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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
精子发生过程一直是研究细胞分化和细胞周期
调控的重要模型之一。这个过程是由位于动物睾丸
生精小管基膜上的精原干细胞（Spermatogonial stem
cells，SSCs）逐级分化，经历了由初级精母细胞、
次级精母细胞、圆形精子细胞、进而经过变态分化
形成长形精子细胞的独特过程，最终形成具有与卵
子结合能力的遗传信息载体——精子［1］。分化过
程中的每一特定阶段都会有细胞特异性基因的转录
表达形成发育阶段特异性的结构，这是生精细胞自
身调控和发挥细胞特定功能的基础。加之外部因素
（激素和睾丸微环境等）的调控，生精细胞才能在
特定的时间和空间内按照上述过程完成分化。圆形
精子阶段是精子变态过程的开始。近年来的研究结
收稿日期 ： 2013-04-27
基金项目 ：全国大学生创新创业训练计划（111012611），高等学校博士学科点博导类基金项目（20101501110001）
作者简介 ：卜祥龙，男，研究方向 ：动物生殖与分子生物学，E-mail ：bxlong23@163.com ；胡甜园同为本文第一作者
通讯作者 ：吴应积，男，教授，博士生导师，研究方向 ：精原干细胞、精子发生过程及药物乳腺生物反应器 ；E-mail ：yingji_wu@yahoo.com
绒山羊 rsb66 基因 cDNA 全编码区的克隆及序列分析
卜祥龙1  胡甜园2  罗奋华2  王珂1  吴应积2
（1. 内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010021 ；2. 内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室，呼和浩特 010021）
摘 要 ： 圆形精子细胞是雄性动物精子发生过程中主要的细胞之一。rsb66 蛋白在生精细胞的细胞周期调控过程中发挥重要
的作用。rsb66 特异性地表达于圆形精子细胞中，但绒山羊 rsb66 基因全序列仍未见报道。为了更好地研究绒山羊圆形精子细胞的特性，
根据已报道的其他物种 rsb66 基因的 cDNA 保守区设计引物，从成年绒山羊睾丸中提取总 RNA，采用 RT-PCR 和分子克隆方法，克隆
得到绒山羊 rsb66 基因 cDNA 全编码区。测序结果与牛相应核苷酸序列的同源性为 97.0%，说明 rsb66 基因在进化上是高度保守的。
关键词 ： 绒山羊 圆形精子细胞 rsb66 基因 克隆 序列分析
Cloning and Sequence Analysis of cDNA of Cashmere Goat rsb66 Gene
Bu Xianglong1 Hu Tianyuan2 Luo Fenhua2 Wang Ke1 Wu Yingji2
（1. College of Life Science，Inner Mongolia University, Hohhot 010021 ；2. Key Laboratory of the Chinese Ministry of Education for Mammalian
Reproductive Biology and Biotechnology，Inner Mongolia University，Hohhot 010021）
Abstract:  Spermatids are essential cells in testes of male animals during spermatogenesis. The rsb66 gene has been reported expressing
in spermatids specifically. However, the DNA sequence of rsb66 gene in Cashmere goat have not been reported. In this study, we designed
primers according to the reported rsb66 gene cDNA sequences from other species in the GenBank. The coding sequence was amplified by RT-
PCR. The PCR fragment was inserted into the T-A cloning vector pMD19-T. The sequencing result showed that the coding sequence of Cashmere
goat rsb66 gene possesses 97.0% homology compared with that of bos Taurus. Such highly homology between Cashmere goat and Bos taurus
suggests that this gene is conserved in the evolution.
Key words:  Cashmere goat Spermatids rsb66 gene Cloning Sequence analysis
果显示有多种重要的细胞周期调控蛋白如 Cdc25A、
Cdc25C 和 CDK1 等高水平地表达于圆形精子细胞发
育阶段［2-5］。最初形成的圆形精子细胞不再进行分裂，
经过复杂的过程才分化为长形精子，这个过程包括
组蛋白被过渡蛋白和鱼精蛋白代替、核的浓缩和顶
体、鞭毛的形成等［6-8］，因而圆形精子阶段是精子
发生过程中极其重要的一环。但是由于圆形精子细
胞缺少相应标记分子，研究者只能通过形态凭借经
