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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
干扰素发现于 1957 年，后续的研究证实其具有
抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等生理功能，可由人或
动物的机体在受到病毒的侵扰下诱导产生，同时某
些细菌和化合物也能刺激机体的细胞合成干扰素［1］。
收稿日期 ：2014-03-31
基金项目 ：广东省重大科技专项（2011A080502011）
作者简介 ：张明杰，教授，研究方向 ：微生物工程技术 ；E-mail ：mingjiezh@126.com
人 LL-37 与干扰素 α2a 密码子的优化及其在
毕赤酵母中的融合表达
张明杰
（广东紫金正天药业有限公司，河源 517000）
摘 要 ： 通过密码子优化，在毕赤酵母中高效表达人 LL-37 与 IFN-α2a 融合蛋白。先按 P. pastoris 密码子偏好性对 LL-37
与 IFN-α2a 的原始密码子进行了改造，并在二者之间加上 GlyGlyGlyGlySer 的柔性连接接头，人工合成设计的新序列，最后通
过 pPIC9K 载体将其整合入 P. pastoris GS115 的基因组，构建出重组菌株 GS115LI。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的
GS115LI1 和 GS115LI2 菌株。对这两株菌经发酵诱导后的发酵液进行 SDS-PAGE 检测、抗病毒活性检测和抗菌活性检测，证明重
组株既能够成功表达出 LL-37 与 IFN-α2a 的融合蛋白，而且该融合蛋白成功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后，融
合蛋白的产量可达到 819.1 mg/L，经盐析、疏水层析和离子交换层析分离，可得到纯度达 97% 的融合蛋白产物，回收率可达到
46.2%，纯化后产品的效价可达 2.6×108 IU/mg。经过密码子优化后，成功实现在毕赤酵母中高效表达出既有 LL-37 抗菌活性又具
有干扰素 α2a 活性的融合蛋白。
关键词 ： 干扰素 α2a LL-37 融合 表达
The Codon Optimization and Fused Expression of LL-37 and IFN-α2a
in Pichia pastoris GS115
Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）
Abstract: To express the fussed protein of human LL-37 and IFN-α2a in Pichia pastoris with codon optimization. Recording to the codon
preference of P. pastoris, the codons of LL-37 and IFN-α2a were optimized. A flexible linker of GlyGlyGlyGlySer was placed between LL-37 and
IFN-α2a. The newly scheming DNA sequence was synthesized chemically. P. pastoris GS115LI was constructed by integrating the new gene into
GS115 with help of plasmid pPIC9K. With the scanning of geneticin concentration ladder, two strains, named as GS115LI1 and GS115LI2, were
gotten with high copy number. With SDS-PAGE detection, anti-virus activity detection and antimicrobial activity detection of broth, the results
proved GS115LI1 and GS115LI2 not only expressed the fused proteins, but also maintained the activities of LL-37 and IFN-α2a respectively.
After fermentation and induction of recombinant, the productivity of fusion protein was 819.1 mg/L. With salting out, hydrophobic chromatography
and ionic exchange chromatography, the purity of fusion protein was 97%, recovery rate was 46.2% and the potency of IFN was 2.6×108 IU/mg.
After codon optimization, the fused protein of human LL-37 and IFN-α2a was expressed effectively in P. pastroris with antimicrobial activity of
LL-37 and antifungus activity of IFN-α2a.
