全 文 ：第 v{卷 第 v期
u s s u年 x 月
林 业 科 学
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¤¼ou s s u
我国不同森林立地带 …·分离株杀虫
晶体蛋白及基因分析 3
李长友 袁 强
k中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 tsss|wl
张永安 戴莲韵
k中国林业科学研究院森林保护研究所 北京 tsss|tl
黄大
k中国农业科学院生物技术研究所 北京 tsss{tl
摘 要 } 利用苏云金芽孢杆菌 χρψ基因的 °≤•2• ƒ°鉴定体系和 ≥⁄≥2°„Š∞方法分析了来自我国不同森林立
地带土壤中的 zu株苏云金芽孢杆菌的 χρψt !χρψu !χρψv !χρψw !χρψx !χρψ{ !χρψ| !χρψts !χρψtt !χρψtŒ等 ts类基因类
型和表达蛋白 o并进行了杀虫活性的生物测定 ∀研究表明 }同时含有 χρψt oχρψu oχρψtŒ v类基因的有 ut株菌 oy
株菌含有 χρψt oχρψu类基因 ow株菌含有 χρψt和 χρψtŒ类基因 o只含有 χρψt基因的有 t株 oχρψu类基因的 w株 ovy
株菌不含所鉴定的 ts类 χρψ基因 ∀同时证明 o绝大多数含有 χρψt基因的菌株表达了 tvs ®⁄¤蛋白 o含有 χρψu
基因的菌株表达了 ys ®⁄¤蛋白 ∀生物活性测定表明 o共同含有 χρψt„¤! χρψt„¦和 χρψu基因的菌株对棉铃虫幼
虫具有较强的杀虫活性 o只含有单一基因和不含上述基因的菌株杀虫活性较弱 ∀
关键词 } 苏云金芽孢杆菌 o杀虫晶体蛋白 o χρψ基因 o°≤•2• ƒ° o生物测定
收稿日期 }usst2sw2us ∀
基金项目 }国家自然科学基金项目k‘²}v||zsyszl资助 ∀
3 参加本项工作的还有张杰 !宋福平 !李国勋 ∀
ΑΝΑΛΨΣΙΣ ΟΦΙΝΣΕΧΤΙΧΙ∆ΑΛ ΧΡΨΣΤΑΛ ΠΡ ΟΤΕΙΝ ΑΝ∆ ΙΤΣ ΧΡΨ2ΤΨΠΕ
ΓΕΝΕΣ ΟΦ ΒΑΧΙΛΛΥΣ ΤΗΥΡΙΝΓΙΕΝΣΙΣ ΙΣΟΛΑΤΕΣ ΦΡ ΟΜ ΧΗΙΝΑ
¬≤«¤±ª¼²∏ ≠∏¤± ±¬¤±ª
kΙνστιτυτε οφ Πλαντ Προτεχτιον o Χηινεσε Αχαδεµψοφ ΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ Βειϕινγtsss|wl
«¤±ª ≠²±ªχ¤± ⁄¤¬¬¤±¼∏±
kΙνστιτυτε οφ Φορεστ Προτεχτιον o ΧΑΦ Βειϕινγtsss|tl
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k Βιοτεχηνολογψ Ρεσεαρχη Ινστιτυτε o Χηινεσε Αχαδεµψοφ ΑγριχυλτυραλΣχιενχεσ Βειϕινγtsss{tl
Αβστραχτ } …¤¶¨§²±·«¨ °¨ ·«²§²©°≤•2• ƒ° ¤±§≥⁄≥2°„Š∞o χρψ ª¨ ±¨ ¶¤±§·«¨¬µ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ³µ²§∏¦·¶²©zu¬¶²¯¤·¨¶²©
Βαχιλλυστηυρινγιενσισ©µ²° §¬©©¨µ¨±·©²µ¨¶·µ¼¶¬·¨ ½²±¨ ¶¬± ≤«¬±¤ º¨ µ¨ ¤±¤¯¼½¨ §q• ¶¨∏¯·¶«²º¨ §·«¤··º¨ ±·¼2²±¨ ¶·µ¤¬±¶¦²±2
·¤¬±¨ §·«µ¨¨ χρψ2·¼³¨ ª¨ ±¨ ¶} χρψt o χρψu ¤±§ χρψtŒo¶¬¬¶·µ¤¬±¶¦²±·¤¬±¨ §¥²·« χρψt ¤±§ χρψu ª¨ ±¨ ¶o©²∏µ¶·µ¤¬±¶¦²±·¤¬±¨ §
¥²·« χρψt ¤±§ χρψtŒ·¼³¨ ª¨ ±¨ ¶o²±¨ ¶·µ¤¬±¦²±·¤¬±¨ §χρψt·¼³¨ ª¨ ±¨ o©²∏µ¶·µ¤¬±¶¦²±·¤¬±¨ §χρψu·¼³¨ ª¨ ±¨ qvy ¶·µ¤¬±¶§¬§
