全 文 ：　　收稿日期 : 2002209219
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (NO. 39970607)
作者简介 : 张永安 (1959 —) ,男 ,陕西西安人 ,研究员.3 参加本项工作的还有袁强、吴燕.
　　文章编号 : 100121498 (2003) 0120019207
我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌
cry 基因资源研究 3
张永安1 , 宋福平2 , 戴莲韵1 , 张　杰2 , 李长友2
(1. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 ,北京　100091 ;
2. 中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 ,北京　100094)
摘要 : 利用 PCR2RFLP 鉴定体系和 SDS2PAGE表达蛋白的分析方法 ,分析了来自我国不同森林立地带
(寒温带、中温带、暖温带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原亚热带、热带) 自然保护区森林土壤中
分离的 72 株苏云金芽孢杆菌的 cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11、cry1I 杀虫晶体蛋白
基因类型 ,表达蛋白和杀虫活性的生物测定。研究表明 :同时含有 cry1、cry2、cry1I 3 类基因的有 21 株
菌 ,6 株菌含有 cry1、cry2 类基因 ,4 株菌含有 cry1 和 cry1I 基因 ,只含有 cry1 基因的有 1 株 , cry2 基因
的 4 株 ,36 株菌不含所鉴定的 10 类基因。同时证明 :绝大多数含有 cry1 基因的菌株表达了 130 kD 蛋
白 ,含有 cry2 基因的菌株表达了 60 kD 的蛋白。对不同农、林害虫棉铃虫、杨扇舟蛾、舞毒蛾、马尾松
毛虫、黄粉甲、榆兰叶甲、落叶松叶蜂等幼虫的杀虫活性进行了生物测定。进一步证明了苏云金芽孢
杆菌 cry 基因 ,表达蛋白及杀虫活性三者的相关性。为生产和科研提供了生物治虫、抗虫育种新的苏
云金芽孢杆菌 cry 基因资源。
关键词 : 苏云金芽孢杆菌 ;杀虫晶体蛋白 ; cry 基因 ;PCR2RFLP ;SDS2PAGE
中图分类号 : S71818 　　　　　文献标识码 :A
苏云金芽孢杆菌 ( Bacillus thuringiensis Berliner 简称 B . t) 杀虫剂 ,由于对人畜无害 ,不污染
环境 ,是目前世界各国害虫防治的重要手段之一。B . t 使目的害虫致死的主要因子是它在生
长发育过程中产生的杀虫晶体蛋白 ( Insecticidal Crystal Protein 简称 ICP) ,通称为δ2内毒素。研
究表明 B . t 菌株的杀虫活性与其携带的编码 ICP 的 cry 基因密切相关 ,其杀虫活性范围从鳞
翅目 (Lepidoptera)已扩大到对双翅目 (Diptera) 、鞘翅目 (Coleoptera) 、直翅目 (Orthoptera) 、膜翅目
(Hymenoptera)等 9 个目昆虫有活性 ,并已广泛地用于防治农、林、贮藏业及医学害虫[1 ] 。因此 ,
鉴定菌株的毒蛋白基因类型 ,对于预测目的昆虫的杀虫谱 ,筛选和构建高效、广谱、新型 B . t
杀虫剂及抗虫转基因植物有着十分重要的意义。
近 10 年来 ,中国林科院 B . t 资源课题组从我国东部季风区不同森林立地带自然保护区
森林土壤中收集了大量 B . t 资源[2 ,3 ] ,为了从中筛选出对农、林危害严重害虫的高毒力菌株和
杀虫毒蛋白 cry 基因 ,与中国农科院植物保护研究所“植物病虫害生物学国家重点实验室”合
作 ,应用已建立的 PCR2RFLP 体系及 SDS2PAGE 表达蛋白的分析方法 ,对我国东部季风区不同
林业科学研究　2003 ,16 (1) :19 　25
Forest Research
森林立地带森林土壤中分离的 72 株 B . t 资源的杀虫毒蛋白 cry 基因及杀虫谱进行了研究。
1 　材料和方法
1. 1 　菌株及来源
本研究所用 B . t 菌株及来源见表 1。
表 1 　菌株来源
编号 菌株代号
来源 (森林土壤)
立地带 自然保护区 编号
菌株
代号
来源 (森林土壤)
立地带 自然保护区 编号
菌株
代号
来源 (森林土壤)
立地带 自然保护区
1 Da1 寒温带 根河潮查
2 Da2
3 Dai1
4 Dai2 中温带 带岭
5 Dai3
6 Dai4
7 Ch1
8 Ch2
9 Ch3
10 Ch4
11 Ch5 中温带 长白山
12 Ch6
13 Ch8
14 Ch9
