全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第4期
创伤愈合迟缓是临床上常见的难题，包括烧烫
伤、静脉炎溃疡、糖尿病等。人酸性成纤维细胞生
长因子（human acidic fibroblast growth factor，haFGF）
编码蛋白由 154 个氨基酸残基组成，可以促进伤口
愈合 ［1］。但愈合迟缓的伤口常常伴发细菌感染，阻
碍伤口愈合，使用传统抗生素易导致耐药性问题［2］。
LL-37 是人体 Cathelcidin 家族的唯一成员，广谱抗菌，
不易耐药［3，4］，可有效防御多种病原微生物，抗皮
肤感染［5］。基因融合技术是设计获取多功能新蛋白
收稿日期 ：2012-10-28
基金项目 ：广州市科技支撑计划项目（2010J-E411 ), 广东省教育厅育苗计划（ LYM11082）
作者简介 ：沈娟，女，博士，讲师，研究方向 ：药用生物活性物质结构功能与应用 ；E-mail ：shenjuan0412@126.com
通讯作者 ：朱家勇，男，教授，博士生导师，研究方向 ：药用生物活性物质结构功能与应用 ；E-mail ：zhujy@gdpu.edu.cn
融合蛋白 LL-37-haFGF 的复性及纯化条件研究
沈娟1，2  金小宝2  丁静2  朱家勇2
（1. 广东药学院生命科学与生物制药学院，广州 510006 ；2. 广东药学院 广东省生物活性药物研究重点实验室，广州 510006）
摘 要 ： 首次设计开发一种促愈合，抗细菌感染的多肽分子——人源抗菌肽 LL-37 修饰 haFGF 的融合蛋白，旨在探讨此新
型融合蛋白 LL-37-haFGF 的复性及纯化条件。利用重组大肠杆菌表达 LL-37-haFGF 并鉴定，初步考察 8 种复性添加小分子对其包
涵体复性的作用，经分析表明，添加 0.3 mol/L 精氨酸可以大大提高 LL-37-haFGF 的复性效率。经镍亲和色谱及 CM 阳离子色谱纯
化获得纯品。本研究获得了 5.9 mg 纯度为 95.43% 的 LL-37-haFGF 目的蛋白，为研究其功能奠定了基础，也为类似的双功能多肽的
制备提供了参考依据。
关键词 ： LL-37 haFGF 重组融合蛋白 复性 纯化
Study of the Renaturation and Purification of
LL-37-haFGF Fusion Protein
Shen Juan1，2 Jin Xiaobao2 Ding Jing2 Zhu Jiayong2
（1. School of Life Science & Biopharmacology，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006 ；2. Guangdong Key Laboratory of
Pharmaceutical Bioactive Substances，Guangzhou 510006）
Abstract:  A new multifunctional healing peptide was designed and developed for the first time, human antimicrobial peptide LL-37
modified haFGF fusion proteins, which can promote healing and fight infection. This paper discussed renaturation conditions and purification
conditions of the new fusion protein named recombinant LL-37-haFGF was expressed by Escherichia coli and identified of effects on the refolding
of eight kinds of small molecules added to inclusion bodies were preliminary investigated. The result showed supplementation of 0.3 mol/L
arginine can greatly improve renaturation efficiency of LL-37-haFGF. The pure product of was obtained with nickel affinity chromatography and
CM cation chromatography. Through this study, we obtained 5.9 mg target protein of high purity 95.43%, laying the function for its functional
study, and also providing the reference for the preparation of similar multifunctional polypeptide.
