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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第9期
斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus），又名蟹味菇、
真姬菇，是重要的工厂化生产食用菌之一［1］。斑玉
蕈优良品种的选育尤为重要，杂交育种是斑玉蕈主
要的育种方法之一，其杂交育种的材料有单孢分离
的单核体和原生质体再生的单核体等。其中原生质
体单核体作为育种材料已受到食用菌育种学家的重
视，利用这一技术可以从菌丝体中直接得到单核体，
不受出菇和采收孢子的限制［2］。近年来，食用菌研
究者先后开展了原生质体单核体的分离及交配型的
研究。Wessles 等［3］在研究裂褶菌原生质体的制备
收稿日期 ：2014-02-12
基金项目 ：上海科委重点科技攻关项目（11391901003）
作者简介 ：潘越，女，硕士研究生，研究方向 ：食用菌遗传育种 ；E-mail ：skyside.Good@163.com
通讯作者 ：冯志勇，男，博士，研究员，研究方向 ：食用菌遗传育种 ；E-mail ：feng_zy@yahoo.com
斑玉蕈不同交配型的原生质体单核菌株差异分析
潘越1，2 陈辉2 冯志勇1，2 赵静3
（1. 南京农业大学生命科学学院，南京 210095 ；2. 国家食用菌工程技术研究中心 农业部南方食用菌资源利用重点开放实验室 上海市农业遗
传育种重点开发实验室 上海市农业科学院食用菌研究所，上海 201403 ；3. 上海光明森源生物科技有限公司，上海 201408）
摘 要 ： 对 2 个斑玉蕈菌株进行了原生质体分离与交配型鉴定，并对不同交配型单核体的代谢特性进行了研究。结果表明，
2 个斑玉蕈菌株均出现 2 种交配型，2 种交配型比例不一致，且 2 个菌株的两种单核体的分离比例均不符合 1∶1 分离比，交配型
比例上出现明显的偏差现象。2 个菌株中，不同交配型单核菌株的菌丝形态有明显差别，代谢过程中的菌丝生物量及发酵液的 pH、
还原糖含量和电导率均存在差异，表明在这 2 个菌株中不同交配型单核菌株的菌丝形态及代谢特性与交配型因子相关。
关键词 ： 斑玉蕈 单核原生质体 交配型 菌丝形态 代谢特性
Variance Analysis of Different Mating Type Strains in Mononuclear
Protoplast of Hypsizygus marmoreus
Pan Yue1，2 Chen Hui2 Feng Zhiyong1，2 Zhao Jing3
（1. College of Life Sciences，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095 ；2. National Research Center for Edible Fungi Biotechnology
and Engineering，Shanghai Key Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding， Institute of Edible Fungi，Shanghai Academy of
Agricultural Sciences，Shanghai 201403 ；3. Shanghai Bright Esunyes Bio-tech Co. Lyd，Shanghai 201408）
Abstract: Tow Hypsizygus marmoreus strains were studied by protoplast isolation and mating-type identification. Metabolic characteristics
of different mating type strains were studied. Results showed that each of the 2 Hypsizygus marmoreus strains had 2 mating type. The ratio of two
mating-type monokaryons of 2 strains was not 1∶1 and the proportion of mating types had different phenomenon. Different kinds of mating type
had different hyphae form and there was difference between the conductivity, the pH, the content of reducing sugar of the broth and the mycelial
biomass in different mating type strains, which indicated that hyphae form and metabolic characteristic had relations with mating factors in this
two strains.
