全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第5期
收稿日期 : 2012-01-15
基金项目 : 河北省教育厅自然科学研究资助项目（Z2006409）
作者简介 : 李志亮 , 男 , 副教授 , 博士研究生 , 研究方向 : 植物生理、植物细胞工程和分子生物学 ; E-mail: zhiliangli09@126.com
利用 P5CS基因转化白三叶的研究
李志亮1, 2, 3 杨清2 叶嘉1 邢浩春1 黄丛林3 吴忠义3
（1 邯郸学院生物科学系，邯郸 056005 ； 2 南京农业大学生命科学学院，南京 210095 ；
3 北京农业生物技术研究中心，北京 100097）
摘 要： 为了培育抗旱白三叶，构建了植物表达载体 pBPC-P5CS，利用基因枪法转化白三叶的愈伤组织，PCR 检测和
Southern blot鉴定证实白三叶中已导入 P5CS基因。对转 P5CS基因白三叶植株的不同抗旱指标进行了分析。结果表明，与对照相比，
转 P5CS基因株系的抗旱能力得到了较大的提高。干旱胁迫下，与对照相比，转 P5CS基因植株的脯氨酸含量和相对含水量分别比
对照高 20.0%-21.2%和 5.6%-8.5%。
关键词： P5CS基因 白三叶 基因枪转化法 抗旱性
Transformation of White Clover（Trifolium repens L.）
by P5CS Gene
Li Zhiliang1, 2, 3 Yang Qing2 Ye Jia1 Xing Haochun1 Huang Conglin3 Wu Zhongyi3
（1Department of Biology Science，Handan College，Handan 056005； 2College of Life Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing
210095；3Beijing Research Center of Agro-Biotechnology，Beijing 100097）
Abstract: In order to cultivate drought resistance white clover（Trifolium repens L.）, the plant expression vector pBPC-P5CS was cons-
tructed and transformed into calli of white clover via microprojectile bombardment method. The PCR amplification. Southern blot method were
used to identified the P5CS gene in the transgenic white clover. The different drought resistance index of transgenic P5CS white clover plants was
analyzed. The results showed that the transgenic plants can enhance the drought resistance comparing to control plants. Under drought stress, the
proline content and RWC of transgenic plants was 20.0%-21.2％ , 5.6%-8.5％ higher than that that of wild type（WT）, respectively.
Key words: P5CS gene White clover（Trifolium repens L.） Microprojectile bombardment Drought resistance
白三叶（Trifolium repens L.），又名白车轴草，
豆科三叶草属牧草，多年生草本植物［1］，是世界上
