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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
几十年以前人们已经开始利用微生物来控制害
虫［1，2］。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简
称 Bt）是一种独特的细菌，它与许多化合物一起用
于防治害虫，并且已经商业化，对农业和环境有重
要贡献。尽管其它细菌，包括乳状芽胞杆菌（Bacillus
popilliae）和球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus），也
用作微生物杀虫剂，但是它们的杀虫活性谱与 Bt 相
收稿日期 ：2014-03-03
基金项目 ：国家高技术研究发展计划资助项目（2011aa10a203），转基因生物新品种培育（国家科技重大专项）（2014ZX0800913B-002），国
家基础科学人才培养基金资助项目（J1210069），东北农业大学博士启动基金项目（2010RCB54）
作者简介 ：何宝楠，男，硕士，研究方向 ：生物防治微生物功能基因的发掘、研究和利用 ；E-mail ：hebaonan@163.com
通讯作者 ：高继国，男，硕士，教授，研究方向 ：生物大分子的分离纯化，苏云金芽胞杆菌抗性机理、生物安全性 ；E-mail ：gaojiguo1961@
hotmail.com
苏云金芽胞杆菌 V4 菌株 cry 杀虫基因的鉴定、表达及
杀虫活性分析
何宝楠  李海涛  刘荣梅  王博  高继国
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要 ： 旨在给生物防治提供更多的基因资源，以从本实验室分离的 300 株苏云金芽胞杆菌基因组为模板，利用 cry1 类全
长通用引物进行 PCR cry1 类基因鉴定。经过 PCR-RFLP 鉴定出菌株 V4 含有 cry1Ea 基因，进一步研究发现该菌株还含有 cry2Aa 基因，
并成功克隆到了这两个新基因，被 Bt 国际命名委员会正式命名为 cry1Ea12 和 cry2Aa16。将两种基因在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中
表达，表达蛋白进行杀虫活性测定，结果表明两种蛋白杀虫活性不理想，但对试虫存在明显的体重抑制，而 V4 菌株蛋白具有较高
的杀虫活性。
关键词 ： 苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白 cry1Ea12 基因 cry2Aa16 基因 生物活性
Identification，Expression and Insecticidal Activity Analysis of cry
Genes from Bacillus thuringiensis V4
He Baonan Li Haitao Liu Rongmei Wang Bo Gao Jiguo
（Northeast Agricultural University，College of Life Science，Harbin 150030）
Abstract: In order to provide more gene resources for biological control, we used the cry1 class full-length primers and genomic DNA
of 300 Bacillus thuringiensis strains which stored in our laboratory as the templates to identify cry1 gene-types by PCR. The strain V4 was
identified containing a cry1Ea gene by PCR-RFLP, further study found that the strain also contained cry2Aa gene. The genes from the strain
V4 were cloned, respectively. The two genes were designated as cry1Ea12 and cry2Aa16 by International Nomenclature Committee of Bacillus
thuringiensis. Furthermore, the two genes were respectively transformed into Escherichia coli Rosetta（DE3）strain and the toxicity of the two
genes was evaluated. The results showed that the insecticidal activity of the proteins is not very efficient, but the weights of the test insects are
inhibited obviously, and the insecticidal activity of the protein of the strain V4 is much higher.
