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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第11期
英国科学家 Isaacs 和 Lindenmann 于 1957 年发
现一种能干扰病毒感染的细胞因子，命名为干扰
素［1］。随着人类研究的深入，不断发现了许多新的
干扰素分子。目前，人类在哺乳动物中发现的干扰
素共有 10 个家族，其中人干扰素有 7 个家族。按其
功能和作用方式，可将人干扰素细分为 I 型、II 型
和 III 型。I 型包括 α、β、ε、τ、ω、κ，具有抗病毒
和抗肿瘤的功能 ；II 型包括 γ，具有调节免疫的功
能［2］；III 型为干扰素样蛋白，功能与 I 型类似，但
受体不同［3］。人 IFN-α2a 是由 165 个氨基酸残基构
成，具有防治病毒性疾病［4］和恶性肿瘤［5］的功能。
LL-37 是目前在人体内发现的抗菌肽 Cathelicedin 家
族中唯一的成员，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有
收稿日期 ：2014-03-18
基金项目 ：广东省重大科技专项（2011A080502011）
作者简介 ：张明杰，教授，研究方向 ：微生物工程技术 ；E-mail ：mingjiezh@126.com
重组酵母产人 IFN-α2a 与 LL-37 融合蛋白的工艺优化
张明杰
（广东紫金正天药业有限公司，河源 517000）
摘 要 ： 通过单因素试验探索重组酵母 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的最佳条件。结果显示，重
组酵母菌产蛋白酶的最佳表达条件是利用 BMMY 为诱导培养基，以接种量 OD600=5.5、温度 26℃、pH6.0、诱导剂（甲醇）为每隔
24 h 添加 1.0%、振荡速度为 200 r/min 条件下连续诱导 144 h。在最佳培养条件下，发酵液中的 LL-37 最高抗菌活性达 27.9 mm。与
初始的发酵条件相比，人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的产量提高了 32.29%。
关键词 ： 干扰素 α2a LL-37 工艺
The Process Optimization of Pichia pastoris GS115LI for Producing
Fused Protein of LL-37 and IFN-α2a
Zhang Mingjie
（Pharmaceutical Co.，Ltd. Guangdong Zijing Zhengtian，Heyuan 517000）
Abstract: With experiments of single factor, the optimal process of recombinant P. pastoris GS115LI for producing fused protein of LL-
37 and IFN-α2a were using BMMY as inducing medium, inoculum as OD600=5.5, temperature as 26℃, pH6.0, inducing chemical（methanol）
adding amount as 1.0% every 24 h, incubating shaking speed as 200 r/min, and inducing time as 144 h. Under those optimal conditions, the 27.9
mm of LL-37 antimicrobial activity could be gotten. Compared with the original conditions, the productivity of fused protein of LL-37 and IFN-
α2a was increased as 32.29%.
Key words: Interferon-α2a LL-37 Fermentation process
较广谱的抗性［6］。除此之外，LL-37 还具有免疫调
节作用，可趋化单核细胞、T 淋巴细胞、中性粒细
胞和肥大细胞等［7］。当人体受到病原微生物、炎症
或创伤刺激，LL-37 的表达水平就会上升［8］。动物
试验表明，LL-37 可明显降低铜绿假单胞菌感染小
鼠的死亡率［2］。
将人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合表达，形成同
时具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌的三重功效的新功能
蛋白，在一些特殊的临床治疗中存在潜在的市场需
求。本课题组前期的工作实现了在毕赤酵母（Pichia
pastoris）GS115 表达三功能的人 LL-37 基因与 IFN-