Key words:  LL-37 haFGF Fusion protein Renaturation Purification
质的常用策略之一，本课题组首次设计开发一种既
能促进创伤愈合，又能控制细菌感染的多肽分子——
人源抗菌肽 LL-37 修饰 haFGF 的融合蛋白。LL-37-
haFGF 是一种新型的双功能融合蛋白，其制备分离
方法需要详细研究和摸索，需要通过表达、粗纯化、
精纯化获得高纯度的 LL-37-haFGF，同时必须尽量
在纯化步骤之间形成有效连接，获得满意的收率和
纯度。
前期研究中，我们将人抗菌肽 LL-37 与人成纤
2013年第4期 211沈娟等 ：融合蛋白 LL-37-haFGF 的复性及纯化条件研究
维生长因子编码基因进行了融合，并成功构建了重
组原核表达质粒 LL-37-haFGF/pET21b。在此基础上，
本研究将构建成功的融合基因的原核表达载体 LL-
37-haFGF/pET21b，转化大肠杆菌表达宿主菌 E. coli
BL21（DE3），进行诱导表达，通过对重组融合蛋
白 LL-37-haFGF 变复性和纯化方法的摸索，以期获
得高纯度的目标产物，并进一步对目的蛋白 LL-37-
haFGF 进行 Western blot、质谱鉴定，为其产业化开
发奠定基础，也为类似的双功能多肽的制备提供参
考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 大肠杆菌 E. coli BL21（DE3）由本实
验室保存。
1.1.2 主 要 试 剂 质 粒 小 提 试 剂 Gel extraction kit
盒 购 自 美 国 OMEGA 公 司 ；DNA 分 子 量 标 准 购
自 TaKaRa 公 司 ；低 分 子 量 蛋 白 预 染 Marker 购 自
Fermentas 生物公司 ；胰蛋白胨和酵母提取物购自英
国 Oxoid 公司 ；Imidazole（咪唑）、精氨酸、tween、
盐酸胍、SDS 购自 Sigma 公司 ；TEMED 购自北京鼎
国生物公司 ；BCA 法蛋白定量试剂盒购自北京百泰
克生物技术有限公司 ；山羊抗小鼠 IgG HRP 标记的
抗体、抗 His 单克隆抗体购自 Santa Cruz 公司 ；DAB
显色试剂盒购自武汉博士德公司 ；PVDF 膜购自美
国 Gene 公司 ；HisTrap Kit 及 CM-sepharose 阳离子树
脂购自德国 GE Healthcare 公司 ；其余常用试剂均为
国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 LL-37- haFGF 表达鉴定与包涵体制备 将含
有 LL-37-haFGF/pET21b 的 E.coil BL21（DE3）37℃，
振摇过夜，然后，按 1∶100 比例接种到 500 mL LB
液体培养基中，37℃，培养 2.5 h，加入异丙基 -β-
硫代半乳糖苷（IPTG）（终浓度 1.0 mmol/L）诱导 4 h，
15% SDS-PAGE 鉴定。
SDS-PAGE 电 泳 后， 通 过 半 干 电 转 仪 转 印 至
PVDF 膜上，恒压（25 V）转印 30 min，5% 脱脂牛
奶封闭液中 4℃封闭过夜，PBS-T 漂洗 3 次（每次
10 min）后放入用 TBST 按 1∶1 000 稀释的鼠源抗
6×His 一抗溶液中，4℃过夜，PBS-T 漂洗 3 次（每
次 10 min）后，与 HRP（辣根过氧化物酶）标记的
山羊抗小鼠 IgG 二抗（1∶2 500）室温温和振摇孵
育 1 h，于避光处将 PVDF 膜放入 DAB 显色液中显色。
离心发酵液收集菌体，以 1∶8（W∶V）的比
例将菌体悬浮于 20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），冰浴
中进行超声破菌，4℃ 14 000 r/min 离心 30 min，离
心收集包涵体。包涵体用洗涤液（20 mmol/L Tris-
HCl，2 mol/L 脲，pH8.0）充分洗涤。后将其溶于
变 性 缓 冲 液（20 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L GnHCl，
pH8.0）中，调整蛋白浓度为 20 mg/mL。
1.2.2 复性添加分子的初步考察 将包涵体变性蛋
白（20 mg/mL，20 mmol/L Tris-HCl，6 mol/L GnHCl，
2 mmol/L 巯 基 乙 醇，pH8.0） 按 1∶200 的 比 例 稀
释 到 10 mL 的 试 管 中， 复 性 缓 冲 液（20 mmol/L
Tris-HCl，pH8.0）中分别添加了 0.3 mol/L 精氨酸，
1 mol/L 盐 酸 胍，2 mol/L 脲，0.5 mol/L 蔗 糖，24
mmol/L β-环糊精，10% 甘油。于 4℃下复性 24 h 后
离心（12 000 r/min，4℃，10 min）。Bradford 法测定