Key words: IFN-α2a LL-37 Fused protein Expression
按合成干扰素的细胞差异，通常将干扰素区分为 α、
β、γ 三型，其中 α 主要由白细胞合成，β 型主要由
成纤维细胞合成，γ 型主要由 T 细胞合成。每一型
又根据氨基酸组成上的差异进一步分为亚型，α 的
2014年第11期 207张明杰：人 LL-37 与干扰素 α2a 密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达
亚型最多，目前有 23 个［2］。根据干扰素作用方式
的不同，又可将干扰素分为 I、II 和 III 型，α 型与 β
型属于 I 型，均与一个独特的细胞表面受体结合发
挥抗病毒与肿瘤作用 ；γ 为 II 型，主要起调节免疫
作用；新发现的 λ 干扰素拥有与 I 型不同的结合受体，
归为 III 型［3，4］。α 干扰素稳定性非常高，能在 2.0-10.0
的 pH 范围内维持结构稳定，在 56℃条件下维持 30
min 活性不降低，抗病毒和肿瘤的谱系宽广，是目
前临床上最普遍使用的抗病毒和抗肿瘤药物［5，6］。
目前，干扰素均通过基因工程技术生产。α 干
扰素在生产和使用过程中存在的主要问题一是基因
工程菌产量低，生产成本高 ；二是 α 干扰素分子量
小，容易被肾小球滤过，临床应用时半衰期短，约
每 2 d 就需要重新用药一次［7，8］。对于产量低的问
题，目前主要通过优化表达系统和发酵工艺方面着
力。对于半衰期短的问题，目前常采取的方法包括
PEG 修饰以增加分子量，掩盖分子表面的抗原决定
簇和蛋白酶作用位点［9，10］；同人白蛋白或免疫球蛋
白 Fc 片段融合增加分子量，减少肾小球滤过［11， 12］；
在合适的位置引入糖基化掩蔽蛋白酶位点和增大分
子量［13］等。很多病毒均具有诱发肿瘤的能力，因
此同时具有抗病毒与抗肿瘤能力的 α 干扰素在此类
疾病的治疗方面作用重要。同时，多数肿瘤患者由
于其自身的免疫系统不同程度的受到破坏，因此，
还需特别预防细菌感染。基于临床需要同时抗真菌、
抗细菌和抗肿瘤的特点，将人 IFN-α2a 与 LL-37 经
过按毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，构建高产
工程菌，以期在此基础上生产出长效的三联干扰素。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α 与
毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115 由本试验保藏。
1.1.2 载体 pPIC9K 由本试验保藏 ；pMD18-T 由宝
生物工程（大连）有限公司生产。
1.1.3 培养基 LB 培养基 ；MD、MM、YPD 固体培
养基 ；BMGY 与 BMMY 液体培养基参考文献［4］。
1.1.4 主 要 试 剂 PCR 聚 合 酶（TaKaRa La Taq）、
限制性内切酶、T4 连接酶、质粒少量提取试剂盒、
DNA 纯化试剂盒、DNA 胶回收试剂盒等均购自宝生
物工程（大连）有限公司。其它试剂均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 人 LL-37 与 IFN-α2a DNA 序 列 的 密 码 子 优
化 在保证人 LL-37 与 IFN-α2a 氨基酸序列完整性
的前提下，按照 P. pastoris 对密码子的偏好性特点，
对他们的 DNA 序列进行优化［5］。
1.2.2 融合表达结构设计 选用 pPIC9K 质粒为表达
载体，表达结构如图 1 所示。
LinkerⲴDNA㔃ᶴѪGGTGGTGGTGGTTCCˈ㘫䈁ਾⲴ≘ส䞨ᒿࡇѪGlyGlyGlyGlySer
图 1 人 LL-37 与 IFN-α2a 表达的 DNA 序列结构设计
1.2.3 基因合成 经过密码子优化和结构设计所得
的序列，再在 5 端和 3 端分别加上 EcoR I 和 Not I
双酶切位点，交由上海生物工程公司全序列合成，
克隆至 pMD18-T 载体，构建质粒 pMD-18 Fall-IFN。
1.2.4 重组质粒构建 分别用 EcoR I 和 Not I 双酶切
pPIC9K 和 pMD-18 Fall-IFN 质粒，经凝胶电泳后切
胶分别回收约 9 300 bp 和 700 bp 的片段，用胶回收
试剂盒回收片段，并用 T4 ligase 连接，构建分泌型