Key words: Hypsizygus marmoreus Monokaryon protoplast Mating type Hyphae form Metabolic characteristic
和再生时，发现再生菌丝体中存在双核和单核两种，
其中单核体占 20%-40%。朱朝辉等［4］在分离香菇
原生质体单核体时发现不同交配型的单核体再生比
例差异较大。王波等［5］在对金针菇原生质体单核体
进行研究时发现，不同交配型的单核体的生长速度
有显著差异。
在先前的研究中发现，不同交配型的单核体菌
丝生长状况不尽一致。针对这一现象，本试验以 2
个斑玉蕈供试菌株为材料，对其原生质体单核体的
再生及其菌落形态与交配型的关系进行研究，并进
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期132
一步研究不同交配型单核体在液体培养过程中相关
生理指标的变化情况，考察不同交配型单核体代谢
特性的差异，以期为今后的单核体杂交育种工作提
供指导。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 斑玉蕈菌株 SIEF4074 和 SIEF4076
菌株均由上海市农科院食用菌研究所提供。其中
SIEF4074 为白色斑玉蕈菌株，SIEF4076 为褐色斑玉
蕈菌株，SIEF4074 菌株是 SIEF4076 菌株的突变菌株。
1.1.2 试验仪器 光学显微镜、恒温摇床、MJP-250
型霉菌培养箱、电热恒温鼓风干燥箱、METTLER
TOLEDO FE30 电导率仪、电子天平，DELTA320pH
计、Beckman Du530 紫 外 分 光 光 度 计、Eppendorf
centrifuge 5810 R 离心机等。
1.1.3 培养基 PDA 培养基 ：马铃薯 200 g，葡萄糖
20 g，琼脂 20 g，水 1 000 mL，pH 自然。液体培养基：
马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，水 1 000 mL，pH 自然。
1.2 方法
1.2.1 原生质体的制备和再生 按文献［6］的方法
制备原生质体单核体并测定交配型。
1.2.2 交配型实得比例的 χ2 检验 确定原生质体单
核化得到的两种交配型是否符合 1∶1，进行 χ2 检验，
公式为 ： ∑
k
iχ
2 =
|O−E|−0.5 2
E
其中，O 表示实际单核原生质体数，E 表示理
论单核原生质体数。
1.2.3 不同交配型单核体菌落宏观形态观察 将不
同交配型的单核体菌株接种至 PDA 平板中央，置于
25℃中避光培养 10-12 d 观察两种交配型的单核体
的菌落形态并拍照。
1.2.4 不同交配型单核体菌丝微观形态观察 使用
插片培养法制成菌丝玻片标本，在光学显微镜下用
10 倍、40 倍物镜对不同交配型的单核菌丝进行菌丝
形态特征观察，并拍照记录。
1.2.5 液体培养 自 PDA 培养基中接取单核体菌块
于含有 100 mL 液体培养基的 250 mL 三角瓶中，每
只三角瓶对应接取 2 块直径为 0.5 cm 的原种菌丝块，
于 25℃、150 r/min 条件下进行液体摇床培养。
1.2.6 电导率、pH 测定 取培养天数不同的发酵液
5 mL，置于离心机中离心（3 500 r/min，20℃，10
min），取上清液 4 mL，于电导率仪与 pH 计上读取
电导率值与 pH 值。
1.2.7 还原糖测定 参见文献［7］的方法。
1.2.8 菌丝生物量的测定 参见文献［8］的方法。
2 结果
2.1 单核原生质体分离
从 SIEF4074 菌株原生质体再生平板中分离获
得 343 株单个原生质体再生菌株，鉴定结果为 102
株无锁状联合，原生质体单核化率为 29.7%，从
SIEF4076 菌株原生质体再生平板中分离获得 396 株
单个原生质体再生菌株。鉴定结果为 134 株无锁状
联合，原生质体单核化率为 33.1%。
2.2 单核原生质体交配型测定
对再生的单核原生质体菌株进行了交配型检
测，结果为 2 个斑玉蕈菌株均出现两种交配型，经
χ2 检验结果为两个菌株的两种交配型在 1% 的水平