Key words: Bacillus thuringiensis Insecticidal crystal protein cry1Ea12 gene cry2Aa16 gene Insecticidal activity
比十分有限。重要的是，Bt 对人类是安全的，也是
世界上应用最广泛的环境友好型生物杀虫剂。Bt 杀
虫基因已经转化到几种主要的作物中，获得了抗虫
的转基因植物，进而提供了农业遗传工程模型［3］。
第 9 版的《伯杰氏细菌鉴定手册》将其归属于第二
类第十八群，革兰氏阳性，芽胞杆菌属的一个种［4］。
Cry1 类杀虫晶体蛋白对多种鳞翅目害虫具有高效的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期126
杀虫活性，是 Bt 杀虫晶体蛋白中研究最为深入的一
类，目前杀虫晶体蛋白的作用方式主要是通过 Cry1
类蛋白进行研究的。随着 cry1 类基因在杀虫工程菌
和转基因抗虫植物中的广泛应用，抗 Bt 毒素的昆虫
已经出现，由于这一威胁，人们希望得到能同时作
用在同一害虫上的不同种类的 Bt 蛋白。由于 Cry2Aa
蛋白对鳞翅目和双翅目都有活性［5］，所以对 Cry1 类
蛋白产生抗性的昆虫，Cry2Aa 蛋白对其也有活性。
Cry2Aa 与 Cry1Aa 的氨基酸序列同源性只有 20%［6］。
然而这两种蛋白的三维空间结构非常相似［7，8］。这
说明 Cry2Aa 蛋白的杀虫机制和许多其它 Cry 蛋白的
杀虫机制相似。所以应用 Cry2Aa 来减缓抗性昆虫的
出现是有价值的。人们已经提出交替使用 Cry1A 类
和 Cry2A 类蛋白来解决抗性问题［9］。长期以来，新
型 Bt 基因的分离、筛选以及培育转 Bt 杀虫基因植
物，一直是世界上众多国家研究的热点。因此充分
发掘我国 Bt 杀虫基因资源已经成为一项极有价值的
工作。为此，本研究从土壤中分离 Bt 菌株并筛选和
克隆杀虫基因，以期获得具有较高杀虫活性的新型
cry1 类和 cry2 类基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 本研究涉及的菌株和质粒见表1。
表 1 菌株与质粒
菌株与质粒 特点描述 来源
E. coli
Rosetta（DE3） F-ompT hsdSB（RB- mB-）gal dcm λ（DE3［lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5］）pLysSRARE（CamR） 本实验室保存
JM109 recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17（rK
-mK
+），e14-（mcrA-），supE44，relA1，Δ（lac-proAB）/ F’［traD36，
proAB+，lacIq，lacZΔM15］
本实验室保存
pMD19-T Vector multiple cloning site，lacZ operator，Ampr TaKaRa
pEB lac operator，T7 promoter，multiple cloning site，His·Tag，HSV·Tag，lacZ start codon，E. coli
promoter，Ampr
本实验室保存
B. thuringiensis
V4 Bt 菌株 本研究
1.1.2 培养基 液体 LB 培养基 ：1.0% 胰蛋白胨、
0.5% 酵母提取物、1.0% 氯化钠，pH7.0。固体 LB
培养基：在液体 LB 培养基中加 1.3% 琼脂。固体 1/2LB
培养基 ：1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0%
氯化钠、1.3% 琼脂，pH7.0。
1.1.3 试 剂 限 制 性 内 切 酶 及 连 接 酶、Pfu 购 自
GiBcol、TaKaRa 公司。dNTP、Taq 酶等购自上海生
工生物工程公司。分析纯化学试剂均为市售。
1.1.4 试 虫 小 菜 蛾（Plutella xylostella）、 棉 铃 虫
（Helicoverpaarmigera）和亚洲玉米螟（Ostriniafurna-
calis）来自中国农科院植物保护研究所提供的标准化
试虫。
1.1.5 PCR 扩增引物 鉴定引物与全长引物均由上
海生工合成。引物序列见表 2。
1.2 方法
1.2.1 晶体形态观察 将 Bt 菌株 V4 在 1/2LB 培养
基上培养 48 h 后，将胞晶混合液滴于载玻片上，涂
抹均匀，烘干固定，石炭酸复红染液染色 3 min，清