重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN，用 CaCl 法转化大肠杆菌
DH5α［6］，利用 LB-Amp 平板筛选重组子。挑选阳性
转化子送上海生工进行测序，确定质粒的结构。
1.2.5 重组质粒转化毕赤酵母 用 Sac I 单酶切 pPI-
C9K-Fall-IFN 成线性重组质粒，通过电击转化法将
其转入 P. pastoris GS115 中构建重组菌 P. pastoris GS-
115LI。电击条件为 1 500 kV，200 Ω，25 μF。转化
液涂布于 MD 平板 30℃静止培养 3 d，挑选阳性克隆，
摇瓶后，用真菌基因组提取试剂盒提取基因组进行
PCR 鉴 定。 引 物 为 ：SenseP1 ：5-TTCGCCTTGTTG-
GGTGACTTCTTC-3，AntisP2 ：5-TCACTCCTTAGA-
TCTCAAAGACTC-3，退火温度为 58℃，以 GS115 基
因组及未加模板的体系为对照组。
1.2.6 重组菌表型鉴定及多拷贝筛选 通过甲醇利
用情况进行重组菌表型鉴定。将 PCR 鉴定的阳性转
化子编号，并将每菌株用灭菌牙签同时接种 MD 和
MM 平板，30℃静止培养 5 d，观察各菌株在两种平
板上的生长情况。
通过遗传霉素（G418）浓度梯度筛选多拷贝重
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期208
组株。首先制备遗传霉素质量浓度为 0.25、0.5、1.0、
2.0 和 3.0 mg/mL 的 YPD 平板，然后将前面筛选的表
型正常的重组菌株用灭菌牙签点在 5 个遗传霉素梯
度平板上，30℃静止培养 4 d，观察结果，能在高浓
度下生长良好的菌株为多拷贝菌株。
1.2.7 融合蛋白发酵与纯化 将筛选的重组菌株，
接 种 于 25 mL BMGY 培 养 液 中，30℃ 250 r/min 培
养约 16 h，至菌液 OD600≈5，4℃ 4 000 r/min 离心 5
min，收集菌体，用 25 mL BMMY 培养液重悬细胞，
诱导培养，每 24 h 按体积比为 0.5% 加入纯甲醇，
连续诱导 144 h 以上，4℃ 12 000 r/min 离心 5 min，
收集上清于 -20℃冻存待用。
上清液中融合蛋白先用 35% 饱和度（NH4）2SO4
盐析，12 000 r/min 离心收集盐析沉淀，再将沉淀
溶 于 0.8 mol/L（NH4）2SO4（pH8.3）， 上 样 Phenyl-
Sepharose FF 疏水柱，用 0.5 mol/L（NH4）2SO4 洗脱
后透析除盐，样品浓缩后再上样 DEAE Sephadex A-25
阴离子交换柱，采用 0.3 mol/L NaCl 洗脱，收集含目
的蛋白洗脱峰，浓缩后采用 Sephacyal-HR200 分子
筛脱盐，冷冻干燥得最终产品。
1.2.8 融合蛋白纯度检测 用 SDS-PAGE 法检测融
合蛋白纯度，检测参照文献［8］进行。以 TaKaRa
蛋白分子质量标准（低）为 Marker。以未经诱导的
发酵液为空白对照。
1.2.9 融合蛋白浓度检测 以牛血清白蛋白为标准，
按 Lowry 法测定融合蛋白浓度。
1.2.10 融合蛋白产物活性分析 培养液中 IFN-α2a
的活性分析参照《中国药典 2010 版》中《干扰素效
价测定（细胞病变抑制法）》。活性标准品购自广州
市药品检测所。以总 IFN-α2a 活性计算纯化过程中
的回收率。
培养液中 LL-37 的活性测定参照文献［17］。用
大肠杆菌 ATCC 25922 以及 ML 35p 作为检测菌种，
用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径 3
mm 的圆孔，每孔加 10 μL 发酵液，37℃孵化 3 h 后，
在底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养 20 h，
测量无菌生长的透明环直径。抗菌活性以下式计算：
抗菌活性单位（U）=（抗菌环直径 -3）×10。
2 结果
2.1 LL-37与IFN-α2a DNA序列的密码子优化
人 LL-37 DNA 序列按 P. pastoris 密码子偏好性
优化的结果见表 1。
经修改后，人 LL-37 DNA 全序列经 Primer pre-
mier 5.0 按标准密码表翻译后所得蛋白序列，与原
始序列经同样方法翻译后的蛋白序列，用 www.nlm.