上均不符合 1∶1，且差异较大（表 1）。其中菌株
SIEF4074 A1B1 和 SIEF4076 AxBx 交配型相同，菌株
SIEF4074 A2B2 和 SIEF4076 AyBy 交配型相同。
表 1 两个斑玉蕈菌株两种交配型的 χ2 检验
菌株编号 交配型类型 实际单核数（O） 理论单核数（E） χ2 检验
SIEF4074 A1B1 91 51 χ2 =61.2>χ2 0.05，1，不符合 1∶1
A2B2 11 51
SIEF4076 AxBx 113 67 χ2 =61.8>χ2 0.05，1，不符合 1∶1
AyBy 21 67
2.3 不同交配型单核体宏观菌落形态及微观菌丝
形态观察
同一个菌株原生质体单核化分离到的相同交配
型的单核体菌株间的菌落形态不具有明显的差异，
而不同交配型的单核体则表现出差异，可以通过肉
眼分辨出来（表 2，图 1）。在光学显微镜下观察不
2014年第9期 133潘越等：斑玉蕈不同交配型的原生质体单核菌株差异分析
同交配型的单核体菌丝，发现不同交配型的单核体
菌丝形态也具有明显的差异（图 2）。
2.4 不同交配型单核菌株液体培养过程中代谢特
性比较
对 2 个供试菌株的两种交配型单核菌株进行液
体摇床培养后，对生长过程中的菌丝生物量及发酵
液的 pH、还原糖含量及电导率分别进行比较分析。
2.4.1 发酵过程中菌丝体生物量测定结果分析 结
果（图 3）显示，单核菌株的菌丝体生物量随着培
养时间增长而增大。AyBy 型单核菌株的菌丝体生物
量明显高于 AxBx 型单核菌株，这表明 AyBy 型菌株
具有更高的生长速率，这也可能与其具有更高的糖
代谢能力有关。
2.4.2 液体培养过程中 pH 测定结果分析 结果（图
4）显示，所有单核菌株发酵液的 pH 随着培养天数
增长而增大，AxBx 型菌株发酵液的 pH 大于 AyBy
型菌株。推测菌丝在生长过程中向胞外分泌代谢产
物导致发酵液 pH 增大，在第 8-10 天发酵液 pH 变
化较大，可能这段时间内菌丝产生较多代谢产物。
2.4.3 液 体 培 养 过 程 中 还 原 糖 含 量 测 定 结 果 分
析 结果（图 5）显示，随着菌丝的生长，发酵液
中还原糖含量逐渐减少。其中，AyBy 型单核菌株对
还原糖的利用率高于 AxBx 型单核菌株，表明其在
发酵过程中拥有较高的糖代谢能力。
2.4.4 液体培养过程中电导率测定结果分析 结果
（图 6）显示，单核菌株的发酵液电导率均随培养时
表 2 两个斑玉蕈菌株不同交配型单核体菌丝形态比较
菌株编号 交配型类型 菌落宏观形态 菌丝微观形态
SIEF4074 AxBx 菌丝浓密，厚薄均一，边缘整齐，气生菌丝较多 菌丝生长整齐，菌丝较粗
AyBy 菌丝较稀薄，边缘不整齐，菌丝匍匐生长 菌丝生长凌乱，菌丝较细
SIEF4076 AxBx 菌丝浓白，厚薄均一，边缘整齐，气生菌丝较多 菌丝生长整齐，菌丝较粗
AyBy 菌丝洁白，边缘不整齐，菌丝匍匐生长 菌丝生长凌乱，菌丝较细
SIEF4074 AxBx SIEF4074 AyBy
SIEF4076 AxBx SIEF4076 AyBy
图 1 不同交配型单核体菌落形态
SIEF4074 AxBx SIEF4074 AyBy
SIEF4074 AxBx SIEF4074 AyBy
SIEF4076 AxBx SIEF4076 AyBy
SIEF4076 AxBx SIEF4076 AyBy
A
B
20 μm 20 μm
20 μm 20 μm
5 μm 5 μm
5 μm 5 μm
A ：10 倍物镜下菌丝形态 ；B ：40 倍物镜下菌丝形态
图 2 不同交配型单核菌株显微形态照片
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第9期134
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02㧼э⭏⢙䟿 g
0
0 6 8ษޫཙᮠ d 10 120.100.080.060.040.02㧼э⭏⢙䟿 g 0 0 6 8ษޫཙᮠ d 10 12 SIEF4076 AxBxSIEF4076 AyBySIEF4074 AxBxSIEF4074 AyByA B