水冲洗，100× 油镜进行镜检，石炭酸复红染液配
制方法参见文献［11］。显微镜下观察晶体释放后，
刮取培养物 100 mg 用灭菌蒸馏水洗 3-4 遍，悬浮于
1 mL 无菌水中，将芽胞和晶体混合液滴于玻璃片上，
待其干燥，经锇酸固定后酒精梯度脱水，临界点干燥，
离子溅射喷金（2 nm），HITACHI S -3400N 扫描电镜
观察拍照。
表 2 PCR-RFLP 鉴定引物名称［10］及全长引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
L5un3 ATGGAGATAAATAATCAGAAGCAATG
L3un3 TTCCTCCATAAGGAGTAATTCC
S5un2 GGAAGAACTACTATTTGTGATGC
S3un2 AATAGTTTGAATTACCGCGAGC
Q2AaF ATGAATAGTGTATTGAATAGTGGAAGAAC
Q2AaR TTAATAAAGTGGTGGAAGATTAGTTGG
2014年第9期 127何宝楠等 ：苏云金芽胞杆菌 V4 菌株 cry 杀虫基因的鉴定、表达及杀虫活性分析
1.2.2 cry1Ea 基因和 cry2Aa 基因的鉴定及测序 参
照宋福平等［12］ 方法，通过 cry1 类全长通用引物
L5un3/L3un3［13］、cry2 类半长通用引物 S5un2/S3un2，
以 Bt 菌株 V4 基因组为模板，利用 Taq 聚合酶进行
PCR 扩增，PCR 反应体系为模板 1 μL，引物对各 1
μL，2× Taq mix 10 μL，ddH2O 补至 20 μL。PCR 反
应 程序 ：94℃ 8 min ；94℃ 1 min 53℃ 1 min，72℃
4 min，30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。获得的
cry1 类 PCR 产物进行 PCR-RFLP 酶切分析，随后将
PCR 产物回收与 pMD19-T 载体进行连接，连接产物
转化大肠杆菌 JM109，筛选出阳性转化子，送于上
海生工测序。按照已经发表的 cry2Aa 基因序列，参
照文献设计了扩增全长 cry2Aa 开放阅读框的引物
Q2AaF/Q2AaR，并进行 cry2Aa 全长基因的扩增，引
物序列见表 2。
1.2.3 cry1Ea 和 cry2Aa 基因序列测定、诱导表达及
SDS-PAGE 分析 以 BtV4 菌株的基因组为模板，利
用 KOD 高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。PCR 反
应体系为 ：模板 1 μL，引物对各 1 μL，MgSO4 3 μL，
dNTPs 5 μL，10×Buffer 5 μL，KOD 酶 1 μL，ddH2O
补 至 50 μL。PCR 反 应 程 序 ：94℃ 2 min ；98℃ 10
s，51℃（cry1Ea）/54℃（cry2Aa）30 s，68℃ 4 min
（cry1Ea）/2 min（cry2Aa），30 个循环 ；最后 68℃延
伸 10 min。之后参考文献［14］。
1.2.4 Cry1Ea 蛋白纯化和 Western blot 印迹 Cry1Ea
蛋白纯化用康为世纪的 Ni-Agarose His 标签包涵体蛋
白纯化试剂盒进行纯化。用 Bio-Rad Mini Trans-Blot
Electrophoretic Transfer Cell 装 置 进 行 Western blot，
封闭液为 5% 脱脂牛奶，一抗为 Mouse Anti-His Tag
Monoclonal Antibody， 二 抗 为 Peroxidase-Conjugated
AffiniPure Goat Anti-Mouse lgG（H+L）。利用 AEC 酶
底物试剂盒进行显色反应。
1.2.5 生物活性测定 采用饲料混合法进行杀虫生
物活性测定。将 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶解的粗
提蛋白制备成蛋白样品溶液，将粗提蛋白溶液与饲
料搅拌混匀，分装于经过消毒的培养皿中，挑选活
跃的初孵幼虫接于饲料上，进行生物活性测定，每
个处理重复 3 次，小菜蛾和玉米螟每个重复为 30 头
试虫，棉铃虫每个重复为 24 头试虫。将 10 mmol/L
Tris-Cl（pH8.0）溶液作为阴性对照，利用同样的方
法处理 Cry1Ac 蛋白作为阳性对照。试虫的饲养条件
为 28℃、相对湿度为 70%-80% 的光照培养箱中培