ncbi.nih.gov 的 Protein Blast 比对完全一致，表明对人
LL-37 DNA 全序列按毕赤酵母的密码子偏好性改变
后，不影响其产物的结构组成。同时，序列 G+C 含
量由优化前的 49% 提高至优化后的 53%。G+C 含量
的升高将对基因转录和翻译的速度提高有利。
人 IFN-α2a DNA 序列按 P. pastoris 密码子偏好
性优化的结果见表 2。
表 1 LL-37 密码子优化结果
氨基酸代码 原始密码子 优化密码子 氨基酸代码 原始密码子 优化密码子 氨基酸代码 原始密码子 优化密码子
L CTG TTG G GGC GGT F TTT TTC
L CTG TTG K AAA AAG L TTG TTG
G GGT GGT E GAG GAG R CGG AGA
D GAT GAC F TTT TTC N AAT AAC
F TTC TTC K AAA AAG L CTT TTG
F TTC TTC R AGA AGA V GTA GTT
R CGG AGA I ATT ATC P CCC CCA
K AAA AAG V GTC GTC R AGG AGA
S TCT TCT Q CAG CAG T ACA ACC
K AAA AAG R AGA AGA E GAG GAG
E GAG GAG I ATC ATC S TCC TCC
K AAG AAG K AAG AAG
I ATT ATC D GAT GAC
带阴影部分为按毕赤酵母的密码子偏好修改后的密码子，下同
2014年第11期 209张明杰：人 LL-37 与干扰素 α2a 密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达
表 2 人 IFN-α2a DNA 密码子优化结果
氨基酸代码 原始密码子 优化密码子 氨基酸代码 原始密码子 优化密码子 氨基酸代码 原始密码子 优化密码子
M ATG ATG E GAG GAG G GGG GGT
A GCC GCC E GAG GAG V GTG GTT
L TTG TTG F TTT TTC T ACA ACC
T ACC ACC G GGC GGT E GAG GAG
F TTT TTC N AAC AAC T ACT ACC
A GCT GCT Q CAG CAG P CCC CCA
L TTA TTG F TTC TTC L CTG TTG
L CTG TTG Q CAA CAA M ATG ATG
V GTG GTT K AAG AAG K AAG AAG
A GCC GCC A GCT GCT E GAG GAG
L CTC TTG E GAA GAG D GAC GAC
L CTG TTG T ACC ACC S TCC TCC
V GTG GTT I ATC ATC I ATT ATC
L CTC TTG P CCT CCA L CTG TTG
S AGC TCT V GTC GTC A GCT GCT
C TGC TGC L CTC TTG V GTG GTT
K AAG AAG H CAT CAC R AGG AGA
S TCA TCT E GAG GAG K AAA AAG
S AGC TCT M ATG ATG Y TAC TAC
C TGC TGC I ATC ATC F TTC TTC
S TCT TCT Q CAG CAG Q CAA CAA
V GTG GTT Q CAG CAG R AGA AGA
G GGC GGT I ATC ATC I ATC ATC
C TGT TGT F TTC TTC T ACT ACC
D GAT GAC N AAT AAC L CTC TTG
L CTG TTG L CTC TTG Y TAT TAC
P CCT CCA F TTC TTC L CTG TTG
Q CAA CAA S AGC TCT K AAA AAG
T ACC ACC T ACA ACC E GAG GAG
H CAC CAC K AAG AAG K AAG AAG
S AGC TCT D GAC GAC K AAA AAG
