，通过
不同的筛选方法，可以从文库中筛选新基因或其产
物，研究基因功能及彼此之间的关系和相互作用，
揭示其中规律［34，35］。宏基因组学技术摆脱了物种界
限，为探索微生物世界提供了新方法，是继显微镜
发明以来研究微生物的方法的最重要进展，必将成
为微生物生态学研究的强有力工具［36，37］。Rondon
等［38］通过 BAC 载体构建土壤宏基因组文库，包
括低 GC 含量、Gram 革兰氏阳性的 Acidobacterium、
Cytophagales 和 Proteobacteria，且这些基因表达了抗
菌、脂肪酶、淀粉酶、核酸酶和溶血活性，为研究
土壤微生物多样性和提供为培养微生物信息的有力
手段。Dinsdale 等［39］进行了 9 个生物群落区的功能
基因组包含 1 500 万条序列的比较，结果显示很多
功能多样性呈现一致性，但是某些代谢物却是相对
出现的，这说明存在生化环境特异性。
1.2.3 核酸杂交技术 荧光原位杂交技术由原位杂
交技术（in situ hybridization，ISH）发展而来，用
已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补原则与
未知单链核酸特异性结合，形成可被检测的杂交双
链。该法应用于环境特定微生物种群鉴定、数量分
析和跟踪检测，已成为分子微生物生态学研究的重
要方法之一［30-42］。Kjellerup 等［43］研究了受腐蚀供
暖系统上的生物膜微生物多样性，经 FISH 分析发
现 β-Proteobacteria、Sulphate reducing prokaryotes 和
α-Proteobacteria 为优势菌群。Díaz 等［44］分析了黑、
灰、棕 3 个来自啤酒厂废水处理的全上升流厌氧泥
床的产甲烷颗粒剂中的微生物多样性，FISH 结果显
示 Firmicutes 为优势细菌群，但在棕色颗粒中却没
有发现 ；古生菌的优势菌群为 Methanosaeta concilii、
Methanosarcina mazei和 Methanospirillum spp.。
近年来基因芯片技术逐渐成熟完善，在本质上
属于一种大规模集成的固相杂交技术。基因芯片技
术是一种高通量的微生物生态学研究策略，根据系
统进化相关性或功能基因相关性设计核苷酸探针固
化于支持物表面，通过对样品杂交信号的分析得出
样品遗传信息。基因芯片按目标基因的不同可大致
分为5类，分别是系统发育寡核苷酸芯片（phylogenetic
oligonucleotide arrays，POAs）、功能基因芯片（functional
gene arrays，FGAs）、群落基因组芯片（community
genome arrays，CGAs）、宏基因组芯片（metagenomic
arrays，MGA）、全基因组开放阅读框芯片（whole-
genome open reading frame arrays，WGA）［3］。此法对
探针设计要求较高，错配或低配会导致检测信号的
假阳或假阴性，但由于其高通量检测的优势，已广
泛应用于微生物生态学研究［45， 46］。De Santis 等［47］
选取城市气溶胶、地表下土壤和下表层海水的微生
物多样性为研究对象，发现高密度 16S rRNA 基因
芯片技术比 16S rRNA 基因文库能更全面地揭示多
样性。Rastogi 等［48］利用高密度 16S 芯片和克隆文
库分析了铀矿土壤中的微生物多样性，芯片显示的
多样性高于克隆文库，且两者的多数群体也不一
样，前者是 Proteobacteria，后者为 Acidobacteria 及
Bacteroidetes。
1.2.4 实时荧光定量 PCR 技术（Real-time PCR） 实
时荧光定量 PCR 技术由美国 Applied Biosystems 公
司于 1996 年推出，近年来得到不断发展，实现了
PCR 从定性到定量的飞跃，具有特异性更强，自动
化程度更高的特点。此法通过荧光信号累积实时监
测整个 PCR 过程，通过标准曲线定量分析未知模板。
Real-time PCR 直观灵敏具有高重复性，在跟踪监测
微生物进化、功能基因的时空变化上具有很好的应
用前景。尽管此法试剂、仪器成本相对较高，由于
其在准确性方面的优势和商业化竞争的促动，目前