α2a 融合蛋白。在进入工业化生产之前，有必要建
立所构建的基因工程菌工艺条件，并对产品的应用
2014年第11期 215张明杰：重组酵母产人 IFN-α2a 与 LL-37 融合蛋白的工艺优化
性能进行验证。本研究通过单因素试验旨在探索重
组 酵 母 P. pastoris GS115LI 产 人 LL-37 基 因 与 IFN-
α2a 融合蛋白的最佳条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株 P. pastoris GS115LI，表达人 LL-37
基 因 与 IFN-α2a 融 合 蛋 白。 大 肠 杆 菌（Escherichia
coli）ATCC 25922，用于检测融合蛋白的抗菌活性。
1.1.2 培养基
1.1.2.1 YPD 培养基 酵母提取物 10 g/L，蛋白胨
20 g/L，葡萄糖 20 g/L，121℃灭菌 30 min。
1.1.2.2 BMGY 培养基 见参考文献［10］。
1.1.2.3 BMMY 培养基 同 BMGY 培养基，仅将其
中的甘油 10 mL 换为甲醇 5 mL。
1.1.2.4 初始培养基 种子培养 ：保藏的菌种先经
YPD 活化，后将入 BMGY 培养基，接种量 2%，后
振荡培养。培养条件 ：温度 28℃，转速 200 r/min，
培养时间 24 h。
诱导培养 ：种子培养液离心去培养液，后接种
入 BMMY 培养液，使酵母 OD600 值达 6.0，在温度
28℃与转速 150 r/min 下振荡培养，每 24 h 补充甲醇
0.5%（体积比）诱导表达［11］，重复诱导 5 次。
1.2 方法
1.2.1 单因素发酵试验
1.2.1.1 诱导时长对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37
基因与 IFN-α2a 融合蛋白的影响 按出发条件进行
诱导，诱导过程中每 12 h 取样分析发酵液抗菌活性，
直至检测的抗菌活性不再上升。
1.2.1.2 接种量对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基
因与 IFN-α2a 融合蛋白的影响 按前述确定的最佳
诱导时长，分别调节接种量以 OD600 计为 3.5、4.0、4.5、
5.0、5.5、6.0、6.5 和 7.0，其它条件不变。诱导完
成后取发酵液分析抗菌活性。
1.2.1.3 温度对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因
与 IFN-α2a 融合蛋白的影响 在出发条件的基础上，
按前述确定的最佳诱导时间与接种量，改变诱导温
度，分别置于 24℃、26℃、28℃、30℃和 32℃下振
荡培养。培养完后取样检测产物的抗菌活性。
1.2.1.4 溶氧对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因
与 IFN-α2a 融合蛋白的影响 通过改变摇床的转速
探索溶氧对重组 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因
与 IFN-α2a 融合蛋白的影响。分别选择摇床转速为
120、160、240 和 280 r/min 进行诱导培养，其它条
件参照前述选择的最佳条件。诱导结束后取发酵液
分析抗菌活性。
1.2.1.5 诱导剂（甲醇）添加量对 P. pastoris GS115-
LI 产人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的影响 通
过改变诱导剂甲醇的添加量分别对体积比为 0.6%、
0.8%、1.0%、1.2%、1.4% 和 1.6% 的菌株进行诱导
表达。其它诱导条件为前述所确定的最佳条件。诱
导结束后取发酵液分析抗菌活性。
1.2.1.6 pH 对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与
IFN-α2a 融合蛋白的影响 为了探索 pH 对 P. pastoris
GS115LI 产人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的影响，
分别选择 pH 为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和 8.0
进行试验。其它发酵条件为前述优化的最佳条件。
诱导结束后取发酵液分析抗菌活性。
1.2.2 验证试验 在上述确定的最适培养和诱导表
达条件下，重复试验 3 次，进行验证。
1.2.3 发酵液中人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白
的抗菌活性分析 培养液中 LL-37 的活性测定参照
文献［5］。用 E. coli ATCC 25922 作为检测菌种，用
双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径 3 mm