±²·¦²±·¤¬±·¨± χρψ2·¼³¨ ª¨ ±¨ ¶q²¶·χρψt ª¨ ±¨ ¶ ±¨¦²§¨§tvs ®⁄¤³µ²·¨¬±·²¬¬¦·²¨³¬§²³·¨µ¤± ³¨¶·o¤±§°²¶·χρψu ª¨ ±¨ ¶
±¨¦²§¨§ys ®⁄¤³µ²·¨¬±q׫¨ ¬¶²¯¤·¨¶¦²±·¤¬±¬±ª χρψt„¤o χρψt„¦¤±§ χρψu·¼³¨ ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ «¬ª«¯¼·²¬¬¦·² Ηελιχοϖερπα αρ2
µιγερα ¤¯µ√¤¨ o¬¶²¯¤·¨¶¦²±·¤¬±¬±ª²±¨ ²µ±² χρψ ª¨ ±¨ «¤§ ²¯º ²µ±²·²¬¬¦¬·¼ ¤¦·¬√¬·¼·² ³¨¶·¶q
Κεψ ωορδσ} ΒαχιλλυστηυρινγιενσισoŒ≤°¶o χρψ ª¨ ±¨ o°≤•2• ƒ°o≥⁄≥2°„Š∞o…¬²¤¶¶¤¼
苏云金芽孢杆菌k Βαχιλλυστηυρινγιενσισo简称 …·l是一类在自然界中广泛分布的革兰氏阳性细菌 o其
主要特征是在孢子形成的同时产生伴孢晶体 o又称杀虫晶体蛋白kŒ±¶¨¦·¬¦¬§¤¯ ≤µ¼¶·¤¯ °µ²·¨¬±¶oŒ≤°¶l或 ∆2
内毒素 o由于这类蛋白对鳞翅目 !双翅目 !鞘翅目 !膜翅目 !同翅目昆虫及动植物寄生线虫等有较强毒杀
作用 o而对人和家畜无毒 !不污染环境 o因而在全球农 !林 !卫生害虫防治中得到广泛应用 ∀t||y年 Š∏²
和 ≤«¤®将 °≤• 和 • ƒ°两种技术结合而产生了 °≤•2• ƒ°k又称 ≤„°¶l新技术 o并应用于进行 …·χρψt类
基因的鉴定 ~t||z年宋福平等在国内先后建立了 χρψu ∗ χρψtt等 …·常见基因类型的 ≤„°¶鉴定体系 o该
体系能鉴定 txs余种的 χρψ基因 ∀目前这种技术已经被国内外许多学者用于 …·菌株 χρψ基因鉴定和杀
虫活性预测 ∀本文应用 °≤•2• ƒ°技术 o对我国不同森林立地带土壤中分离的 zu株 …·野生菌株 χρψ基
因进行了分析 o同时研究了各基因编码的晶体蛋白表达 o并对棉铃虫幼虫进行了杀虫活性测定 ∀
t 材料和方法
111 菌株及来源
zu株 …·菌株为中国林科院森林保护研究所从我国不同森林立地带土壤中分离的 ∀
1 .2 ∆ΝΑ样品制备
取供试菌株接种到…液体培养基中 ovs ε !uusµ#°¬±pt培养 tu «o取 xss ˏ菌液离心 !去上清 o悬浮
于 uss ˏ超纯水中 o煮沸 { °¬±o冷却后离心取上清作为 °≤• 模板 ∀
1 .3 ΠΧΡ2ΡΦΛΠ分析
分别用 Žx∏±uЎv∏±u和 Žx∏±vЎv∏±vkŽ∏² ετ αλqot||yl !≥x∏±uΠ≥v∏±u !≥x∏±vΠ≥v∏±v !≥x∏±wΠ≥v∏±wk宋
福平等 ot||{l !x∏±xΠ≥v∏±x !≥x∏±{Π≥v∏±{ !≥x∏±|Π≥v∏±| !≥x∏±ttΠ≥v∏±tt和 ≥x∏±¬Π≥v∏±¬k待发表资料l共 ts
对引物鉴定 …·菌株的 χρψt !χρψu !χρψv !χρψw !χρψx !χρψ{ !χρψ| !χρψts !χρψtt和 χρψtŒ等 ts类基因 o方法参见
文献宋福平等kt||{l ∀
1 .4 杀虫晶体蛋白 Σ∆Σ2ΠΑΓΕ分析
将 …·接种于牛肉膏蛋白胨培养基于 vs ε !uusµ#°¬±pt培养 ws «o取 tss ˏ菌悬液离心 o菌体悬浮于
tss ˏ无菌水中 o加入 ux ˏs qx°²¯ ‘¤’‹混匀 o室温裂解 x °¬±o加入 yx ˏv ≅样品缓冲液混匀 o煮沸 ts
°¬±otwsss µ#°¬±pt离心 x °¬±o取上清进行 ≥⁄≥2°„Š∞电泳分析 o方法见文献萨姆布鲁克等kt||ul ∀
115 生物活性测定
试虫 }棉铃虫k Ηελιχοϖερπα αρµιγεραl初孵幼虫 ∀方法 }参见文献郭予元kt||{l ∀
u 结果与分析
2 .1 …·菌株 χρψ基因型鉴定
采用已建立的 °≤•2• ƒ°方法 o对 zu株 …·菌株进行了杀虫晶体蛋白 χρψ基因型鉴定 o结果列入表
t o其中只列入了 wt株有蛋白表达和杀虫基因菌株的鉴定结果 ∀结果表明 o同时含有 χρψt oχρψu oχρψtŒ v