已在微生物生态学研究中广泛应用。
Ochsenreiter 等［49］研究了 18 处陆地环境中泉
古菌的多样性和丰度，利用 Real-time PCR 确定了泉
古菌的相对丰度，在成块土壤、沙地根际和农田中
分别为 0.5%-3%、0.16% 和 0.17%。Fierer 等［50］用
特异引物对 3 处土壤的微生物进行了定量分析，验
证了 Real-time PCR 能快速粗略地确定微生物群落
结构。Wasmund 等［51］研究了帝汶海甲烷渗漏沉积
物中的微生物多样性，利用 pmoA 特异的 Real-time
PCR 对好养甲烷营养细菌进行了定量分析发现，在
沉积物甲烷渗出表面有大量此类菌存在。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期24
2 海洋微生物生态研究进展
海洋的面积约占地球总表面积的 3/4，资源巨大
而丰富，是生物多样性的主要来源之一［52，53］。据估
计海洋的生物多样性甚至可能多于热带雨林［54］，但
已知的海洋生物物种约 30 万种，只占到全部生物的
一小部分，它有着开发的无限可能性。目前人们对
海洋生物多样性尤其是海洋微生物多样性还是知之
甚少。海洋微生物无处不在，包括从普通的如表层
海水、近海浅水、近海深水到特殊的如深海热液口、
海底沉积物等各种非生物环境以及各种海洋生物，
如海绵、海藻等。
近些年来一直备受关注的海洋药物开发研究
很多都来自海洋微生物，特别是海洋真菌的代谢产
物［55，56］。海洋微生物生态学的研究正好为此提供了
基础性筛选平台。随着分子微生物生态学的不断发
展，海洋微生物生态方面的研究屡见报道，其神秘
面纱正在一层层地揭开，应用前景也相当可观。
2.1 海洋非生物环境微生物生态学研究
海洋非生物环境主要包括海水和海底沉积物等，
它们为海洋生物提供了宝贵的生存环境，很多研究
报道都是从这些非生物环境中发现了游离微生物并
阐述了两者间的相互关系。
Yoshinaga 等［57］从日本广岛海域分离到了 233
株能杀死有害赤潮藻 Heterosigma akashiwo的细菌，
根据 16S rDNA-PCR-RFLP 分析，一部分细菌属于
γ-Proteobacteria，且可能在 H.akashiwo爆发终止过程
中起到了重要作用。Urakawa 等［58］利用 16S rDNA
文库分析了相模湾和东京湾沉积物中微生物多样性，
发现所有序列和数据库的相似度都大于 84.8%，主
要归为 5 类 ：gamma-、delta-和epsilon Proteobacteria、
Gram-positive bacteria 及 Verrucomicrobia，3 个 取 样
点的群落结构有差异，但是优势菌群都为 gamma
和 high-GC Gram-positive bacteria。 Cottrell 和
Kirchman［59］通过 16S rDNA 文库结合 FISH 方法研
究了加利福尼亚海岸表层海水中的浮游微生物群落
结构，发现 Cytophaga-Flavobacter 为优势群落成员。
Venter 等［60］使用全基因鸟枪法共测定了索加海中微
生物的 10 亿个碱基对，发现了 1 800 个不同基因型
的微生物种类。Huber 等［61］研究了两处相邻深海热
液口的微生物群落结构，通过 90 万个 SSU rRNA 克
隆子测序表明两地的群落结构存在地理性差异，且
几乎没有古生菌。Durbin 等［62］研究了南太平洋海
底沉积物中的微生物多样性，在上层含氧且氮还原
沉积物中，主要为 Marine Group I 古生菌和 Alpha-，
Gamma-and Deltaproteobacteria，Actinobacteria 和
Gemmatimonadetes细菌，在下层无氮且无氧沉积物
中，则主要为非培的 Crenarchaeota 和 Euryarchaeota
古生菌以及非培的Chloroflexi 和Planctomycetes细菌。
Kolukirik 等［5］研究了 Marmara 海底沉积物中微生物
多样性的地理、时间变化，发现 S 和 N 是影响群落
变化的主要因素。
2.2 海洋生物环境微生物生态学研究
微生物共生是一种很常见的生命形式，在真核