的圆孔，每孔加 10 μL 发酵液，37℃孵化 3 h 后，在
底层上覆盖一层营养琼脂，37℃继续培养 20 h，测
量无菌生长的透明圈直径。
2 结果
2.1 诱导时长的影响
诱导时长对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因
与 IFN-α2a 融合蛋白的影响结果（图 1）显示，诱导
开始后的前 24 h，发酵液中检测出的以抗菌活性表
示的融合蛋白产量上升较慢，这可能与菌体本身处
于环境适应期的延迟期有关 ；而后产量呈直线上升，
至第 132 h，此后产量缓慢上升，至 144 h 达到最大
值 25.3 mm ；此后 24 h 的诱导期内，融合蛋白产量
出现轻微下降，可能是由于宿主老化后，产品有所
降解引起。根据以上试验结果，确定 144 h 为最佳
诱导时长。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期216
2.2 接种量的影响
接 种 量 对 P. pastoris GS115LI 产 人 LL-37 基 因
与 IFN-α2a 融合蛋白的影响结果（图 2）显示，随
着接种量自 OD600=3.5 上升，在其它条件不变的情
况下，发酵液中以 LL-37 抗菌活性表示的人 LL-37
基因与 IFN-α2a 融合蛋白逐渐上升，至接种量达到
OD600=5.5 后，达到最大值约 26.0 mm ；之后，呈现
逐渐下降的趋势。这表明，当 OD600<5.5，发酵液中
的酵母浓度太少，导致表达能力低。在 OD600=5.5 时
达到饱和。之后再升高酵母浓度，可能由于营养或
溶氧供应受限，从而导致产物的合成能力不升反降。
在此，选择接种量为 OD600≈5.5 作 为 最 佳 的 接 种
条件。
于 26℃，产量会有所下降，可能与低温下酵母代谢
活性受影响有关。温度高于 26℃，产量也出现下降，
可能与在温度高时，酵母自身代谢加快后，衰老同
样加快的原因。综合上述情况，选择 26℃作为诱导
时的最佳温度条件。
25
15
10
5
0
0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 132 144 156 168ᰦ䰤hᣇ㧼⍫ᙗmm 20
图 1 诱导时长对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与
IFN-α2a 融合蛋白的影响
12
3.5 4.5 5.5 6.5 7.5᧕⿽䟿OD600 7.06.05.04.01518212427ᣇ㧼⍫ᙗmm
图 2 接种量对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与
IFN-α2a 融合蛋白的影响
2.3 温度的影响
温 度 对 P. pastoris GS115LI 产 人 LL-37 基 因 与
IFN-α2a 融合蛋白的影响结果（图 3）显示，在温度
为 26℃时，以抗菌活性表示的人 LL-37 基因与 IFN-
α2a 融合蛋白产量最高，可达 26.5 mm 以上。温度低
27
26
25
24
24 28 30 32⑙ᓖć26ᣇ㧼⍫ᙗmm
图 3 温度对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与 IFN-
α2a 融合蛋白的影响
2.4 溶氧的影响
在摇瓶阶段，溶氧难以直接测定，故只能采用
以摇床振荡转速为依据来进行探索。溶氧对 P. past-
oris GS115LI 产人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的
影响结果（图 4）显示，在振荡转速低于 200 r/min
时，由于溶氧处于受限状态，故以抗菌活性表示的
人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白产量较低。振荡
转速高于 200 r/min 后，产量不再继续上升，表明此
阶段溶氧已经到达饱和。综合考虑效应与成本，选
择 200 r/min 作为诱导表达时最佳的溶氧控制条件。
28
26
24
22
20
120 160 200 240 280ⓦ≗r/minᣇ㧼⍫ᙗmm
图 4 溶氧对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与 IFN-
α2a 融合蛋白的影响
2.5 诱导剂（甲醇）添加量的影响
诱导剂（甲醇）添加量对 P. pastoris GS115LI 产
2014年第11期 217张明杰：重组酵母产人 IFN-α2a 与 LL-37 融合蛋白的工艺优化
人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的影响结果（图 5）
显示，甲醇浓度添加量为 1.0%（以体积比计，下同）
时，以抗菌活性计的人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合
蛋白表达量达最大，约为 27 mm。低于 1.0%，可能
是由于诱导的强度不够，表达速度下降，致使产物