类基因的有 ut株菌 o共同含有 χρψt oχρψu类基因的 y株 o含有 χρψt和 χρψtΙ的 w株 o只含有 χρψt基因的 t
株 oχρψu类基因的 w株 ovy株菌不含所鉴定的 ts类 χρψ基因 ~zu株菌中均不含 χρψv !χρψw !χρψx !χρψ{ !
χρψ| !χρψts !χρψtt基因 ~图 t为部分菌株的 χρψt类基因鉴定的 °≤•2• ƒ°图谱 ∀
2 .2 杀虫晶体蛋白 Σ∆Σ2ΠΑΓΕ分析
通过 ≥⁄≥2°„Š∞方法 o测定了 zu株菌所表达的 Œ≤°¶分子量 o结果见表 t o有 u{株菌表达约 tvs ®⁄¤
的蛋白 ~vu株菌表达约 ys ®⁄¤的蛋白 ~有 v株菌表达约 |s ®⁄¤的蛋白kuy !uz与 u|号菌株l o两株表达
tws ®⁄¤的蛋白kx与 t{号菌株l ∀图 u为部分菌株蛋白的 ≥⁄≥2°„Š∞图谱 ∀
苏云金芽孢杆菌 χρψt基因表达的杀虫晶体蛋白的分子量大部分在 tvs ∗ tws ®⁄¤之间 o而 χρψu蛋白
在 ys ®⁄¤左右 ∀通过对各个菌株的 ≥⁄≥2°„Š∞分析和基因鉴定结果比较发现 o蛋白的表达与相应基因
的存在有一定的对应关系 o表达 tvs ®⁄¤蛋白的菌株经鉴定都含有 χρψt基因 o而表达 ys ®⁄¤蛋白的菌株
绝大多数有 χρψu基因 o但也有个别菌株例外 o如 z号菌株虽表达了 ys ®⁄¤的蛋白 o而没有鉴定出含 χρψu
的基因 ∀而表达 tws ®⁄¤和 |s ®⁄¤蛋白的几株 …·o经鉴定它们均不含上述 ts种基因 o推测这些菌株可
能含有其它类型的 χρψ基因 ∀
2 .3 苏云金芽孢杆菌对棉铃虫毒杀活性测定
取 zu株 …·菌株培养液 ts °离心 o去上清 o用 tss °的无菌水悬浮 o以此浓度的悬液处理初孵棉
铃虫幼虫 o表 u为部分菌株的杀虫结果 ∀经调查发现同时表达 tvs ®⁄¤和 ys ®⁄¤蛋白的菌株对棉铃虫
具有较高毒力 o不仅表现在致死率方面 o在抑制棉铃虫生长方面表现也比较明显 o试虫生长缓慢 o个体
小 o部分菌株对棉铃虫体重的抑制率达到 |s h以上 ∀
vst 第 v期 李长友等 }我国不同森林立地带 …·分离株杀虫晶体蛋白及基因分析
表 1 Βτ菌株基因型鉴定与蛋白 Σ∆Σ2ΠΑΓΕ分析结果
Ταβ11 Αναλψσισ οφ χρψ γενεσ ανδ ΙΧΠσφροµ 72 Βαχιλλυστηυρινγιενσισισολατεσ
编号
‘²q
菌株
≥·µ¤¬±¶ χρψt χρψu χρψtŒ χρψv qw qx q{ q| qts qtt
表达蛋白
Œ≤°¶k®⁄¤l
t ≤«u χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
u ≤«w χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
v ≤«y χρψt„¥ p χρψtŒ¦ p tvs
w ≤«ts χρψt„¥ p χρψtŒ¦ p tvs
x …tt p p p p tws
y …tu χρψt„¥ p p p tvs
z …tw χρψt„¤oχρψt„¦ p χρψtŒ¤ p tvs oys
{ …tx χρψt„¦ χρψu„¤ p p tvs oys
| …ty χρψt„¤ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
ts …tz χρψt„¤ χρψu„¤oχρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
tt …ut χρψt„¥ p χρψtŒ¥o χρψtŒ¦ p tvs
tu ⁄u χρψt„¤ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
tv ⁄v χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤oχρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
tw ⁄x χρψt„¥oχρψt„¦ χρψu„¤oχρψu„¥ p p tvs oys