生物的进化过程中起着不可忽视的作用。在海洋中
微生物和真核宿主之间存在密切联系是很普遍的现
象，从海洋动植物中人们已经发现了很多特异相关
的微生物。近些年来一直备受关注的海洋药物开发
研究很多都来自海洋微生物的代谢产物。
2.2.1 海绵共附生微生物 海绵是最古老的后生动
物之一，以各种原核微生物和真核生物为食，但同
时也是微生物共附生的绝佳场所［63，64］。按微生物
丰度可分为高微生物丰度海绵和低微生物丰度海绵。
在高丰度海绵中，共附生微生物量可达到 108-1010
每克湿重。
Webster 等［65］研究了海绵 Rhopaloeides odorabile
相关的微生物多样性，有 Actinobacteria，低 G+C 革兰
氏阳性细菌、 Proteobacteria 的 β-、γ-亚支、Cytophaga/
Flavobacterium、绿硫细菌、green nonsulfur bacteria、
planctomycetes 及其他无明显相关性细菌。Webster
等［66］研究了南极海绵 Kirkpatrickia varialosa、Latru-
nculia apicalis、Homaxinella balfourensis、Mycale
acerata和 Sphaerotylus antarcticus上的微生物多样
性，古生菌都可聚类到 Crenarchaeota，细菌则可聚
类 到 Gamma-和Alphaproteobacteria、 Bacteroidetes 的
Cytophaga/Flavobacterium，而且部分细菌只存在于
海绵中在海水中没有发现，具有种类特异性。Taylor
等［67］利用 16S rDNA-DGGE 研究了温热带澳大利亚
Cymbastela concentrica上细菌多样性的地理变化发
2012年第10期 25沈梅丽等 ：分子生物学方法及其在海洋微生物生态中的应用
现，温热带的群落有差异，且海水细菌群落变化小
于海绵附生细菌群落变化，证实了游离海洋细菌的
普遍分布性。Kennedy 等［68］研究了爱尔兰水域的海
绵 Haliclona simulans上的微生物多样性，共有 8 类
细菌，其中 Proteobacteria 占 86%，还可能发现了归
于 Errucomicrobia 和 Lentisphaerae的新属。Liu 等［69］
研究了中国南海海南岛水域两种海绵 Haliclona
simulans和 Gelliodes carnosa上的真菌多样性，发现
两种海绵上的可培真菌多样性很相近，且相比于海
绵种类与周边环境更相关。
2.2.2 海藻共附生微生物 海藻和微生物之间存在
相互关系很早就有共识，1972 年 Bell 和 Mitchell［70］
还提出了“藻际微环境”这一概念，藻类不断向周
围环境释放氨基酸及其他有机物质，为其共附生微
生物的生长提供了营养，同时通过提供特殊微环境
对微生物进行筛选。
陈国耀等［71］对条斑紫菜叶状体附生菌及病原
菌做了初步研究，4 类优势菌群在种类和组成上稳
定，但从网绳上分离到的琼脂降解菌有可能是造成
紫菜脱苗的主要原因。杨锐等［72］研究了四地条斑
紫菜叶状体和丝状体的细菌遗传多样性，共分离到
了 63 株细菌分属 10 个属，且健康样品中假交替单
孢菌占优势，病烂样品中未分离到假交替单孢菌，
提示假交替单孢菌可能与紫菜健康生长有密切关系。
Amaro 等［73］从智利南部的 Alexandrium catenella中
分离了两类具有溶藻活性的细菌 Proteobacteria 和
Cytophaga。Kanagasabhapathy 等［74］ 从 9 种 红 藻 包
括条斑紫菜中分离了 92 株细菌，其中 33% 具有抗
菌活性，表明这些细菌通过释放抗物质抑制其他共
生菌以保持自己的生存地位。Tujula 等［75］研究了
海洋绿藻 Ulvacean上外生细菌多样性及季节性演
替，发现群落多样性随地理位置和季节而改变，但
是优势菌群为 Alphaproteobacteria 和 Bacteroidetes且
处于较稳定状态，可能在群落功能的维持中发挥着
重要作用。Lachnit 等［76］研究了 Fucus vesiculosus、
Gracilaria vermiculophylla 和 Ulva intestinalis 3 种海藻