养，小菜蛾初孵幼虫饲育 48 h、棉铃虫和玉米螟初
孵幼虫饲育 168 h 后调查死、活虫数量［15，16］。
2 结果
2.1 晶体形态观察
Bt 菌株 V4 产生的晶体形态，如图 1 中光学显
微镜下箭头所示，从左到右依次为双锥形晶体和立
方形晶体 ；电镜图片中箭头所指，从左到右依次为
立方形晶体和双锥形晶体。
A B
图 1 Bt 野生菌株 V4 的光学显微镜（A）和电镜晶体
图片（B）
2.2 cry1Ea基因和cry2Aa基因的鉴定
PCR 鉴定发现 Bt V 菌株中含有 cry1 类 cry2 类
基 因， 应 用 引 物 L5un3/L3un3 和 S5un2/S3un2 对 Bt
V4 菌株的基因组进行 PCR 扩增结果，见图 2 和图 3。
bp
3500
5000
bp
1000
750
250
100
500
2000
3000
图 2 cry1 类基因扩增结果
bp
5000
3000
750
100
250
500
1000
2000
bp
1200
图 3 cry2 类基因半长引物扩增结果
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期128
对 cry1 类全长基因进行 RFLP 酶切分析，确定
该基因为 cry1Ea 基因（图 4）。参考测序结果，登
录 NCBI 进行序列比对，发现该菌株含有 cry2Aa 基
因。利用全长引物 Q2AaF/Q2AaR 扩增 V4 菌株中的
cry2Aa 基因，PCR 扩增结果见图 5。
对 cry1Ea 和 cry2Aa 基因进行诱导表达，对表
达产物进行的 SDS-PAGE 电泳分析结果（图 6）显
示，两种表达蛋白被检测均在沉淀组分中，转入重
组质粒 pEB1Ea12 的 Rosetta（DE3）菌株中检测到
130 kD 的目的蛋白，在转入重组质粒 pEB2Aa16 的
Rosetta（DE3）菌株中检测到 60 kD 的目的蛋白，与
Bt 菌株 V4 产生的蛋白大小一致。以空质粒 pEB 转
入 Rosetta（DE3）菌株作为阴性对照，未发现表达
的 130 kD 或 60 kD 的蛋白，以上结果说明在大肠杆
菌中成功的表达了上述蛋白。
bp 5000
bp
3000
2000
1177
1088
986
1000
750
500
250
100
2000
3000
5000
bp bp
2100
750
500
250
100
1000
图 4 cry1Ea 基因的酶切结果
图 5 cry2Aa 基因扩增结果
2.3 cry1Ea和cry2Aa全长基因的克隆和表达
利 用 全 长 引 物 L5un3/L3un3 和 Q2AaF/Q2AaR
扩增 BtV4 菌株中的 cry1Ea 和 cry2Aa 基因，将扩增
产物分别克隆到 pEB 载体并筛选平末端连接正确
的 重 组 质 粒 pEB1Ea12 和 pEB2Aa16。 对 重 组 质 粒
pEB1Ea 和 pEB2Aa 基因的测序结果显示，BtV4 菌
株中的 cry1Ea 全长基因大小为 3 507 bp，编码 1 169
个氨基酸残基，分子量为 130 kD，并在国际基因库
GenBank 中登记，其登录号为 KF601559，由 Btδ-内
毒素基因国际命名委员会正式命名为 cry1Ea12。该
菌 株 中 的 cry2Aa 全 长 基 因 大 小 为 1 917 bp， 编 码
639 个氨基酸残基，分子量为 60 kD，并在国际基因
库 GenBank 中登记，其登录号为 KF667522，由 Btδ-
内毒素基因国际命名委员会正式命名为 cry2Aa16。
其中，cry1Ea12 与 cry1Ea11 相似性最高，相似度为
98.12%， 有 65 个 碱 基 差 异 ；cry2Aa16 与 cry2Aa15
相似性最高，相似度为 99.47%，有 7 个碱基差异。
200
kD
1 2 3 4 M
kD
130
116
97
66
60
1 ：Bt 菌株 V4 蛋白 ；2 ：pEB 空载体组分 ；3 ：1Ea 蛋白沉淀组分 ；4 ：2Aa
蛋白沉淀组分 ；M ：高分子量蛋白 Marker
图 6 Cry1Ea 和 Cry2Aa 表达蛋白 SDS-PAGE 电泳
2.4 Cry1Ea蛋白的纯化和Western blot印迹
为了进一步验证 cry1Ea 基因表达是否正确以及
蛋白纯度，对 Cry1Ea 蛋白进行纯化，并进行 SDS-
PAGE 蛋白电泳，结果见图 7。Western blot 印迹结果，
见图 8。
200
116
97
66
44
kD
图 7 Cry1Ea 蛋白纯化 SDS-PAGE 电泳