重要的豆科牧草之一，我国贵州、云南、江西、四川、
新疆等地都有其野生种分布。由于其营养价值高，
适口性好，再生能力强，耐践踏，适度放牧后能促
进分枝再生，在人工草地和补播天然草场上对畜牧
业发展有重要作用［2］，是许多温带混播草地的重要
组分，为家畜提供优质廉价的饲草。白三叶还是一
种非常具有推广价值的地被植物、城市绿化美化的
理想草种和良好的水土保持植物［3］。但白三叶的耐
旱性不是很理想，干旱易发病［4］。在我国北方水资
源比较缺乏，白三叶作为草坪草，其种植面积不断
扩大，在管理时需要大量水，因此，需要培育具有
较强抗旱能力的优质白三叶新品种。
目前，干旱胁迫已经成为影响草坪草生长最主
要的环境胁迫因子之一，限制了其在我国北方和南
方一些地区的应用。随着分子生物学和植物遗传转
化技术的发展和改进，使得利用基因工程技术进行
白三叶品种的遗传改良成为可能。脯氨酸累积既是
植物对干旱逆境的一种适应，也是植物抵御干旱、
维持自身正常生命活动的一种方式。在胁迫条件下，
P5CS 基因的表达可以增加脯氨酸的合成，从而增加
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期62
细胞的保水能力，提高植物的抗旱性［5］。本研究利
用基因枪法将 P5CS 基因导入白三叶的海法品种中，
并对白三叶再生植株进行 PCR 检测和 Southern blot
鉴定，同时，对转基因植株进行脯氨酸含量和相对
含水量测定及抗旱性的初步分析。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的白三叶品种为海法，由北京草业与环境
研究发展中心提供。质粒 pBPC-P5CS（图 1）由北
京农业生物技术研究中心园林室提供。
待小苗长到约 1 cm 时放入含草丁膦 1.5 mg/L 生根培
养基（1/2MS+ IBA 0.5 mg/L）上，继续培养成苗。
1.2.4 再生植株的分子检测 选取草丁膦抗性的植
株，用 CTAB 法提取叶片总 DNA，利用 PCR 对 bar
基因进行检测。根据 bar 基因的序列设计引物。上
游引物 ：18 bp 5-ATGAGCCCAGAACGACGC-3；下
游引物 ：19 bp 5-CTAAATCTCGGTGACGGGC-3；阳
性转基因植株可扩增出 552 bp 的片段。PCR 采用由
东盛公司生产的扩增仪。
PCR 阳性植株的 Southern blot 鉴定。取经 PCR
检测呈阳性的植株进行 Southern blot 鉴定，以质粒
为阳性对照 ；以未转基因的白三叶的基因组 DNA 为
阴性对照。探针标记和杂交检测按照 Roche 公司的
地高辛试剂盒的方法进行，杂交温度为 65℃。
1.2.5 脯氨酸含量测定 对部分转基因白三叶植株
和对照植株进行干旱处理，测定幼苗叶片脯氨酸含
量。叶片脯氨酸含量的测定按张殿忠等［7］的方法进
行。数据为 3 次独立试验的平均值。
1.2.6 叶片相对含水量（RWC）测定 取形态指标
如株高、长势等基本相似的转基因植株和对照植株，
进行叶片相对含水量测定。取叶片立即称鲜重（0.2
g），然后室温下（20℃）将叶片放在蒸馏水中浸泡
16-18 h，取出后，立即用滤纸擦干称饱和重，然后
放于烘箱内 105℃杀青 5 min，再于 75℃烘箱中烘干
72 h 后称干重。由下式计算 ：
叶片相对含水量（%）＝［（鲜重－干重）/（饱
和重－干重）］×100％。
2 结果
2.1 胚性愈伤组织的筛选和植株再生
用 1.5 mg/L 草丁膦对基因枪轰击后的胚性愈伤
组织进行筛选。在愈伤组织筛选过程中，非抗性愈
伤组织块会逐渐褐化甚至变黑，而抗性愈伤组织块
上会逐渐生出绿色的小芽点，最后发育成幼芽和幼
叶，最后在生根培养基上发育成小植株（图 2），最
终获得草丁膦抗性植株 12 株。
2.2 转基因白三叶植株的分子检测
用设计好的引物对草丁膦抗性植株进行 bar 基
因的 PCR 检测，转基因植株的 bar 基因扩增带位
置与质粒阳性对照扩增带位置相同，而阴性对照及
图 1 pBPC-P5CS质粒图谱
1.2 方法
1.2.1 受体材料的准备 将白三叶种子经常规消毒