上的外生细菌发现，群落结构不仅是藻类特异的，
而且是随季节变化的，表明大型海藻表面附生有种
类特异且时间差异的细菌生物膜，可能存在某种功
能联系。Lage 和 Bondoso［77］从 Portugal 南岸的 12 种
大型海藻上分离了 138 株浮霉菌，其中 65% 为 Rho-
dopirellula baltica，其余大致为新种或与 Rhodopirell-
ula、Blastopirellula 和 Planctomyces有关的属。Hollants
等［78］研究了绿藻 Bryopsis上的微生物多样性，16S
rDNA 文库测序显示微生物主要有 Arcobacter、 Bacter-
oidetes、Flavobacteriaceae、Mycoplasma、Labrenzia、
Phyllobacteriaceae和 Xanthomonadaceae。尽管总的多
样性是种类特异的，但是 Bacteroidetes、Mycoplasma、
Phyllobacteriaceae和部分特殊 Flavobacteriaceae细菌
却在相隔数百公里的海面上都有发现。
3 展望
现代分子生物学技术在微生物生态学研究中克
服了传统微生物培养的限制，比较全面真实地揭示
了微生物的种类和遗传多样性。解决实际问题时，
各个技术方法各有侧重，如指纹图谱技术可以分析
微生物的群落结构，FISH 技术可以检测微生物群落
中特定种类的丰度及分布，rRNA 基因序列分析可
以在基因水平上确定微生物种类。此外，生化方法
如磷脂脂肪酸分析（phospholipid fatty acid，PLFA），
以磷脂作为微生物群落的动态监测标记物，虽然不
能在菌种和菌株的水平上鉴别微生物种类，但是检
测快速可靠，主要应用于微生物生物量、群落结构、
营养状况和新陈代谢等方面的研究中［79］。流式细胞
术（flow cytometer，FCM）是一种在功能水平上对微
生物单细胞进行定量分析和分选的检测手段，它可
以高速分析上万个微生物细胞，并能同时从一个细
胞中测得多个参数，不仅有利于微生物群落内个体
的功能分析，而且能够做到对群落内低丰度和未培
洋微生物的分析，尤其是低丰度微生物分析时，可
消除大多数与 PCR 结合的方法带来的弊端［80］。随
着微生物生态学科的逐渐成熟，不断有新技术、新
改进加入，因此，综合利用各种分子生物学方法并
有效结合传统培养和其他有效的定量分析，不断提
高检测的准确度和灵敏度，会更加全面地提供各种
生态系统中的微生物群落结构及其动态演替的信息。
分子生物学方法在未培条件下即可确定微生物
分类及相关遗传信息，为微生物纯培养提供了新的
培养基选择资源，有利于实现活性微生物的实验室
纯培养。此外，分子微生物生态学的发展，为揭示
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期26
各类生态环境尤其是极端环境，如冰川、深海热液
等的微生物群落结构和多样性提供了一条新途径。
海洋生境大而复杂，其中的微生物群落组成也因各
种因素而异，分子生物学方法提供了更加真实、有
效描述海洋微生物多样性的手段，必将成为研究海
洋微生物生态的强有力的工具。
参 考 文 献
［1］ 迟振明 , 王祥红 , 李静 . 现代微生物生态学［M］. 北京 ：科学
出版社 , 2010.
［2］ 刘开朗 , 王加启 , 卜登攀 , 等 . 环境微生物群落结构与功能多样
性研究方法 . 生态学报 , 2010, 30（4）：1074-1080.
［3］ Gentry TJ, Wickham GS, Schadt CW, et al. Microarray applications
in microbial ecology research. Microbial Ecology, 2006, 52 ：
159-175.
［4］ Amann RI, Ludwig W, Sehleifer KH. Phylogenetic identification and
in situ detection of individual microbial cells without cultivation.
Microbiol Rev, 1995, 59 ：143-169.