验来辨认，这使圆形精子细胞的行为和性质难以被
准确地鉴定追踪和分析，也限制了精子细胞的发生
机理的研究。
rsb66 蛋白在生精细胞的细胞周期调控过程中
发挥重要的作用。报道证明在大鼠圆形精子细胞中
2013年第9期 95卜祥龙等 ：绒山羊 rsb66 基因 cDNA 全编码区的克隆及序列分析
特异性表达 rsb66 基因，过量表达外源性 rsb66 导致
细胞周期出现明显的 G2/M 延迟的现象［9］。已有文
献报道，HSD45 能与 cyclin A1 发生相互作用并抑制
cyclin A1/CDK2 复合物的激酶活性［10］。RSB66 可以
与 HSD45 相互作用［11］，进而通过对 CDK 活性的调
控影响细胞周期的进程。目前绒山羊 rsb66 的研究还
未见报道。为了开展绒山羊圆形精子细胞鉴定的研
究，我们首先需要进行 rsb66 基因的克隆，这对于了
解 rsb66 蛋白生理生化功能，进一步认识精子细胞
的发生机理有重要的意义，并且为相关疾病的基因
诊治以及男性不育的治疗提供了重要的理论依据。
为了进一步研究绒山羊圆形精子细胞的细胞
特性，本研究通过 RT-PCR 和分子克隆技术克隆绒
山羊 rsb66 基因的 cDNA 编码区，旨在为制备绵羊
rsb66 的抗体，以及绒山羊圆形精子细胞的分子水平
鉴定奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
pMD19-T 质粒载体、T4 DNA 连接酶、限制性
内 切 酶、M-MLV 反 转 录 酶、ExTaq DNA 聚 合 酶、
oligo（dT）等均购自 TaKaRa 公司，质粒提取试剂盒、
DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生物技术有限
公司（北京）、总 RNA 提取试剂盒购自 QIAGEN 公
司。PCR 引物合成及测序由上海生工生物工程技术
服务有限公司完成。DNA Marker 购自南京博尔迪生
物科技有限公司，DH5α 感受态细胞为本实验室保
存，其他化学试剂为国产分析纯。
新鲜的成年绒山羊睾丸取自于内蒙古穆斯林屠
宰场，置于 -80oC 冰箱保存备用。
1.2 方法
1.2.1 绒 山 羊 睾 丸 组 织 总 RNA 的 提 取 采 用
QIAGEN 公司的总 RNA 提取试剂盒，按其说明提取
绒山羊睾丸组织总 RNA，利用紫外分光光度仪测定
RNA 浓度后，置于 -80℃冰箱保存备用。
1.2.2 RT-PCR 引物的设计及合成 根据 GenBank 已
知物种 rsb66 的基因序列，利用计算机软件 CLC Free
Workbench 4 进行基因序列的同源比对，得出 rsb66
cDNA 序列的保守区。根据该 cDNA 保守区和引物设
计原则以牛 Rsb66 的 cDNA 为模板设计 1 对 PCR 引
物 P1 ：CCCAGTGAGCAGGTAGAATG、P2 ：GTGGC-
GAAGATGGTGAGC，预计片段大小为 836 bp。
1.2.3 RT-PCR 扩 增 使 用 TaKaRa 公 司 M-MLV 反
转录酶并按照其使用说明书的操作程序进行反转录
反应合成 cDNA 第一链。以得到的 cDNA 第一链为
模板，利用已设计的引物进行 PCR 反应，体系为
10 μL，扩增条件为 ：94℃预变性 4 min ；94℃变性
40 s，57℃退火 40 s，72℃延伸 40 s，共进行 35 个
循环 ；72℃延伸 10 min。Mg2+ 浓度通过梯度测试法
优化。PCR 产物在 1% 的琼脂糖凝胶通过电泳分离，
在 0.01% 的溴化乙锭（ethidium bromide，EB）溶液
中染色，在紫外光激发下通过凝胶成像仪（Bio-Rad，
P91）拍摄图片。
1.2.4 cDNA 克隆载体的构建与鉴定 按照 Mg2+ 浓
度优化后的条件扩大 PCR 反应，然后利用胶回收试
剂盒回收目的片段 cDNA。测定浓度后，按照 T-A
克隆载体 pMD19-T 的使用方法将获得的 cDNA 目的
片段连接到 pMD19-T 克隆载体上，获得重组 DNA。
将重组 DNA 转化 E.coli DH5α 感受态细胞，在含有
X-gal、氨苄青霉素和 IPTG 的 LB 平板培养基中 37℃
培养 14 h 后进行蓝白斑筛选。选择白色菌落，用质
粒提取试剂盒提取质粒，PCR 法筛选阳性质粒，限
制性内切酶 BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切鉴定重组质粒。
将阳性菌株的菌液置于 -80℃保存。
1.2.5 测序与测序结果分析 将阳性菌株的菌液送
至上海生物工程公司进行测序，得到绒山羊 rsb66 基
因 cDNA 全编码区序列。通过 CLC Sequence Viewer
6 软件推导目的基因蛋白质的氨基酸序列，并使用
DNAStar 分析软件 MegAlign ClustelW 对绒山羊和其
他哺乳动物进行 cDNA 核苷酸序列的同源性比对并
构建 cDNA 生物进化树。
2 结果
2.1 绒山羊rsb66基因cDNA克隆及重组质粒的筛选
和鉴定
以绒山羊总 RNA 为模板，经 RT-PCR 反应，得
到一个约 836 bp 的片段，与预期的片段大小相符
（图 1）。胶回收 RT-PCR 反应扩增产物，回收产物
与 pMD19-T 载体（2 962 bp）连接，连接产物转化
获得阳性克隆，提取质粒 DNA 用 PCR 法筛选重组
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期96
质粒（图 2），得到一个约 836 bp 的片段。此片段经
限制性内切酶 BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切鉴定（图 3），