后接种在 pH 为 6.5 的 1/2MS 培养基上，3-5 d 后种
子开始萌发，大约 20-25 d 后成苗。当苗长到高约
5-10 cm 时，无菌条件下，切取幼苗茎段，大约 1-2
cm，接种在诱导培养基（MS+6-BA 3.0 mg/L+ NAA 3.0
mg/L）上，在（26±1）℃，暗培养条件下，10 d 后
首先从茎段两端上长出愈伤，大约 20-30 d 后长成
约 0.2-0.4 cm 的小块。
1.2.2 基因枪轰击方法与参数 参见文献［6］的方
法进行。
1.2.3 恢复培养、筛选及植株再生 轰击后的白三
叶愈伤组织继续在暗处恢复培养 5-7 d，然后转到含
草丁膦（phosphinothricin）1.5 mg/L 的诱导和分化培
养基（MS+6-BA 2 mg/L+IAA 0.1 mg/L）上进行筛选，
2012年第5期 63李志亮等 ：利用 P5CS 基因转化白三叶的研究
其它植株无扩增带（图 3-a）。经检测，共得到 9 株
PCR 阳性植株，阳性率 75%。从 PCR 阳性植株中选
出 4 个株系大量提取叶片基因组 DNA，采用限制性
内切酶EcoR I进行酶切，然后进行Southern blot鉴定，
结果如图 3-b 所示，外源基因已插入转基因白三叶
植株基因组中。
2.3 转基因植株的脯氨酸含量增加
为了解在干旱胁迫处理条件下转基因植株脯氨
酸积累的变化，测定了转基因植株和对照植株叶片
脯氨酸的含量。在干旱胁迫处理之前，叶片脯氨酸
含量在转基因植株和对照植株之间没有显著差异，
含量都较低。干旱胁迫引起转基因植株叶片脯氨酸
含量的不同程度的上升。在干旱胁迫处理过程中，
转基因植株（L1，L3）叶片脯氨酸的含量都显著高
于其对照植株（WT）。如在正常条件下，WT、L1、
L3 植株的脯氨酸含量分别为 24.1、24.6、24.9 μg/g
FW，没有显著差异。干旱胁迫处理 3 d 后，L1，L3
植株脯氨酸含量分别上升为 67.3、68.0 μg/g FW，显
著高于 WT 植株的 56.1 μg/g FW，转基因植株叶片脯
氨酸含量比对照株高 20.0%-21.2％（图 4，表 1）。
这些结果表明转基因植株细胞可以积累更多的脯氨
酸，使细胞能够维持较低的溶质势，从而能够更好
地保持水分，减少或免受干旱胁迫的伤害。与对照
相比，转基因植株对干旱胁迫具有较强的耐性。
a. 白三叶茎段及其诱导的愈伤组织 ；b. 用于基因枪轰击的胚性愈伤组
织 ；c. 草丁膦抗性愈伤组织分化成小绿点，而非抗性愈伤组织褐化甚
至变黑 ； d. 再生植株
图 2 转基因白三叶植株的获得
a. 部分草丁膦抗性植株的PCR 检测： M. DNA标准分子量，1. 阳性对照，2.
阴性对照，3-6. 转基因植株 ；b. 部分转基因白三叶植株的 Southern blot
鉴定，基因组 DNA 用 EcoR I 消化： M. DNA 标准分子量，1. 阳性对照，2-5.
转基因株系，6. 阴性对照
图 3 转基因白三叶植株的分子鉴定
L1、L3 为转基因株系，WT 为对照株系
图 4 干旱胁迫引起的白三叶幼苗脯氨酸含量的变化
表 1 不同株系在不同处理时间条件下脯氨酸的
含量（μg/g FW）变化
数据为 3 次重复
处理时间（d） 株系WT L1 L3
0 24.1 24.6 24.9
3 56.1 67.3 68.0
6 66.2 82.5 82.9
9 72.4 96.4 96.9
2.4 转基因植株具有较高的相对含水量
为进一步了解转基因植株的抗旱性，对转基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第5期64
植株和对照植株的相对含水量进行了测定，结果如
图 5 所示。干旱胁迫前，转基因植株的叶片相对含
水量与对照植株相比，无明显差别。干旱胁迫引起
植株叶片相对含水量的显著下降。白三叶幼苗在干
旱胁迫过程中，叶片相对含水量逐渐降低，但是转
基因植株的相对含水量比非转基因对照植株的降低
得慢。处理第 3 天时，非转基因对照植株叶片相对
含水量降低为 84.6%，而转基因植株 L1、L3 的叶片