［5］ Kolukirik M, Ince O, Cetecioglu Z, et al. Spatial and temporal
changes in microbial diversity of the Marmara Sea sediments. Marine
Pollution Bulletin, 2011, 62 ：2384-2394.
［6］ Du J, Xiao K, Huang Y, et al. Seasonal and spatial diversity of mic-
robial communities in marine sediments of the South China Sea. An-
tonie Van Leeuwenhoek, 2011, 100（3）：317-331.
［7］ Bachar A, AlAshha A, Soares MIM, et al. Soil microbial abundance
and diversity along a low precipitation gradient. Microbial Ecology,
2010, 60（2）：453-461.
［8］ Asgharipour MR, Rafiei M. The effects of land use on biomass and
catabolic diversity of soil microbial communities. African Journal of
Agricultural Research, 2011, 6（19）：4607-4612.
［9］ Hobel CFV, Marteinsson VT, Hreggvidsson GÓ, et al. Investigation of
the microbial ecology of intertidal hot springs by using diversity ana-
lysis of 16S rRNA and chitinase genes. Applied and Environmental
Microbiology, 2005, 71（5）：2771-2776.
［10］ Stout LM, Blake RE, Greenwood JP, et al. Microbial diversity of
boron-rich volcanic hot springs of St. Lucia, Lesser Antilles. FEMS
Microbiology Ecology, 2009, 70（3）：402-412.
［11］ Lovejoy C, Massana R, Pedrós-Alió C. Diversity and distribution of
marine microbial eukaryotes in the arctic ocean and adjacent seas.
Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72（5）：3085-
3095.
［12］ Ellis-Evans JC. Microbial diversity and function in antarctic fresh-
water ecosystems. Biodiversity and Conservation, 1996, 5（11）：
1395-1431.
［13］ Fisher MM, Triplett EW. Automated approach for ribosomal
intergenic spacer analysis of microbial diversity and its application
to freshwater bacterial communities. Applied and Environmental
Microbiology, 1999, 65（10）：4630-4636.
［14］ 孙振钧 , 周东兴 . 生态学研究［M］. 北京 ：科学出版社 ,
2010.
［15］ Bolker BM, Brooks ME, Clark CJ, et al. Generalized linear mixed
models ：a practical guide for ecology and evolution. Cell, 2008,
24 ：127-136.
［16］ Marsh TL, Saxman P, Cole J, et al. Terminal restriction fragment
length polymorphism analysis program, a web-based research tool
for microbial community analysis. Applied and Environmental
Microbiology, 2000, 66: 3616-3620.
［17］ Hadrys H, Balick M, Schierwater B. Applications of random
amplified polymorphic DNA（RAPD）in molecular ecology.
Molecular Ecology, 1992, 1 ：55-63.
［18］ Fischer SG, Lerman LS. DNA fragments differing by single
basepair substitutions are separated in denaturing gradient gels ：
correspondence with melting theory. Proc Natl Acad Sci, 1983, 80 ：
1579-1583.
［19］ Muyzer G, De Waal EC, Uitierlinden AG. Profiling of complex
microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis
analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for
16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59 ：
695-700.
［20］ Muyzer G, Smalla K. Application of denaturing gradient gel elect-
rophoresis（DGGE）and temperature gradient gel electrophoresis
（TGGE）in microbial ecology. Antonie Van Leeuwenhoek, 1998,
73 ：127-141.
［21］ Sigler WV, Zeyer J. Microbial diversity and activity along the
forefields of two receding glaciers. Microbial Ecology, 2002, 43
（4）：397-407.
［22］ Gernert C, Glöckner FO, Krohne G, et al. Microbial diversity of the
freshwater sponge Spongilla lacustris. Microbial Ecology, 2005,
50 ：206-212.
［23］ Edwards A, Anesio AM, Rassner SM, et al. Possible interactions
2012年第10期 27沈梅丽等 ：分子生物学方法及其在海洋微生物生态中的应用
between bacterial diversity, microbial activity and supraglacial
hydrology of cryoconite holes in Svalbard. ISME Journal, 2011, 5
（1）：150-160.