15 Ch10
16 B11
17 B12
18 B13
19 B14
20 B15 暖温带 百花山
21 B16
22 B17
23 B18
24 B19
25 B20 暖温带 百花山
26 B21
27 Qi1
28 Qi2
29 Qi3 暖温带 千佛山
30 Qi4
31 Qi5
32 Hu1 北亚热带 黄山
32 Hu2
34 Z1
35 Z2 北亚热带 紫金山
36 Z3
37 Z4
38 Wu1
39 Wu2
40 Wu3 中亚热带 武夷山
41 Wu4
42 Wu5
43 Wu6
44 D2
45 D3
46 D4 南亚热带 鼎湖山
47 D5
48 D6
49 卧龙1
50 卧龙2
51 卧龙3 高原热带 卧龙
52 卧龙4
53 卧龙5
54 J 7
55 J 8
56 J 9
57 J10 热带 尖峰岭
58 J11
59 J12
60 J15
61 Xi1
62 Xi2
63 Xi3
64 Xi4
65 Xi5
66 Xi6 热带 西双版纳
67 Xi7
68 Xi8
69 Xi9
70 Xi10
71 Xi11
72 Xi12
1. 2 　培养基
(1)LB 液体培养基 :胰蛋白胨 10 g ,酵母提取物 5 g ,NaCl 10 g 加水定容至 1 000 mL ,pH 值
7. 2 ,15 磅灭菌 20 min。
(2)LB 固体培养基 :LB 液体培养基加入 1. 3 %琼脂粉。
(3) 1/ 2 LB 液体培养基。
1. 3 　苏云金芽孢杆菌质粒 DNA 的提取
见参考文献[4 ]。
1. 4 　PCR2RFLP分析
分别用 K5un2/ K3un2 和 K5un3/ Kun3[5 ] 、S5un2/ S3un2、S5un3/ S3un3、S5un4/ S3un4[6 ] S5un5/
S3un5、S5un8/ S3un8、S5un9/ S3un9、S5un1I/ S3un11 和 S5uni/ S3uni (待发表资料) 共 10 对引物鉴
定 B . t 菌株 cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry8、cry9、cry10、cry11 和 cry1I等 10 类基因。方法见参
考文献[7 ]。
02　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
1. 5 　杀虫晶体蛋白 SDS2PAGE分析
将 B . t 菌株接种于牛肉膏蛋白胨培养基于 30 ℃, 220 r·min - 1培养 40 h ,取 100μL 菌悬液
离心 ,菌体悬浮于 100μL 无菌水中 ,加入 25μL 0. 5 mol·μL - 1 NaOH混匀 ,室温裂解 5 min ,加入
65μL 3 ×样品缓冲液混匀 ,煮沸 10 min ,14 000 r·min - 1离心 5 min ,取上清液进行 SDS2PAGE 电
泳分析 ,方法见参考文献[8 ,9 ]。
1. 6 　生物活性测定
1. 6. 1 　试虫 　鳞翅目 :棉铃虫 ( Helicoverpa armigera ( Hübner) ) 初孵幼虫 ,杨扇舟蛾 ( Clostera
anachoreta (Fabricius) ) 2 龄幼虫 ,舞毒蛾 ( Lymantria dispar (Linnaeus) ) 2 龄幼虫 ,马尾松毛虫
( Dendrolimus punctatus (Walker) )幼虫 ;鞘翅目 :黄粉甲 ( Tenebrio molitor (Linnaeus) )幼虫 ,榆兰叶
甲 ( Pyrrhalta aenescens (Fairm) )幼虫 ;膜翅目 :落叶松叶蜂 ( Pristiphora erichsonii (Hartig) )幼虫。
1. 6. 2 　方法 　棉铃虫幼虫测定见参考文献 [ 10 ]。杨扇舟蛾、舞毒蛾、马尾松毛虫、黄粉甲、榆
兰叶甲、落叶松叶蜂生物测定见参考文献[2 ]。
2 　结果和讨论
2. 1 　B . t 资源 cry 基因类型鉴定
采用已建立的 PCR2RFLP 方法 ,对我国东部季风区不同森林立地带 (寒温带、中温带、暖温
带、北亚热带、中亚热带、南亚热带、高原亚热带和热带等) 森林土壤中分离的 72 株 B . t 菌株
进行了杀虫晶体蛋白 cry 基因类型鉴定 ,结果列入表 2。在所鉴定的菌株中 ,同时含有 cry1、
cry2、cry1I 3 类基因的 21 株 ,含有 cry1、cry2 类基因的 6 株 ,含有 cry1 和 cry1I 类基因的 4 株 ,
只含有 cry1 基因的 1 株 , cry2 类基因的 4 株 ,36 株不含所鉴定的 10 类 cry 基因。
2. 2 　杀虫晶体蛋白 SDS2PAGE分析
通过 SDS2PAGE方法 ,测定了 72 株 B . t 菌株所表达的 ICP 分子量 ,结果见表 2 ,有 28 株菌