L CTG TTG S TCA TCT Y TAC TAC
G GGT GGT S TCT TCT S AGC TCT
S AGC TCT A GCT GCT P CCT CCA
R AGG AGA A GCT GCT C TGT TGT
R AGG AGA W TGG TGG A GCC GCC
T ACC ACC D GAT GAC W TGG TGG
L TTG TTG E GAG GAG E GAG GAG
M ATG ATG T ACC ACC V GTT GTT
L CTC TTG L CTC TTG V GTC GTC
L CTG TTG L CTA TTG R AGA AGA
A GCA GCT D GAC GAC A GCA GCT
Q CAG CAG K AAA AAG E GAA GAG
M ATG ATG F TTC TTC I ATC ATC
R AGG AGA Y TAC TAC M ATG ATG
R AGA AGA T ACT ACC R AGA AGA
I ATC ATC E GAA GAG S TCT TCT
S TCT TCT L CTC TTG F TTT TTC
L CTT TTG Y TAC TAC S TCT TCT
F TTC TTC Q CAG CAG L TTG TTG
S TCC TCC Q CAG CAG S TCA TCT
C TGC TGC L CTG TTG T ACA ACC
L TTG TTG N AAT AAC N AAC AAC
K AAG AAG D GAC GAC L TTG TTG
D GAC GAC L CTG TTG Q CAA CAA
R AGA AGA E GAA GAG E GAA GAG
H CAT CAC A GCC GCC S AGT TCT
D GAC GAC C TGT TGT L TTA TTG
F TTT TTC V GTG GTT R AGA AGA
G GGA GGT I ATA ATC S AGT TCT
F TTT TTC Q CAG CAG K AAG AAG
P CCC CCA G GGG GGT E GAA GAG
Q CAG CAG V GTG GTT - TGA TGA
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期210
经修改后的 DNA 序列同前 LL-37 一样进行分析，
表明修改后蛋白结构未发生改变，但其中 G+C 含量
由 48.85% 下降至 47.26%，比原始含量降低了 1.59%。
该 G+C 含量的变动在可接受的范围，不会对后续的
转录和翻译速度产生明显的影响。
2.2 人LL-37与IFN-α2a融合重组质粒的构建
经过优化的人 LL-37 DNA 序列（3 端不带终止
密码子），通过 4 个甘氨酸和 1 个丝氨酸与 IFN-α2a
柔性联结。重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN 的构建过程见
图 2。
将构建的质粒 pPIC9K-Fall-IFN 转化入感受态 E.
coli DH5α，所挑选的阳性转化子经摇瓶提取质粒，用
EcoR I 和 Not I 双酶切鉴定得到大小约为 9 300 bp 和
690 bp 的两条片段，与预期的结构一致。同时将质
粒送样测序，得到的 DNA 序列与设计的结果一致。
2.4 筛选Mut+及多拷贝编码基因重组菌
P. pastoris GS115 为组氨酸缺陷型（His-），因此
不能在不含组氨酸的 MD 平板上生长。整合了含组
氨酸编码基因（His4）质粒 pPIC9K-Fall-IFN 的菌株
P. pastoris GS115LI，由于获得了组氨酸的合成能力，
因此可以在不含组氨酸的 MD 平板上正常生长，以
此证明重组菌株 P. pastoris GS115LI 可以正确地表达
质粒 pPIC9K-Fall-IFN 的转录单元。结果表明，前述
试验所筛选出来的阳性克隆 pPIC9K-Fall-IFN 均可以
在 MD 平板上正常生长，表明其都具有正确的表型