结果与预期相吻合，表明重组载体构建成功，命名
为 pMD19-T-rsb66。重组质粒经 DNA 序列测定结果
（图 4）表明，扩增出的 cDNA 片段长 836 bp，经过
BLAST 序列比对，证明确实是绒山羊 rsb66 基因的
cDNA 序列。
2.2 绒山羊rs66基因cDNA核苷酸序列分析及同源
性比较
克隆得到的绒山羊 rsb66 基因 cDNA 全编码区
序列全长为 836 bp，其中 ORF 长度为 672 bp，编码
223 个氨基酸（图 4）。对绒山羊 rsb66 和其他哺乳动
物的 rsb66 进行 cDNA 核苷酸序列的同源性比对（表
1），绒山羊与牛（NM_001101193.2）的同源性最高，
为 97.0%。另外，使用 MegAlign 软件对绒山羊 rsb66
和其它动物的 rsb66 进行核苷酸序列的生物进化树分
析，结果见图 5 。
表 1 绒山羊与其他已公布物种 rsb66 编码区核苷酸序列的
同源性比较
物种 同源性（%）
牛 Bos taurus（NM_001101193.2） 97.0
人 Homo sapiens（NM_018956.3） 83.1
大鼠 Rattus norvegicus（NM_181694.2） 81.5
小鼠 Mus musculus（AK155408.1） 80.9
2000
bp
M 1
bp
1000
750
836
500
250
100
M ：DL-2000 DNA Marker ；1 ：rsb66 RT-PCR 产物片段
图 1 rsb66 基因 RT-PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳
2000
bp
M 1 2 3 4 5
bp
1000
750
836
500
250
100
M ：DL-2000 DNA Marker ；1-4 ：pMD-19-T-rsb66 PCR 产物片段 ；5 ：阴性对照
图 2 pMD19-T-rsb66 PCR 鉴定
M ：DL3000 DNA 分子量标准 ；1 ：pMD19T 载体 ；2 ：pMD19T-rsb66 的 Hind
III 酶切产物 ；3 ：pMD19T-rsb66 的 Bam H I 酶切产物 ；4 ：pMD19T-rsb66 的
Hind III+Bam H I 双酶切产物
图 3 pMD19-T-rsb66 的 BamH I 和 Hind Ⅲ双酶切鉴定
3000
2000
bp
M 1 2 3 4
bp
1000
1500
750
836
500
250
100
Mus musculus
Rattus norvegicus
Homo sapiens
Bos taurus
Cashmere goat
97%
94%
82%
80%
图 5 绒山羊 rsb66 核苷酸序列生物进化树分析
3 讨论
圆形精子细胞是精子发生过程中极其重要的一
个阶段，同时也是生殖生物学、医学和畜牧业生产
应用上有重要意义的一种细胞。通过体外共培养得
到的小鼠圆形精子细胞也已经应用于生殖工程，即
通过圆形精子细胞胞浆内注射法（intracytoplasmic
injection of round spermatid，ROSI），产生受精胚胎，
再移植到假孕的母体子宫，产生子代动物［12，13］。可
见对于圆形精子细胞的研究不仅是对精子发生机理
的一种补充，更是对生殖疾病治疗的新方法应用奠
定了基础。
目前研究者只能通过形态学辨认圆形精子细胞，
这使得研究者很难准确地追踪细胞分布和行为特征，
精子发生过程中对圆形精子的研究也受到阻碍。为
了得到更有说服力的结果和更明确的提示，特异性
分子或标记物作参照是圆形精子细胞研究最好的选
择。Rsb66 是大鼠圆形精子细胞的特异产物［9］，在
2013年第9期 97卜祥龙等 ：绒山羊 rsb66 基因 cDNA 全编码区的克隆及序列分析
绒山羊圆形精子细胞中特异表达的基因仍未见报道，
根据大鼠的研究结果，使我们有理由假设 rsb66 也
是圆形精子细胞的标记蛋白。但目前还没有绒山羊
rsb66 基因编码序列的报道，不能进行 RT-PCR 鉴定
圆形精子细胞的试验研究。本研究成功克隆了 rsb66
基因的 cDNA 全编码区，获得了绒山羊 rsb66 基因
的 cDNA 全编码序列。同时，通过 DNAStar 分析软
件 MegAlign ClustelW（Slow/Ac-curate）对绒山羊和
其他哺乳动物的 rsb66 进行 cDNA 碱基序列的同源性
比较发现，绒山羊 rsb66 基因的 ORF 与牛的大小一
致，编码区序列与牛的核苷酸同源性为 97.0%，进
一步的分析发现该基因的部分编码区与其他物种具
有较高的同源性，与人、大鼠和小鼠分别为 83.1%、
81.5% 和 80.9%。说明 rsb66 基因在进化上具有高度
保守性。
4 结论
获得了绒山羊 rsb66 基因 cDNA 全编码区，以
及其与其他物种 cDNA 的同源性比对，将为绒山羊
rsb66 基因的转录表达鉴定提供了试验依据。
参 考 文 献
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121
61
1
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
180
120
60
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
836
ATG ：起始密码子 ；* ：终止密码子
图 4 绒山羊 rsb66 cDNA 的核苷酸序列及 223 个氨基酸序列
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期98
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（责任编辑 李楠）