表达约 130 kD 的蛋白 ;32 株菌表达约 60 kD 的蛋白 ;3 株表达约 90 kD 的蛋白 (1、2、5 号菌株) ;
2 株表达 140 kD 的蛋白 (16、53 号菌株) 。研究表明 :苏云金芽孢杆菌 cry1 ,基因表达的杀虫晶
体蛋白的分子量大部分在 130 　140 kD 之间 , cry2 基因表达蛋白在 60 kD 左右。但也有个别
菌株例外 ,如 19 号菌株虽表达了 60 kD 的蛋白 ,而没有鉴定出 cry2 基因 ,还有些菌株表达了 90
kD 和 140 kD 蛋白 (1、2、5、16、53 号菌株) ,经 cry 基因鉴定均不含有所鉴定的 10 类 cry 基因类
型 ,这些问题尚待进一步研究。
2. 3 　杀虫活性的生物测定
对 67 株 B . t 菌株进行了供试幼虫的室内生物测定 ,结果 (表 3) 看出 ,同时含有 cry1、cry2
基因组合及表达蛋白在 130 　140 kD 及 60 kD 的菌株多数对鳞翅目害虫具有较强的杀虫性 ,
这些菌株在所测的菌株中杀虫死亡率在 60 % 　100 %的占 60 %以上 ,这一结果为 B . t 的制剂
生产和应用提供了丰富的菌种和基因资源。对膜翅目害虫 ———落叶松叶蜂幼虫杀虫死亡率在
60 %以上的 9 株菌 Dai2、Dai3、Dai4、Ch1、Ch10、Qi5、Wu1、Wu4、Wu6 所测得的 cry 基因和表达蛋白
没有一定的规律性 ,有含多个基因的 ,如 :Dai4、Wu4、Wu6 ;有含 1 个 cry2Aa 基因的 ;还有未测出
所设定 10 类 cry 基因的 ,如 :Dai3、Ch1、Wu1。所测的 67 株菌对两种鞘翅目害虫均未显示一定
的杀虫活性。
12第 1 期 张永安等 :我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌 cry 基因资源研究
22　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
32第 1 期 张永安等 :我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌 cry 基因资源研究
　　从不同森林立地带所分离的菌株所含 cry 基因和表达蛋白表明 :寒温带和中温带带岭分
离的菌株Dai1、Dai2 及Dai3 ,均未测出所设定的 10 类 cry 基因类型 ,但它们均含有 90 kD 表达蛋
白 ,其余各森林立地带均含有对鳞翅目害虫具有较强杀虫活性的含有 cry1 和 cyr2 类基因组
合 ,表达蛋白为 130 kD 和 60 kD 的菌株。
3 　结　论
综上所述 :通过对我国东部季风区不同森林立地带森林土壤中所分离的 72 株 B . t 菌株
cry 基因鉴定和表达蛋白的分析及室内生物测定研究结果表明 :三者之间存在着一定的相关
性 ,大部分共同含有 cry1Aa , cry1Ac 和 cry2A 基因 ,表达蛋白在 130 kD 和 60 kD 的菌株 ,对所测
的鳞翅目农、林害虫具有较强的杀虫活性 ,含有单一基因和未测出 cry 基因的菌株均无明显的
杀虫活性 ,因此 ,将 PCR2RFLP 和 SDS2PAGE方法结合起来作为快速、准确、简便预测 B . t 菌株
的杀虫活性 ,为筛选高效、广谱、特异 B . t 菌株 cry 基因资源及其开发利用 (生物治虫、抗虫育
种等)提供了科学、有效的方法。
参考文献 :
[1 ] 喻子牛 ,孙明 ,刘子铎 ,等. 苏云金芽孢杆菌的分类及生物活性蛋白基因[J ] . 中国生物防治 ,1996 ,12 (2) :85 　89
[2 ] 戴莲韵 ,王学聘. 苏云金芽孢杆菌研究进展[M] . 北京 :科学出版社 ,1997
[3 ] 戴莲韵 ,王学聘 ,杨光滢 ,等. 我国四个自然保护区森林土壤中苏云金芽孢杆菌的分布[J ] . 林业科学研究 , 1993 , 6 (6) :
621 　626
[4 ] 张杰 ,宋福平 ,左雅慧 ,等. 31 株苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基因型鉴定及表达产物研究[J ] ,微生物学报 , 2000 , 40
(4) : 372 　378
[5 ] Kuo ,Chak. Identification of novel cry2type genes from Baeillus thuringiensis strains on the basis of restriction fragment length polymor2
phism of the PCR2amplified DNA[J ] . Appl Environ Microbiol , 1996 , 62 : 80 　86