（Mut+）。
通常情况下，重组菌株中质粒 pPIC9K-Fall-IFN
的拷贝数越高，其表达目的产物的能力就越强，同
时对遗传霉素 G418 的抗性就越强。因此，通过遗
传霉素浓度梯度筛选出在高浓度下生长的菌株，即
表明其具有较高的拷贝数。本试验得到了在遗传霉
素为 3 mg/mL 浓度下能正常生长的重组菌二株，分
别命名为 GS115LI1 和 GS115LI2，以供后续试验。
2.5 表达产物Fall-IFN-α2a分子检测
经 过 诱 导 和 未 经 诱 导 的 GS115LI1 发 酵 液 的
SDS-PAGE 分 析（ 图 4） 显 示， 在 蛋 白 Marker 的
TT
His4
EcoR I Not I
Sac I
pPIC9K
pPIC9K-Fall-IFN
Ampr
Ampr
Kanr
EcoR I+Not I
SacI Fall-39+IFN-α2a
TT
His4
Not I
Fall-39+l
FN-α2a
EcoR I
pMD-18 Fall-IFN
Ampr
Kanr
5 A˃OX1
5 A˃OX1
图 2 重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN 构建过程
2.3 重组质料pPIC9K-Fall-IFN整合入毕赤酵母
GSP115
重组菌 P. pastoris GS115LI 与原始菌 P. pastoris
GS115 基因 PCR 结果（图 3）显示，重组酵母基因
组可扩增得到大小约为 690 bp 的条带，而空白的原
始菌株 GS115 却在相应位置未出现相应的条带，这
表明重组质粒 pPIC9K-Fall-IFN 成功整合进入了酵母
的基因组中，所获得的重组菌 P. pastoris GS115LI 与
预期结果一致。
1 2 3 4 5 6 7M
M ：200 bp DNA Marker ；1-4 ：P. pastoris GS115LI ；5-7 ：P. pastoris GS115
图 3 重组 P. pastoris GS115LI 与原始菌 P. pastoris GS115
基因 PCR 结果
14.3
20.1
29.0
44.3
66.4
97.2
kD
䈡ሬ ᵚ䈡ሬ Marker
图 4 经过诱导和未诱导的 GS115LI1 发酵液的 SDS-PAGE
2014年第11期 211张明杰：人 LL-37 与干扰素 α2a 密码子的优化及其在毕赤酵母中的融合表达
20.1-29 kD 之间，如图中箭头所示，诱导菌株具有
明显的条带，未诱导菌株在相应位置无条带。LL-37
与 IFN-α2a 融合蛋白的分子量约为 26 kD，与图中预
期的一致。因此，可以判断 GS115LI1 成功表达出了
所需的 LL-37 与 IFN-α2a 融合蛋白。
2.6 重组菌株GS115LI产物活性分析
融合蛋白的抗病毒活性与抗菌活性测定结果
（表 3）显示，重组菌 GS115LI1 与 GS115LI2 经诱导
后的发酵液中均能检出较高的抗病毒和抗菌活性，
这说明了融合蛋白保证了二者各自的活性功能。
表 3 LL-37 与 IFN-α2a 融合蛋白抗病毒与抗菌活性检测
菌株 干扰素活性（107 IU/mL） 抗菌活性（cm/mL）
GS115LI1 21.3±0.4 20.1±0.3
GS115LI2 22.2±0.5 22.8±0.5
GS115 未检出 未检出
2.7 融合蛋白纯化结果
融合蛋白的纯化结果（表 4）显示，在 LL-37
与 IFN-α2a 融合蛋白纯化过程中，总的回收率为
46.2%，其中疏水层析的损失最大，达到 20.2%，其
次为盐析损失 19.0%，阴离子交换层析损失 14.6%。
最终产品的纯度达到 97%，满足了医用产品的质量
标准。利用 Lowry 法检测分子筛脱盐后的溶液融合
蛋白总量（相当于牛血清白蛋白）为 378.4 mg，换
算成产品的 IFN-α2a 活性为 2.6×108 IU/mg，发酵液
中产物的产量为 819.1 mg/L。
3 讨论
LL-37 是由人上皮细胞产生的一种具有抗菌活