2.5 Cry1Ea和Cry2Aa及BtV4蛋白杀虫活性的测定
提取 Cry1Ea 和 Cry2Aa 表达产物的沉淀组分以
及 Bt 菌株 V4 蛋白进行杀虫活性测定，本试验进行
了初筛杀虫活性测定。将 3 种蛋白分别设定一个浓
度处理，对小菜蛾和棉铃虫为 20 μg/g，对亚洲玉米
螟为 50 μg/g，每个处理重复 3 次，并用 10 mmol/L
2014年第9期 129何宝楠等 ：苏云金芽胞杆菌 V4 菌株 cry 杀虫基因的鉴定、表达及杀虫活性分析
Tris-Cl 溶液作为阴性对照。初筛结果（表 3）表明，
Cry1Ea 和 Cry2Aa 蛋白对 3 种害虫的杀虫活性很低，
但表现出明显的体重抑制，而同时含有该两种蛋白
的 Bt 菌株 V4 蛋白的杀虫活性很高。由于供试昆虫
数量不足，没有对 Cry1Ea 纯化蛋白进行生物活性测
定，也没有做 Cry1Ea 和 Cry2Aa 两种蛋白的混合增
效试验，有必要后续继续进行这两个试验。
表 3 不同蛋白对几种鳞翅目害虫的初筛杀虫结果
供试昆虫
校正死亡率（%）
Cry1Ea 蛋白 Cry2Aa 蛋白 V4 蛋白
小菜蛾 10.7 8.1 100
亚洲玉米螟 1.3 12.8 52.6
棉铃虫 3.5 4.7 100
CK 处理的平均死亡率：Tris-Cl 对小菜蛾 6.5%；Tris-Cl 对亚洲玉米螟 1.1%；
Tris-Cl 对棉铃虫 19.2%
3 讨论
本研究通过 PCR 扩增反应以及 PCR-RFLP 酶切
鉴定，首先确定 Bt 菌株 V4 含有 cry1Ea 基因，随后
发现该菌株也含有 cry2Aa 基因。Bt 菌株 V4 同时含
有 cry1Ea 和 cry2Aa 基因，对两种基因表达的蛋白
进行杀虫活性测定，结果并不理想。有 3 种可能解
释杀虫活性的测定结果 ：一是由于碱基的差异导致
Cry1Ea12 和 Cry2Aa16 蛋白的空间构象发生改变，致
使其杀虫活性明显降低，Cry1Ea 和 Cry2Aa 蛋白对
小菜蛾活性很高［17，18］并且与其它蛋白具有显著的
协同增效作用［17］，而 Cry2Aa 与 Cry1A 类蛋白作用
于昆虫的受体不同［19-21］，这能够解释为什么 Cry2A
类蛋白能杀死对 Cry1A 类蛋白产生抗性的昆虫［8］，
所以 Cry1Ea 蛋白和 Cry2Aa 蛋白有可能具有协同增
效作用，极大增加彼此的杀虫活性，但由于供试昆
虫数量不足，并没有做两种蛋白的协同增效试验 ；
二是有可能存在其它未知基因，表达的蛋白具有很
高的杀虫活性 ；三是本试验采用包涵体蛋白进行生
物活性测定，但是包涵体蛋白降解速率较快，而生
物活性测定时间较长，这可能导致杀虫活性的降低。
此外，Cry2Aa 蛋白对双翅目也有高活性［18］，可以
对本试验的两种蛋白进行其它不同害虫的生物活性
测定，因此有必要进行后续研究和重复性试验，这
对于构建高效工程菌、转抗虫基因植物、解决昆虫
对杀虫基因产生抗性等问题是有意义的。
4 结论
以本实验室分离得到的 300 株苏云金芽胞杆
菌菌株 DNA 基因组为模板，利用 cry1 类全长通用
引物进行 PCR-RFLP 基因鉴定，发现 Bt 菌株 V4 含
有 cry1Ea 基因，克隆基因全长序列为 3 507 bp，编
码 1 169 个氨基酸残基，分子量为 130 kD，并在国
际基因库 GenBank 中登记，其登录号为 KF601559，
由 Btδ-内 毒 素 基 因 国 际 命 名 委 员 会 正 式 命 名 为
cry1Ea12。同时发现该菌株还含有 cry2Aa 基因，克
隆基因全长序列为 1 917 bp，编码 639 个氨基酸残基，
分子量为 60 kD，并在国际基因库 GenBank 中登记，
其登录号为 KF667522，由 Btδ-内毒素基因国际命名
委员会正式命名为 cry2Aa16。将两种基因在大肠杆
菌 Rosetta（DE3）中表达，并表达蛋白进行杀虫活
性测定，两种基因表达的蛋白杀虫活性不高，但 Bt
菌株 V4 蛋白具有较高的活性。
参 考 文 献
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proteins of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki possess different
图 8 Cry1Ea 蛋白的 Western blot 印迹结果
130
kD
175
95
70
62
51
42
29
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（责任编辑 马鑫）