上清的蛋白浓度以评价各种添加剂抑制复性蛋白聚
集沉淀的效果。
1.2.3 LL-37-haFGF 的 纯 化 方 法 考 察 pET-21b 表
达 LL-37-haFGF 蛋 白 带 有 6×His 标 签， 可 利 用
GE Healthcare 的 HisTrapTMHP 亲 和 层 析 进 行 预 纯
化。 将 2 个 1 mL HisTrapTMHP 柱 子 首 尾 相 接， 按
照 HisTrapTM HP 说明书操作，吸取上清过预平衡后
的亲和柱，洗去结合的非特异性蛋白，再分别用含
100、300、500 mmol /L 咪唑的磷酸盐缓冲液（PBS）
分段收集纯化流出液，取样进行 SDS-PAGE。
选取最佳抑制剂，将 LL-37-haFGF 变性初步纯
化产物按 1∶50 的比例加入到复性缓冲液中（即 20
mmol/L PBS buffer，0.3 mol/L Arg，2 mmol/L DTT，
pH8.0） 中 充 分 混 合， 于 4℃ 下 复 性 24 h， 用 20
mmol/L PBS buffer（pH8.0） 缓 慢 透 析 去 除 Arg 后，
上样至已用平衡液（20 mmol/L PBS buffer，pH8.0）
平 衡 CM FF 柱， 淋 洗 至 基 线 不 变 后， 以 10%-
100% 洗脱液（20 mmol/L PBS buffer，1 mol/L NaCl，
pH8.0）的梯度洗脱 20 个柱体积，流速为 1 mL/min，
收集洗脱峰做进一步分析。
1.2.4 MALDI-TOF 质谱测定分子量 将纯化得到的
LL-37-haFGF 置换到超纯水中，冻干浓缩。取 2 μL
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期212
样品与 2 μL 0.2% 的 TFA 以及 2 μL 的辅助基质 DHAP
（2，6 二羟基苯乙酮）混匀，然后取 1 μL 点于目标
板上，进行质谱分析。
2 结果
2.1 LL-37- haFGF的表达鉴定与包涵体制备
经 15%SDS-PAGE 电泳检测在大小约 23 kD 处
出现目的条带，而未诱导菌液中未出现目的条带（图
1-A）。Western blot 结果（图 1-B）显示诱导后的含
重组质粒表达菌株约在 23 kD 处有一条特异性条带，
证实 LL-37-haFGF 表达成功。细胞超声破碎上清和
沉淀分析结果表明，LL-37-haFGF 以包涵体形式存
在，纯度为 76.00% 左右（图 1-A，泳道 4）。采用低
浓度变性剂洗涤包涵体。除去部分包涵体表面的脂
类物质和菌体杂蛋白，且不会溶解结合致密的以包
涵体形式存在的目标蛋白。
作的步骤，所以选取 0.3 mol/L 精氨酸作为本次蛋白
复性的小分子添加剂。
130
M 1 M 12 3 4 5kD
100
70
55
40
35
25
15
kD
70
55
40
35
25
15
A B
（A）M ：蛋 白 分 子 量 标 准 ；1，2 ：E. coli BL21/pET-21b-LL-37-haFGF 诱 导
前后菌体总蛋白 ；3 ：超声离心上清 ；4 ：LL-37-haFGF 包涵体 ；5 ：LL-37-
haFGF 包涵体洗涤上清 ；（B）M ：蛋白分子量标准 ；1 ：E. coli BL21/pET-
21b-LL-37-haFGF 诱导后菌体总蛋白
图 1 目的蛋白 LL-37-haFGF 表达和 Western blot 鉴定
表 1 不同添加剂对 LL-37-haFGF 包涵体复性时蛋白
回收率的影响（n=6，x
-
±s）
2.2 复性添加分子的初步考察
首先考察了一些比较常用的复性添加剂对 LL-
37-haFGF 复性过程中不溶性聚集体形成的抑制作
用。 在 这 些 常 用 的 添 加 剂 中，0.3 mol/L 精 氨 酸，
0.2%Tween 以 及 1 mol/L 盐 酸 胍 均 能 有 效 抑 制 LL-
37-haFGF 复性时不溶性聚集体的形成。其中，0.3
mol/L 精氨酸可以获得 90.00% 以上的质量回收率。
甘油、环糊精、PEG400、2 mol/L 尿素均不能有效抑
制聚集沉淀，添加 PEG400 时，甚至比不加添加剂
时的收率更低（表 1，图 2）。由于复性过程中蛋白
沉淀的产生不仅影响了复性收率，还会增加下游操
分组 复性效率
对照 17.26±0.54
10% Glycerol 51.86±0.73
24 mmol/L CD 34.35±1.15
0.3 mol/L Arg 90.88±0.77
5% PEG400 15.19±0.52
0.2% Tween 81.47±0.85
2 mol/L urea 38.31±1.19
1 mol/L GdnHCl 65396±1.37
F 值 908.935
P 值 <0.001
2.3 目的蛋白LL-37-haFGF的纯化
由于 LL-37-haFGF 带有 6×His 标签，所以采用
HisTrapTMHP 预装柱对目的蛋白进行粗纯化，SDS-