性的 37 肽，具有广谱抗菌特性［18］。IFN 是临床常
用的抗病毒药物，已经有将其与多种蛋白融合表达
以改进性能或增加功能的研究报道。例如，将其与
载脂蛋白融合表达，可以增加干扰素在特定组织中
的渗透性［19］；与人白蛋白融合表达以延长干扰素
的体内半衰期［20］；与特异抗体表达以制备成靶向
干扰素等［21］。到目前为止，未见有将干扰素与抗
菌肽融合表达的报道。将干扰素与具有抗病毒和抗
肿瘤活性的 IFN-α2a 融合表达，形成同时兼具抗菌、
抗病毒和抗肿瘤的三重功效，特别适用于一些肿瘤
患者的临床应用。LL-37 与 IFN-α2a 的原始 DNA 序
列的密码子组成是与人的表达系统相适应的，二者
在 P. pastoris 中表达时，容易出现密码子偏好性不
同而降低产物的表达翻译速度，难以获得高产。在
本试验中，首先按 P. pastoris 密码子偏好性对 LL-37
与 IFN-α2a 的原始密码子进行了改造，并在二者之
间加上 GlyGlyGlyGlySer 的柔性连接接头，然后将设
计的新序列通过人工合成，最后通过 pPIC9K 载体
将其整合入 P. pastoris GS115 的基因组，构建出重
组菌株 GS115LI。经过设计特异性引物进行 PCR 检
测，可以在 GS115LI 基因组中克隆出 700 bp 左右
的 DNA 片段，表明融合的基因成功整合入宿主的基
因组。利用遗传霉素浓度梯度筛选出两株高拷贝的
GS115LI1 和 GS115LI2。对这两株菌经发酵诱导后的
表 4 LL-37 与 IFN-α2a 融合蛋白纯化过程中的纯度与回收率
纯化步骤 融合蛋白总 IFN-α2a 活性（107 IU） 纯度（%） 回收率（%）
发酵液（100 mL） 2132.3 - 100
盐析产物 1727.2 84 81.0
Phenyl-Sepharose FF 疏水柱 1296.4 91 60.8
阴离子交换柱 985.1 97 46.2
发酵液进行 SDS-PAGE 检测、抗病毒活性检测和抗
菌活性检测，证明重组株既能够成功表达出 LL-37
与 IFN-α2a 的融合蛋白，而且该融合蛋白成功保留
了抗菌肽与干扰素的功能活性。
融合蛋白中的 LL-37 带有部分负电荷，与同
样带部分负电荷的 IFN-α2a 融合后，可以采用阴离
子交换层析对其进行纯化。产物经过盐析、疏水层
析和阴离子交换三步纯化后，纯度可达 97%，能
满足药典的纯度要求。该工艺的缺点是回收率只有
46.2%，这是非亲和层板纯化干扰素类产品的普遍通
病［22］。采用带亲和标签的方式进行表达，利用亲和
层析方式纯化，可以克服收率低的问题，但又会产
生成本高的缺陷［23］。低成本高回收率的干扰素类产
品纯化工艺还需要进一步研究。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期212
表达 LL-37 与 IFN-α2a 融合蛋白的工程菌的发
酵工艺也是影响产品产量的重要因素［24］。本试验
采用通用的方法对工程菌进行了诱导表达，获得了
819.1 mg/L 的产量，但还需要通过单因素试验和统
计学试验方法对各工艺参数进行优化。
表达出来的 LL-37 与 IFN-α2a 融合蛋白，同时
兼具抗菌、抗病毒和抗肿瘤的三重活性，特别适用
于一些危重的肿瘤患者，因此该产品具有广泛的市
场前景。
4 结论
通过密码子优化，构建出了在毕赤酵母人 L-37
与 IFN-α2a 融合蛋白重组菌株。经对重组菌发酵诱
导后的发酵液进行 SDS-PAGE 检测、抗病毒活性检
测和抗菌活性检测，证明重组株既能够成功表达出
LL-37 与 IFN-α2a 的融合蛋白，而且该融合蛋白成
功保留了抗菌肽与干扰素的功能活性。诱导发酵后，
融合蛋白的产量可达到 819.1 mg/L，经盐析、疏水
层析和离子交换层析分离，可得到纯度达 97% 的融
合蛋白产物，回收率可达到 46.2%，纯化后产品的
效价可达 2.6×108 IU/mg。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）