产量下降。高于 1.0%，可能是由于诱导强度太大，
超出了宿主菌的代谢负荷，反而产生负作用，从而
也使表达量下降。综合考虑选择 1.0% 为诱导的最佳
甲醇用量。
现产物的最佳表达，故确定 pH6.0 为最佳条件。
2.7 最佳工作条件验证
根据前面的试验结果，确定 P. pastoris GS115LI
产人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的最佳工艺条
件为利用 BMMY 培养基，接种量以 OD600 计为 5.5、
温 度 26℃、pH6.0、 诱 导 剂（ 甲 醇 ） 为 每 隔 24 h
添 加 1%、 振 荡 速 度 为 200 r/min 条 件 下 连 续 诱 导
144 h。在该工艺条件下重复验证 3 次，得到结果（以
LL-37 抗菌活性计）分别为 27.8、28.1 和 27.9 mm，
平 均 值 为 27.93±0.12（mm）。 该 结 果 与 出 发 培 养
条件下的表达量（21.1 mm，参考 1.2.1.1 诱导时间
120 h 时的结果）相比，产物产量提高了 32.39%。
3 讨论
LL-37 作为人源性抗菌肽，已经在临床上获得
广泛的应用。由于其分子小，与其它蛋白多肽或蛋
白类药物融合表达时，不易对与其融合蛋白的功能
产生影响，因此将 LL-37 与其它蛋白融合表达生产
多功能药物成为可能［13］。例如，将 LL-37 与人酸性
成纤维细胞生长因子融合表达形成的新蛋白，既具
有酸性成纤维细胞生长因子促进伤口愈合的功能，
又具有防止伤口感染的功能［14］。受此思路的启发，
将 LL-37 与人 IFN-α2a 融合表达，构建出了同时具
有抗癌、抗病毒和抗菌的三效药物。发酵工艺是将
构建的蛋白转化为产物的关键。
从单因素试验的各因素变化所引起的人 LL-37
基因与 IFN-α2a 融合蛋白表达水平的波动情况分析，
接种量、时间和 pH 是 3 个较为敏感的量，其它属
于次敏感量，这可能预示着这些因素对表达产量的
关键程度。接种量主要影响发酵时延迟期的长短和
菌体与营养之间的协调关系。接种量小，延迟期长，
产物合成量低 ；接种量大，菌体浓度高，会引起营
养竞争［15］。pH 不仅影响宿主菌对外源基因的表达，
同时也可能对产物的稳定性及活性产生影响［16］。适
宜的培养条件，有利于提高细胞的相对活性和延长
细胞的高相对活性状态，从而实现融合蛋白产量的
最大化累积［17，18］。各因素之间的影响还需要通过正
交试验或序贯试验设计，利用统计学的原理进行详
细分析。
试验中为了操作的方便，仅以 LL-37 的抗菌
27
26
25
24
23
0.6 0.8 1.21.0 1.4 1.6⭢䞷⎃ᓖ%ᣇ㧼⍫ᙗmm
图 5 甲醇添加量对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因
与 IFN-α2a 融合蛋白的影响
2.6 pH的影响
pH 对 P. pastoris GS115LI 产 人 LL-37 基 因 与
IFN-α2a 融合蛋白的影响结果（图 6）显示，试验条
件下，pH6.0 时人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的
表达量最高，达到 27.5 mm 以上。pH 主要通过影响
细胞膜及基质的带电状态，从而影响膜对基质的通
透性，再传递到对产物产量的影响。酵母的最适生
长 pH 为偏酸性的环境，此处产物最佳表达量所需
的 pH6.0，恰好可在不影响宿主本身生长条件下实
30
28
26
24
22
20
18
16
4.5 5.5 6.5 7.5
pH
8.58.07.06.05.0
ᣇ㧼⍫ᙗmm
图 6 pH 对 P. pastoris GS115LI 产人 LL-37 基因与 IFN-
α2a 融合蛋白的影响
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第11期218
活性进行表征。经过在菌种构建阶段的试验确认，
LL-37 的抗菌活性检测与 IFN-α2a 干扰素活性检测结
果是相一致的，表明二者既实现了融合，而且融合
蛋白还同时保留了二者各自独立时的活性（结果发
表在本课题组另一篇文章中）。
本试验所有数据均是建立在摇瓶的试验基础之
上的。众所周知，摇瓶并不能真正代替发酵罐的生产，
因此本试验的结果还只能是发酵生产的参考。在达
到生产水平之前，还需通过小型发酵罐进一步优化
工艺参数，再逐步放大至生产规模。
4 结论
本研究确定了重组毕赤酵母 P. pastoris GS115LI
产人 LL-37 基因与 IFN-α2a 融合蛋白的最佳工艺条
件为利用 BMMY 培养基、接种量以 OD600=5.5、温度
26℃、pH6.0、诱导剂（甲醇）为每隔 24 h 添加 1%、
振荡速度为 200 r/min 条件下连续诱导 144 h。与出
发条件相比，产量提高了 32.29%。
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（责任编辑 马鑫）