［24］ Uphoff HU, Felske A, Fehr W, et al. The microbial diversity in
picoplankton enrichment cultures ：A molecular screening of marine
isolates. FEMS Microbiology Ecology, 2001, 35（3）：249-258.
［25］ Hernandez-Raquet G, Budzinski H, Caumette P, et al. Molecular
diversity studies of bacterial communities of oil polluted microbial
mats from the Etang de Berre（France）. FEMS Microbiology
Ecology, 2006, 58（3）：550-562.
［26］ Zinger L, Shahnavaz B, Baptist F, et al. Microbial diversity in alpine
tundra soils correlates with snow cover dynamics. ISME Journal,
2009, 3（7）：850-859.
［27］ Woese CR, Fox GE, Zablen L, et al. Conservation of primary
structure in 16S ribosomal RNA. Nature, 1975, 254 ：83-86.
［28］ Woese CR, Winkers S, Gutell RR. Architecture of ribosomal RNA：
constraints on the sequence of “tetra-loops”. Proc Natl Acad Sci,
1990, 87 ：8467-8471.
［29］ Lane DJ, Pace B, Olsen GJ, et al. Rapid determination of 16S
ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proc Natl
Acad Sci, 1985, 82 ：6955-6959.
［30］ Olsen GJ, Lane DJ, Giovannoni SJ, et al. Microbial ecology and
evolution ：a ribosomal RNA approach. Annu Rev Microbiol, 1986,
40 ：337-365.
［31］ Fang JS, Shizuka A, Kato C, et al. Microbial diversityof cold-seep
sediments in Sagami Bay, Japan, as determined by 16S rRNA gene
and lipid analyses. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 57 ：429-441.
［32］ Dick GJ, Tebo BM. Microbial diversity and biogeochemistry of the
Guaymas Basin deep-sea hydrothermal plume. Environmental Mic-
robiology, 2010, 2（5）：1334-1347.
［33］ Manickam N, Pathak A, Saini HS, et al. Metabolic profiles and ph-
ylogenetic diversity of microbial communities from chlorinated pes-
ticides contaminated sites of different geographical habitats of India.
Journal of Applied Microbiology, 2010, 109（4）：1458-1468.
［34］ Streit WR, Schmitz RA. Metagenomics-the key to the uncultured
microbes. Current Opinion in Microbiology, 2004, 7 ：492-498.
［35］ Xu JP. Microbial ecology in the age of genomics and metagenomics：
concepts, tools, and recent advances. Molecular Ecology, 2006,
15 ：1713-1731.
［36］ Maron PA, Mougel C, Ranjard L. Soil microbial diversity ：metho-
dological strategy, spatial overview and functional interest. Comptes
Rendus - Biologies, 2011, 334（5-6）：403-411.
［37］ Delmont TO, Robe P, Cecillon S, et al. Accessing the soil metage-
nome for studies of microbial diversity. Applied and Environmental
Microbiology, 2011, 77（4）：1315-1324.
［38］ Rondon MR, August PR, Bettermann AD, et al. Cloning the soil
metagenome ：a strategy for accessing the genetic and functional
diversity of uncultured microorganisms. Appl Environ Microbiol,
2000, 66 ：2541-2547.
［39］ Dinsdale EA, Edwards RA, Hall D, et al. Functional metagenomic
profiling of nine biomes. Nature, 2008, 452 ：629-633.
［40］ Hill GT, Mitkowski NA, Aldrich-Wolfe L, et al. Methods for asse-
ssing the composition and diversity of soil microbial communities.
Applied Soil Ecology, 2000, 15（1）：25-36.
［41］ Moter A, Gbel UB. Fluorescence in situ hybridization（FISH）for
direct visualization of microorganisms. Journal of Microbiological
Methods, 2000, 41 ：85-112.
［42］ Haruta S, Nakayama T, Nakamura K, et al. Microbial diversity in
biodegradation and reutilization processes of garbage. Journal of
Bioscience and Bioengineering, 2005, 99（1）：1-11.
［43］ Kjellerup BV, Thomsen TR, Nielsen JL, et al. Microbial diversity in
biofilms from corroding heating systems. Biofouling, 2005, 21（1）：
19-29.