tx ⁄y χρψt„¥oχρψt„¦ χρψu„¤oχρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
ty { χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤oχρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
tz | χρψt„¥oχρψt„¦ χρψu„¤oχρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
t{ tt p p p p tws
t| tu χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
us ÷¬t χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤oχρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
ut ÷¬u χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
uu ÷¬y χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p tvs oys
uv ÷¬{ χρψt„¦ χρψu„¥ p p ys
uw ÷¬ts χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¥ χρψtŒ¤ p ys
ux ÷¬tt p χρψu„¤ p p ys
uy ⁄¤t p p p p |s
uz ⁄¤u p p p p |s
u{ ⁄¤¬u p χρψu„¤ p p ys
u| ⁄¤¬v p p p p |s
vs ⁄¤¬w χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ p p tvs oys
vt ‹∏t χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ p p tvs oys
vu ‹∏u χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤ p tvs oys
vv ±¬t χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤ p tvs oys
vw ±¬u χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤ p tvs oys
vx ±¬v χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤ p tvs oys
vy ±¬w χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤ p tvs oys
vz • ∏v p χρψu„¤ p p ys
v{ • ∏w χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ p p ys
v| • ∏y χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤oχρψtŒ¥ p ys
ws 卧龙 w p χρψu„¤ p p ys
wt 卧龙 x χρψt„¤oχρψt„¦ χρψu„¤ χρψtŒ¤oχρψtŒ¥ p tvs oys
wst 林 业 科 学 v{卷
图 t 部分菌株 χρψt基因 °≤•2• ƒ°鉴定图谱
ƒ¬ª1t °≤•2• ƒ° ²©…·¶·µ¤¬±¶∏¶¬±ª³µ¬°¨ µχρψt·¼³¨ ª¨ ±¨
 }⁄‘„分子量标准 ³˜≤ °¬¬ °¤µ®¨µ~
t ∗ uw }菌株编号 ‘∏°¥¨µ²© …·¶·µ¤¬±¶q

图 u 部分菌株杀虫晶体蛋白 ≥⁄≥2°„Š∞电泳分析
ƒ¬ª1u ≥⁄≥2°„Š∞ ¤±¤¯¼¶¬¶²©…·¶·µ¤¬±¶
 }蛋白分子量标准 °µ²·¨¬± ¤µ®¨µ~