[6 ] 宋福平 ,张杰 ,戴莲韵 ,等. 苏云金杆菌 cry 基因 PCR2RFLP 鉴定体系的建立[J ] . 中国农业科学 ,1998 ,31 : 13 　18
[7 ] 李长友 ,袁强 ,张永安 ,等. 我国不同森林立地带 B . t 分离株杀虫晶体蛋白及基因分析[J ] . 林业科学 , 2002 , 38 (3) :102
　105
[8 ] J 萨姆布鲁克 ,E F 弗里奇 ,T曼尼阿蒂斯. 分子克隆试验指南 (第二版) [M] . 金冬雁 ,黎孟枫 ,等译. 北京 :科学出版社 ,
1992
[9 ] 柏锡 ,张杰 ,宋福平 ,等. 国内 B . t 分离株 ICP 基因鉴定及表达产物研究[J ] . 武汉大学学报 , 1998 , 44 : 56 　58
[10 ] 郭予元. 棉铃虫的研究[M] . 北京 : 中国农业出版社 , 1998. 326
42　 林 　业 　科 　学 　研 　究 第 16 卷
Studies on Resources of Cry2type Genes of Bacillus thuringie2
nsis from Different Soil of Forest Site Zone in China
ZHANG Yong2an1 , SONG Fu2ping2 , DAI Lian2yun1 , ZHANG Jie2 , LI Chang2you2
(1. Research Institute of Forest Ecology , Environment and Protection , CAF , Beijing 　100091 ,China ;
2. State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests , Institute of Plant Protection ,
Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100094 , China)
Abstract : Cry genes , express protein and bioassay of 72 isolations of Bacillus thuringiensis from different
forest site zones (cool temperate zone , temperate zone , warm temperate zone , north subtropical zone ,
subtropical zone , south subtropical zone , high plateau subtropical zone , tropical zone) in China were an2
alyzed by the methods of PCR2RFLP and SDS2PAGE. The results showed that 21 strains contained three
cry2type genes : cry1 , cry2 and cry1 ; 6 strains contained both cry1 and cry2 genes , 4 strains contained
both cry1 and cry1I type genes ; 1 strain contained cry1 type gene , 4 strains contained cry2 type gene ,
36 strains did not contain the ten cry2type genes. Most cry1 genes encoded 130 kD protein that is toxic to
Lepidopteron pest , and most cry2 gene encoded 60 kD protein. The isolates of containing cry1Aa ,
cry1Ac and cry2A type genes had higher toxicity to Helicoverpe armigera , Clostera anachoreta , Lyman2
tria dispar , Dendrolimus punctatus larvae , but isolations of containing one or no cry gene had low toxicity
to these pests.
Key words : Bacillus thuringiensis ; ICP ; cry gene ; PCR2RFLP ; SDS2PAGE 52第 1 期 张永安等 :我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌 cry 基因资源研究