相对含水量分别降低为 89.3%、91.8%，差异显著（表
2）。与对照相比，转基因植株叶片相对含水量比对
照高 5.6%-8.5％。这说明转基因植株在干旱胁迫条
件下可以保持较高的相对含水量，具有较强的保水
力，从而保持正常的细胞彭压，有利于植株的生长，
赋予转基因植株较强的抗旱性。
Southern blot 鉴定，结果显示豇豆 P5CS 基因已整合
进转基因白三叶基因组中。
试验证实，转化 P5CS 基因可显著提高多种植物
的脯氨酸水平。如 Zhu 等［8］研究显示转豇豆 P5CS
基因水稻植株的脯氨酸含量比对照高 67%-152％。
Hong 等［9］发现，与对照相比， P5CS 转基因烟草植
株中脯氨酸的水平提高了 2 倍。李志亮等［6］的脯氨
酸含量测定表明，转 P5CS 基因高羊茅植株的脯氨
酸含量比对照高31%-83%。韩素英等［10］的研究表明，
转 P5CS 基因落叶松植株的抗旱能力得到了明显提
高。Dibax 等［11］发现表达豇豆的 P5CS 基因柳叶桉
中脯氨酸含量比对照约高 4 倍。曹丽等［12］用黑麦
草的 P5CS 基因的突变型 LpP5CSF128A转化拟南芥，
脯氨酸含量测定表明，转基因植株的脯氨酸含量比
对照高 65.1%-117.9%。
脯氨酸累积既是植物对干旱逆境的一种适应，
也是植物抵御干旱、维持自身正常生命活动的一种
方式。无论是在干旱胁迫下或是在胁迫复水后，体
内较高的脯氨酸含量都对提高植株的抗旱性和加速
恢复生长有利，植物在干旱条件下产生更多的渗透
调节保护物质脯氨酸，可大大提高植物的抗旱性［13］。
本研究测定了转 P5CS 基因白三叶植株和对照植株
叶片脯氨酸的含量。干旱胁迫引起转基因植株和对
照植株叶片脯氨酸含量不同程度地上升，但在相同
的胁迫时期，转基因植株叶片脯氨酸的含量显著高
于其对照。转基因植株叶片脯氨酸含量比对照株高
20.0%-21.2％。说明转基因植株比对照抗旱。
研究也发现，植物的抗旱性与植株的水分状况
有关。叶片相对含水量（RWC）能密切反映水分供
应与蒸腾之间的平衡关系，因而是较好的水分状况
指标。本试验结果表明，干旱胁迫引起转基因植株
叶片相对含水量不同程度的下降。但与对照相比，
转基因植株叶片相对含水量比对照高 5.6%-8.5％，
说明转基因植株的失水程度小于对照，转基因植株
水分损失少。这些结果表明，与对照相比，转基因
植株叶片细胞具有较强的保水力，能够更好地保持
体内水分，因而具有较强的抗旱性。
基于上述结果，可以看出，干旱胁迫下，与对
照相比，转基因植株细胞可以积累较多的脯氨酸，
使细胞能够维持较低的溶质势，保持较高的相对含
处理时间（d）
L1、L3 为转基因株系，WT 为对照株系
图 5 干旱胁迫引起的白三叶幼苗相对含水量的变化
表 2 不同株系在不同处理时间条件下含水量（%）变化
处理时间（d）
株系
WT L1 L3
0 94.5 95.1 95.6
3 84.6 89.3 91.8
6 73.3 79.6 83.2
9 65.3 73.8 74.8
数据为 3 次重复
3 讨论
本研究构建了 pBPC-P5CS 植物表达载体，利
用基因枪法转化白三叶茎段胚性愈伤组织，利用草
丁膦进行筛选，获得 12 草丁膦抗性植株，对获得
的草丁膦抗性再生植株进行了 PCR 检测，得到 9 株
PCR 阳性植株 ；对其中 4 株 PCR 阳性植株进行了
2012年第5期 65李志亮等 ：利用 P5CS 基因转化白三叶的研究
水量，从而能够更好地保持水分，维持细胞膨压，
减少或免受干旱胁迫的伤害，有利于植株的生长，
转基因植株对干旱胁迫有较强的耐受能力。
4 结论
本试验的研究表明，P5CS 基因已整合到白三叶
基因组中并能够在植株中表达，与对照相比，提高
了脯氨酸含量（20.0%-21.2％）和相对含水量（5.6%-
8.5％），从而提高了转基因植株的抗旱性。下一步
试验是对初步表明抗旱性增强的转基因白三叶进行
小规模田间抗旱性检验，进一步筛选抗旱性较强的
转基因白三叶材料，以便应用于白三叶抗旱新品种
的培育。
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（责任编辑 李楠）