PAGE 结果（图 3）表明绝大多数杂蛋白不能结合
Ni 亲和柱而穿透，含 100 mmol/L 咪唑的缓冲液可以
洗脱大量的目的蛋白，经过该步骤，目的蛋白纯度
可达 91.30%（图 4），蛋白收率为 80.00%。
经过稀释复性后，考虑到目标蛋白等电点 8.86，
较高，为碱性蛋白，而绝大部分大肠杆菌的菌体
蛋白都呈酸性，所以尝试采用阳离子交换介质 CM-
Sepharose 进行分离。纯化结果（图 5，图 6）表明，
CM-Sepharose 可以去除大部分剩余不多的菌体杂蛋
白，得到高纯度的目标产物。最终每升菌液可得
LL-37-haFGF 约 5.9 mg。
2.4 融合蛋白的鉴定
我们将纯化得到的 LL-37-haFGF 进行了 MALDI-
TOF 分析，测得分子量为 23 945.537 7（图 7），与
理论分子量 23 945.9 基本一致。
2.5 纯化
通过以上摸索，确立了 LL-37-haFGF 的纯化路
线，即 Ni 亲和层析粗纯后，复性，再采用阳离子交
换层析技术进行精纯（表 2）。
3 讨论
文 献 报 道，LL-37 和 haFGF 亲 本 多 肽 不 需 要
糖基化等翻译后修饰，且经分析融合蛋白 LL-37-
2013年第4期 213沈娟等 ：融合蛋白 LL-37-haFGF 的复性及纯化条件研究
haFGF 分子内不形成二硫键，结构较为简单，易于
进行变复性操作。同时，考虑到 LL-37-haFGF 具有
抗菌活性，因此本研究采用包涵体形式表达 LL-37-
haFGF，既可以消除了其固有杀菌活性对宿主细胞的
毒害［6］，也可以为后续的产物中杂质去除带来了便
捷［7］。结果表明，LL-37-haFGF 疏水性高，形成包
涵体而得以表达，占菌体总蛋白的 48.00%。
图 2 不同添加剂对 LL-37-haFGF 包涵体复性时蛋白
回收率的影响
图 3 融合蛋白 LL-37-haFGF 表达纯化图
图 4 目的蛋白 LL-37-haFGF Ni 亲和纯化
control
10% Glycerol
24 mmol/L CD
0.3 mol/L Arginine
5% PEG400
0.2% Tween
2 mol/L urea
1 mol/L GdnHCl
100
80
60
40
20
0
M
as
s r
ec
ov
er
y%

Additives
130.400
His Trap
130.400
97.800
65.200
32.600
0.000
0.00 32.30 64.60 96.90min
mv
图 5 融合蛋白 LL-37-haFGF 表达纯化图
M ：蛋白分子量标准 ；1 ：LL-37-haFGF Ni 亲和纯化后产物 ；2 ：CM FF 色谱
纯化穿透峰 ；3 ：LL-37-haFGF CM FF 色谱纯化后产物
图 6 目的蛋白 LL-37-haFGF CM 阳离子纯化
图 7 LL-37-haFGF 的 MALDI-TOF 质谱分析
150.000
120.000
90.000
60.000
30.000
0.000
0.00 45.70 91.40min
mv
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
4904.0
49
04
.0
12033.2 19092.4 20131.6
Massm/z 23190.9 40230.0
130
kD
M 1 2 3 4 5
100
70
55
40
35
25
15
M ：蛋 白 分 子 量 标 准 ；1，2 ：E. coli BL21/pET-21b-LL-37-haFGF 诱
导前后菌体总蛋白 ；3 ：包涵体 ；4 ：Ni 亲和纯化穿透峰 ；5 ：LL-37-
haFGF Ni 亲和纯化产物
130
kD
M 1 2 3
100
70
55
40
35
25
15
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第4期214
重组蛋白所形成的包涵体变性后，必须缓慢去
除变性剂，使目标蛋白得以复性，稀释复性是最简
单和最常用的传统复性方法。一般情况下，聚集体
的形成是导致复性收率降低的主要原因，因此，需
要在此过程中添加可以抑制变性蛋白间聚集作用的
小分子来辅助抑制聚集，促进复性。本试验通过包
涵体复性前后蛋白液的浓度来估算 LL-37-haFGF 的
复性率。分析表明 LL-37-haFGF 蛋白分子 N 端存在
强烈的疏水作用与静电引力，这使得其中间体在复
性时极易聚集，复性效率低下精氨酸在蛋白质复性
中得到了广泛的应用，成功地复性了人神经生长因
子［8］、单链免疫毒素［9］等多种重组蛋白。精氨酸胍
基可以降低蛋白之间的静电力（氢键和离子作用），
还可以影响蛋白分子间的疏水作用，即通过与蛋白
质疏水基团的相互作用，抑制蛋白质聚集［10］。由于
精氨酸的这些作用机制恰好消除了 LL-37-haFGF 中
间体之间的聚合作用，提高了复性效率。
重组蛋白质的分离纯化往往可以通过目的蛋白
捕捉纯化（粗纯化）和精细纯化实现。LL-37-haFGF