［44］ Díaz EE, Stams AJM, Amils R, et al. Phenotypic properties and
microbial diversity of methanogenic granules from a full-scale
upflow anaerobic sludge bed reactor treating brewery wastewater.
Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72（7）：4942-
4949.
［45］ Dahllöf I. Molecular community analysis of microbial diversity.
Current Opinion in Biotechnology, 2002, 13（3）：213-217.
［46］ Torsvik V, Øvreås L. Microbial diversity and function in soil ：from
genes to ecosystems. Current Opinion in Microbiology, 2002, 5（3）：
240-245.
［47］ De Santis TZ, Brodie EL, Moberg JP, et al. High-density universal
16S rRNA microarray analysis reveals broader diversity than typical
clone library when sampling the environment. Microbial Ecology,
2007, 53 ：371-383.
［48］ Rastogi G, Osman S, Vaishampayan PA, et al. Microbial diversity
in uranium mining-impacted soils as revealed by high-density 16S
microarray and clone library. Microbial Ecology, 2010, 59（1）：
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期28
94-108.
［49］ Ochsenreiter T, Selezi D, Quaiser A, et al. Diversity and abundance
of Crenarchaeota in terrestrial habitats studied by 16S RNA surveys
and real time PCR. Environmental Microbiology, 2003, 5（9）：
787-797.
［50］ Fierer N, Jackson JA, Vilgalys R, et al. Assessment of soil microbial
community structure by use of taxon-specific quantitative PCR
assays. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71 ：
4117-4120.
［51］ Wasmund K, Kurtböke DI, Burns KA, et al. Microbial diversity in
sediments associated with a shallow methane seep in the tropical
Timor Sea of Australia reveals a novel aerobic methanotroph
diversity. FEMS Microbiology Ecology, 2009, 68（2）：142-151.
［52］ Malakoff D. Extinction on the High Seas. Science, 1997, 277 ：
486-488.
［53］ Bhadury P, Mohammad BT, Wright PC. The current status of
natural products from marine fungi and their potential as anti-
infective agents. J Ind Microbiol Biotechnol, 2006, 33 ：325-337.
［54］ Larsen TO, Smedsgaard J, Nielsen KF, et al. Phenotypic taxonomy
and metabolite profiling in microbial drug discovery. Nat Prod Rep,
2005, 22 ：672-95.
［55］ Bugni TS, Ireland CM. Marine-derived fungi ：a chemically and
biologically diverse group of microorganisms. Nat Prod Rep, 2004,
21 ：143-163.
［56］ Saleem M, Ali MS, Hussain S, et al. Marine natural products of
fungal origin. Nat Prod Rep, 2007, 24 ：1142-1152.
［57］ Yoshinaga I, Kim MC, Katanozaka N, et al. Population structure
of algicidal marine bacteria targeting the red tide forming alga
Heterosigma akashiwo（Raphidophyceae）, determined by
restriction fragment length polymorphism analysis of the bacterial
16s ribosomal RNA genes. Mar Ecol Prog Ser, 1998, 170 ：33-44.
［58］ Urakawa H, Kita-Tsukamoto K, Ohwada K. Microbial diversity
in marine sediments from Sagami Bay and Tokyo Bay, Japan, as
determined by 16S rRNA gene analysis. Microbiology, 1999, 145 ：
3305-3315.
［59］ Cottrell MT, Kirchman DL. Community composition of marine
bacterioplankton determined by 16S rRNA gene clone libraries
and fluorescence in situ hybridization. Applied and Environmental
Microbiology, 2000, 66 ：5116-5122.
［60］ Venter JC, Remington K, Heidelberg JF, et al. Environmental
genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science, 2004,
304 ：66-74.
［61］ Huber JA, Mark Welch DB, Morrison HG, et al. Microbial popula-
tion structures in the deep marine biosphere. Science, 2007, 318 ：
97-100.
［62］ Durbin AM, Teske A. Microbial diversity and stratification of South
Pacific abyssal marine sediments. Environmental Microbiology,
2011, 13 ：1-16.