图 3 不同交配型单核菌株液体培养过程中菌丝生物量的变化
0
6.0
6.2
6.4
6.6p
H
6.8
7.0
7.2
7.4
6 8ษޫཙᮠ d 10 1206.06.26.46.6pH 6.87.07.27.4 6 8ษޫཙᮠ d 10 12 SIEF4076 AxBxSIEF4076 AyBySIEF4074 AxBxSIEF4074 AyByA B
图 4 不同交配型单核菌株液体培养过程中 pH 的变化
0
4
8
12
16
20
24
28
32
6 8ษޫཙᮠ d 䘈㌆ਜ਼䟿 mg/mL 10 12 048121620242832 6 8ษޫཙᮠ d 䘈㌆ਜ਼䟿 mg/mL 10 12SIEF4076 AxBxSIEF4076 AyBySIEF4074 AxBxSIEF4074 AyByA B
图 5 不同交配型单核菌株液体培养过程中还原糖含量的变化
0
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
6 8ษޫཙᮠ d ⭥ሬ⦷ ms/cm 10 1200.81.01.21.41.6 6 8ษޫཙᮠ d ⭥ሬ⦷ ms/cm 10 12 SIEF4076 AxBxSIEF4076 AyBySIEF4074 AxBxSIEF4074 AyByA B
图 6 不同交配型单核菌株液体培养过程中电导率的变化
2014年第9期 135潘越等：斑玉蕈不同交配型的原生质体单核菌株差异分析
间增大而增大，在发酵过程中，AxBx 型单核菌株发
酵液的电导率始终比 AyBy 型单核菌株大，推测在
发酵过程中 AxBx 型单核菌株产生的离子较多，且
AxBx 型菌株的细胞膜通透性比 AyBy 型单核菌株大。
3 讨论
本试验中，两个供试菌株均获得了两种亲本交
配型单核体，经 χ2 检验分析后，两个供试菌株的两
种单核体的分离比例均不符合 1∶1，且差异较大。
这与朱朝辉等［4］对香菇原生质体单核体交配型的研
究结果一致，出现这种结果的原因可能是两种交配
型原生质体单核体的再生能力有所不同。程水明等［9］
对栽培和野生香菇菌株进行了较为系统的原生质体
单核体交配型比例的研究，发现栽培菌株的两种亲
本交配型单核体比野生菌株的两种单核体偏离程度
要高。本试验中两个供试菌株的单核体交配型比例
也有一定的差异，褐色菌株两种单核体类型核的偏
离程度比白色菌株低，其原因可能是由于褐色菌株
更接近于野生菌株，而白色菌株是由褐色菌株在人
工栽培过程中突变而来的。
两个供试菌株的不同交配型的单核体菌株的宏
观菌落形态及微观菌丝形态都具有明显的差异，这
与蚁端荣等［10］对金针菇单核体交配型的研究结果
相同，推测斑玉蕈菌落的形态与交配型因子可能有
一定的关系。另外，不同交配型的单核菌株的代谢
特性同样具有明显的差异，不论是生长特性、糖代
谢能力还是生长速率均具有显著的不同，说明不同
交配型的单核菌株具有不同生长能力。在两个供试
菌株中，具有相似菌落形态的单核体的代谢特征类
似，而菌落形态差异较大的单核菌株的代谢特点同
样具有较大差异。在对其他真菌的研究中，也发现
过类似的现象，如邓昕等［11］在研究梭链孢酸脂球
菌时发现，不同菌落形态的梭链孢酸脂球菌菌株不
论在生长特性、糖氮代谢、还是产抗能力方面都有
明显的不同。这表明不仅可以通过观察单核体的菌
落形态来推测其交配型因子，而且可以初步推测该
单核菌株的代谢特点。
为了得到性状优良的斑玉蕈菌株，需要进行菌
种选育，原生质体杂交育种则是最为有效的菌种选
育方法之一。在杂交育种中选取生长能力较强的原
生质体单核菌株，对选育优良菌种具有重大的意义。
本研究对不同交配型的单核菌株进行了再生能力、
菌落形态、生长代谢等差异分析，为今后的育种工
作提供了一定的指导作用。
4 结论
本研究两个斑玉蕈菌株的原生质体单核体均出
现两种交配型，且交配型比例差别较大。两个供试
菌株所有的原生质体单核菌株中，不同交配型单核
菌株的菌落和菌丝形态均有明显差别。不同交配型
单核菌株的代谢特性存在一定的区别，其菌丝生物
量及发酵液的 PH、还原糖含量和电导率均存在差异。
参 考 文 献
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（责任编辑 马鑫）