uz ∗ v| }菌株编号 ‘∏°¥¨µ²© …·¶·µ¤¬±¶q

表 2 部分 Βτ菌株对初孵棉铃虫幼虫的杀虫结果
Ταβ12 Βιοασσαψ οφσοµεισολατεσ οφ Βτ το Ηελιχοϖερπα αρµιγεραλαρϖαε
菌株号
≥·µ¤¬±¶
校正死亡率
≤²µµ¨¦·¨§ °²µ·¤¯¬·¼k h l
χρψ基因
χρψ ª¨ ±¨
表达蛋白
Œ≤°¶k®⁄¤l
z xs qs χρψt„¤oχρψt„¦oχρψtŒ¤ tvs oys
{ xs qs χρψt„¦oχρψu„¤ tvs oys
tt tu qx χρψt„¥oχρψtŒ¥o χρψtŒ¦ tvs
uv vz qx χρψt„¦oχρψu„¥ ys
u{ us q{ χρψu„¤ ys
vw wx q{ χρψt„¤oχρψt„¦oχρψu„¤oχρψtŒ¤ tvs oys
vx wx q{ χρψt„¤oχρψt„¦oχρψu„¤oχρψtŒ¤ tvs oys
v 讨论
综合基因鉴定和蛋白分析结果表明 o除少数菌株外 o绝大多数 …·菌株中杀虫晶体蛋白的表达与相
应基因的存在有着对应的关系 o但同时也存在个别的现象k如 uv和 uw号菌株鉴定含 χρψt基因 o但未发
现 tvs ®⁄¤蛋白的表达l o原因可能是菌株中有基因存在 o但这些基因可能不表达 ~或者蛋白表达存在时
间上的差异 o虽有基因存在 o如果在某一特定时间取样就有可能检测不到相应蛋白的表达 ∀ χρψu类蛋白
实际的分子量为 zs ®⁄¤o由于细胞产生蛋白水解酶 o杀虫晶体蛋白在制样过程中往往产生不同程度的酶
解 o因此 ≥⁄≥2°„Š∞检测的 χρψu要略小于实际分子量 o在 ys ®⁄¤左右 ∀
通过生物测定发现共同含有 χρψt„¤!χρψt„¦和 χρψu„的菌株对棉铃虫的毒力较高 o而含单一基因的
菌株毒力较低 ∀不含 χρψt和 χρψu基因的菌株对棉铃虫的毒力都较低或没有毒力 ∀
基因鉴定结果显示有 ux株菌中含 χρψtŒ基因 o该基因编码的晶体蛋白分子量大约是 {t ®⁄¤o然而
≥⁄≥2°„Š∞分析没有发现相应大小的蛋白带 o有报道称该基因通常是沉默的 o在菌株中不表达kŠ¯ ¤¨√¨ ετ
αλqot||vl o因此在本研究中检测不到该基因的表达产物与这种报道相符 ∀
从本文对 zu株 …·菌的 χρψ基因鉴定 !蛋白表达以及杀虫的结果分析 o可以将 ≥⁄≥2°„Š∞与 °≤•2
• ƒ°结合起来 o既能检测鉴定基因种类 o又能确定基因的表达与沉默 o同时可以预测菌株的杀虫活性 o
这种快速 !准确 !简便的研究方法 o将极大地推动我国 …·菌株资源的开发和利用 ∀
参 考 文 献
郭予元 q棉铃虫的研究 q北京 }中国农业出版社 ot||{
宋福平 o张 杰 o戴莲韵等 q苏云金杆菌 χρψ基因 °≤•2• ƒ°鉴定体系的建立 q中国农业科学 ot||{ ovt }tv ∗ t{
萨姆布鲁克 o弗里奇 ∞ ƒ o曼尼阿蒂斯 × q分子克隆实验指南k第二版l q金冬雁 o黎孟枫等k译l q北京 }科学出版社 ot||u
Š¯ ¤¨√¨ „ ° ετ αλq≥¦µ¨ ±¨¬±ª¥¼ ³²¯¼° µ¨¤¶¨ ¦«¤¬± µ¨¤¦·¬²± ²© Βαχιλλυστηυρινγιενσισ ¶¨µ²·¼³¨¶©²µ·«¨ ³µ¨¶¨±¦¨ ²© χρψ∂2¯¬®¨ ¬±¶¨¦·¬¦¬§¤¯ ³µ²·¨¬± ª¨ ±¨ ¶¤±§
¦«¤µ¤¦·¨µ¬½¤·¬²± ²©¤ χρψ∂ ª¨ ±¨ ¦¯²±¨ §©µ²° Β q τηυρινγιενσισ¶∏¥¶³q κυρστακι q „³³¯ ∞±√¬µ²± ¬¦µ²¥¬²¯ ot||v ox| }ty{v ∗ ty{z
Ž∏² ¤±§≤«¤®qŒ§¨±·¬©¬¦¤·¬²±²©±²√¨¯ χρψ2·¼³¨ ª¨ ±¨ ¶©µ²° Βαχιλλυστηυρινγιενσισ¶·µ¤¬±¶²±·«¨ ¥¤¶¬¶²©µ¨¶·µ¬¦·¬²±©µ¤ª°¨ ±·¯ ±¨ª·«³²¯¼°²µ³«¬¶° ²©·«¨ °≤•2
¤°³¯¬©¬¨§⁄‘„ q„³³¯ ∞±√¬µ²± ¬¦µ²¥¬²¯ ot||y oyu }{s ∗ {y
xst 第 v期 李长友等 }我国不同森林立地带 …·分离株杀虫晶体蛋白及基因分析