［63］ Hentschel U, Usher KM, Taylor MW. Marine sponges asmicrobial
fermenters. FEMS Microbiol Ecol, 2006, 55 ：167-177.
［64］ Wang GY. Diversity and biotechnological potential of the sponge-
associated microbial consortia. J Ind Microbiol Biotechnol, 2006,
33 ：545-551.
［65］ Webster NS, Wilson KJ, Blackall LL, et al. Phylogenetic diversity of
bacteria associated with the marine sponge Rhopaloeides odorabile.
Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67 ：434-444.
［66］ Webster NS, Negri AP, Munro MMHG, et al. Diverse microbial co-
mmunities inhabit Antarctic sponges. Environmental Microbiology,
2004, 6（3）：288-300.
［67］ Taylor MW, Schupp PJ, Nys R, et al. Biogeography of bacteria
associated with the marine sponge Cymbastela concentrica.
Environmental Microbiology, 2005, 7（3）：419-433.
［68］ Kennedy J, Codling CE, Jones BV, et al. Diversity of microbes
associated with the marine sponge, Haliclona simulans, isolated
from Irish waters and identification of polyketide synthase genes
from the sponge metagenome. Environmental Microbiology, 2008,
10（7）：1888-1902.
［69］ Liu WC, Li CQ, Zhu P, et al. Phylogenetic diversity of culturable
fungi associated with two marine sponges ：Haliclona simulans and
Gelliodes carnosa, collected from the Hainan Island coastal waters
of the South China Sea. Fungal Diversity, 2010, 42 ：1-15.
［70］ Bell W, Mitchell R. Chemotactic and growth responses of marine
bacteria to algal extracellular products. The Biological Bulletin,
1972, 143 ：265-277.
［71］ 陈国耀 , 沈怀舜 , 朱庙先 , 等 . 条斑紫菜叶状体附生菌及病原
菌的初步调查 . 水产养殖 , 1999（1）：17-19.
［72］ 杨锐 , 方文雅 , 单媛媛 , 等 . 条斑紫菜外生细菌的遗传多样
性 . 海洋学报 , 2008, 30（4）：161-168.
［73］ Amaro AM, Fuentes MS, Ogalde SR, et al. Identification and
characterization of potentially algal-lytic marine bacteria strongly
2012年第10期 29沈梅丽等 ：分子生物学方法及其在海洋微生物生态中的应用
associated with the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella. J
Eukaryo Microbiol, 2005, 52（3）：191-200.
［74］ Kanagasabhapathy M, Sasaki H, Nagata S. Phylogenetic identifica-
tion of epibiotic bacteria possessing antimicrobial activities isolated
from red algal species of Japan. World J Microbiol Biotechnol,
2008, 24 ：2315-2321.
［75］ Tujula NA, Crocetti GR, Burke C, et al. Variability and abundance
of the epiphytic bacterial community associated with a green marine
Ulvacean alga. The ISME Journal, 2010, 4 ：301-311.
［76］ Lachnit T, Meske D, Wahl M, et al. Epibacterial community
patterns on marine macroalgae are host-specific but temporally
variable. Environmental Microbiology, 2011, 13（3）：655-665.
［77］ Lage OM, Bondoso J. Planctomycetes diversity associated with
macroalgae. FEMS Microbiol Ecol, 2011, 78 ：366-375.
［78］ Hollants J, Leroux O, Leliaert F, et al. Who is in there? Exploration
of endophytic bacteria within the siphonous green seaweed Bryopsis
（Bryopsidales, Chlorophyta）. PLoS ONE, 2011, 6 ：1-11.
［79］ Sahl JW, Schmidt R, Swanner ED, et al. Subsurface microbial
diversity in deep-granitic-fracture water in Colorado. Applied and
Environmental Microbiology, 2008, 74（1）：143-152.
［80］ Steenberg AK, Bodelier PLE, Hoogveld HL, et al. Phosphatases
relieve carbon limitation of microbial activity in Baltic Sea sedime-
nts along a redox-gradient. Limnology and Oceanography, 2011, 56
（6）：2018-2026.
（责任编辑 狄艳红）