带有 His-tag 标签，且等电点高，所以我们选择 Ni+
离子亲和纯化和 CM-Sepharose 阳离子色谱纯化结合
来分离目的蛋白。Ni+ 离子亲和纯化用以在变性条件
下捕获融合蛋白，去除绝大部分杂质以利复性操作。
考虑到菌体杂蛋白多为酸性蛋白，在中性条件下带
有与 LL-37-haFGF 相反的电荷，同时脂类（主要为
磷脂）、核酸等杂质大多为电中性或者带负电荷，所
以选择 CM-Sepharose 阳离子色谱纯化用以在复性后
对融合蛋白精细纯化，去除剩余少部分杂质。
4 结论
本研究成功地进行了 LL-37-haFGF 的表达、复
性和纯化，SDS-PAGE 检测结果显示最终经检测重
表 2 LL-37-haFGF 的纯化收率表
sample Total protein（mg） Quality Recovery（%）
Ni affinity 43.2 80
Refolding 34.6 91
Dialysis 18.9 60
CM Sepharose 5.9 32
组蛋白纯度为 95.43%。每升发酵液可得融合蛋白约
5.9 mg 纯化产物。为该蛋白作为一种更有效的治疗
创伤愈合迟缓药品的研究与临床运用打下了良好的
基础。
参 考 文 献
［1］ Xie LY, Zhang ML, Dong BJ, et al. Improved refractory wound healing
with administration of acidic fibroblast growth factor in diabetic rats
［J］. Diabetes Research and Clinical Practice, 2011, 93（3）：396-
403.
［2］ Ravat F, Le-Floch R, Vinsonneau C. Antibiotics and the burn patient
［J］. Burns, 2011, 37（1）：16-26.
［3］ Overhage J, Campisano A, Bains M, et al. Human host defence
peptide LL-37 prevents bacterial biofilm formation ［J］. The Journal
of Immunology, 2011, 186（9）：5497-5505.
［4］ Sun CL, Zhang FZ, Li P, et al. LL-37 expression in the skin in syste-
mic lupus erythematosus ［J］. Lupus, 2011, 20（9）：904-911.
［5］ Ching YH, Sutton TL, Pierpont YN, et al. The use of growth factors
and other humoral agents to accelerate and enhance burn wound
healing ［J］. Eplasty, 2011, 11 ：e41.
［6］ Son YJ, Bae JY, Chong SH, et al. Expression, high cell density
culture and purification of recombinant EC-SOD in Escherichia
coli［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2010, 162（6）：1585-1598.
［7］ Eiberle MK, Jungbauer A. Technical refolding of proteins ：Do we
have freedom to operate?［J］. Biotechnol J, 2010, 5（6）：547-
559.
［8］ Tsumoto K, Umetsu M, Kumagai I, et al. Role of arginine in protein
refolding, solubilization, and purification［J］. Biotechnol Prog,
2004, 20（5）：1301-1308.
［9］ Arakawa T, Ejima D, Tsumoto K, et al. Suppression of protein
interactions by arginine ：a proposed mechanism of the arginine
effects［J］. Biophys Chem, 2007, 127（1-2）：1-8.
［10］ Das U, Hariprasad G, Ethayathulla AS, et al. Inhibition of protein
aggregation ：supramolecular assemblies of arginine hold the
key［J］. PLoS One, 2007, 2（11）：e1176.
（责任编辑 李楠）