全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-05-07
基金项目 : 上海市科学技术委员会项目（09320503600）
作者简介 : 金浩 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 生物分子 ; E-mail: jhkingool@sina.com
通讯作者 : 陈兰明 , 女 , 博士 , 教授 , 研究方向 : 食品科学与工程 ; E-mail: lmchen@shou.edu.cn
酶是由活细胞产生的生物催化剂，高效、专一，
且需要在适宜的条件下才能发挥相应的作用，酶的
这些特性和各种各样的生物催化功能，对人类及其
生活都有极大的影响。在工业上，酶催化技术与传
统化学过程相比可改变化工行业高污染、高能耗的
现状。美国提出到 2020 年，通过生物催化技术，使
化学工业的原料消耗、水资源消耗、能量消耗各降
低 30％，污染物的排放和污染扩散减少 30％［1］。
酶催化技术的研发和应用有利于新型清洁高效化工
生产过程的实现和工业可持续发展。
微生物蕴含着极其丰富的基因资源。自然界中
的微生物分布在各种环境，甚至高温、高压、高盐
碱等极端环境中，据估计数量多达 1030 ［2］。然而，
其中 99% 的微生物在实验室现有条件下不能培养，
它们的基因组编码大量未被开发的新型酶和代谢途
径基因［3］。 宏基因组学（metagenomics）绕开环境
微生物研究过程中培养技术局限的极大阻碍，发展
成为不可培养或未培养微生物研究的重要工具。目
前，宏基因组学技术在复杂环境尤其是极端环境中，
在微生物代谢途径新基因和新的生物活性物质的发
现方面得到了广泛的应用［4、5］，已取得了令人瞩目
的研究进展，为人类开发利用自然环境中的微生物
基因资源开辟了新的途径。
1 宏基因组学技术
宏基因组学也称为环境基因组学（environmental
genomics）或群落基因组学（community genomics）。
最初由 Handelsman 等［6］于 1998 年提出，以生态环
境中全部微小生物的基因组（the genomes of the total
宏基因组学技术在微生物功能酶开发中的应用
金浩 李柏林 潘迎捷 欧杰 陈兰明
（上海海洋大学食品科学与技术学院，上海 201306）
摘 要： 宏基因组学技术以特定环境样品中微生物复杂群落的基因组总和为研究对象，突破了传统微生物纯培养方法的局限，
为不可培养微生物中丰富的基因资源的开发和利用提供了强有力的工具，已经取得了令人瞩目的研究进展。对宏基因组学技术及
其在微生物功能酶新基因发现中的应用进行综述。
关键词： 宏基因组学 功能酶筛选 环境微生物
Metagenomics Technology Application in Microbial
Functional Enzymes
Jin Hao Li Bailin Pan Yingjie Ou Jie Chen Lanming
（College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306）
Abstract: Metagenomic technology is applied in studying the total genomes of complex microbial community in specific environment. It
overcomes the limitations of conventional methods of microorganism cultivation，and provides powerful techniques to explore and utilize rich
gene resources of unculturable microorganisms. Remarkable progress has been achieved in this research field. This paper reviewed the theory
and application of metagenomic technology in screening novel functional enzymes from microorganisms.
Key words: Metagenomics Functional enzyme screening Environmental microorganisms
2012年第9期 47金浩等 ：宏基因组学技术在微生物功能酶开发中的应用
microbiota found in nature） 作为研究对象，针对特定
环境样品中微生物复杂群落的基因组总和进行研究，
而不需要分离、培养微生物。伴随着 PCR 技术、基
因克隆技术以及基因组测序技术等的逐渐成熟与完
善，以及相关学科的发展与渗透，宏基因组学技术
极大地推动了微生物学的发展。
1.1 宏基因组文库的构建
提取特定环境中微生物群落的总基因组 DNA，
保持环境样品中 DNA 的完整性和纯度是宏基因组文
库构建的关键之一。目前采用的方法大体上分为两
类［7］，一类是直接提取法，即直接裂解环境样品中
的微生物细胞，再抽提总基因组 DNA。裂解方法包
括物理法（冻融法、超声法、玻璃珠击打法和液氮
研磨法等）、化学法和酶法等；另一类是间接提取法，
即采用差速离心等方法先将微生物细胞从样品中分
离出来，再用较温和的方法抽提总基因组 DNA。一
般前者的提取效率较高，但提取的 DNA 纯度低，且
由于强烈的机械剪切作用，抽取的 DNA 片段长度有
限（1-50 kb）；而后者的纯度好，DNA 片段长度较
大（20-500 kb） ，但操作繁琐，成本高，有些微生
物可能会在分离过程中丢失［8］。
不同载体承载外源 DNA 片段大小的能力不同，
克隆片段的大小决定了构建生物基因组文库所需要
的克隆子的数目。合适载体的选择取决于生物基因
组的大小、欲插入目的片段的大小、宿主菌及筛选
方法等因素。目前，宏基因组文库构建中常用的载
体主要包括质粒，黏粒和 BAC 载体［9］。宿主菌株
的选择则取决于宿主细胞的转化率、重组载体在宿
主中的稳定性、DNA 插入片段的表达，以及目标性
状的筛选方法等因素。目前大肠杆菌（Escherichia
coli）或其改造菌株是最为常用的宿主菌 ；其次，链
霉菌（Streptomycetaceae spp.）、嗜热栖热菌（Thermus
thermophilus）等也已作为构建文库的宿主菌［10］。
1.2 宏基因组文库的筛选
由于取样环境的复杂性和样品中微生物种类的
多样性，宏基因组文库容量一般较大，因此，从几
万或几十万个文库克隆子中筛选所需基因需要高效
的筛选方法。目前，宏基因组文库的高通量筛选方
法主要有功能驱动的筛选和序列驱动的筛选 ［11］。
功 能 驱 动 的 筛 选（Function-driven screening）
是以目标基因表达产物的活性测定为基础的筛选
法［12］。Healy 等［13］最早采用功能驱动的筛选方法
从宏基因组文库中成功筛选到纤维素酶和木糖苷酶
基因。此后，从不同环境样品的宏基因组文库中相
继筛选到了产生脂酶、蛋白酶、淀粉酶、多糖修饰
酶、脱氢酶及抗菌活性的克隆子［14］。 该筛选方法
可直接筛选到应用于工农业和医药业的酶等蛋白质
和抗菌菌素等天然产物。但其缺陷是必须依赖于功
能基因在外源宿主中的表达，往往会因许多基因或
基因产物在外源宿主中的不表达或表达后没有活性
而降低了筛选效率［15］。只有优化筛选方法，选择合
适的底物及筛选条件，并建立合适的宿主载体系统，
才能加快对新型的生物催化剂的挖掘和利用。
序列驱动的筛选（sequence-driven screening）是
基于基因序列本身而进行的筛选方法，以序列相似
性为基础，根据已知功能的基因序列设计探针或
PCR 引物，通过核酸杂交或 PCR 扩增来筛选具有目
标序列的克隆子［16］。此筛选策略不依赖克隆基因在
宿主内的表达，但必须对相关基因序列有一定的了
解。因此，较难在宏基因组文库中筛选到与已知基
因序列完全不同的全新功能基因。Venter［17］最早采
用以序列为基础的筛选方法分析马尾藻海域的微生
物，鉴定出大量的新基因。利用基因的同源序列设
计引物，与宏基因组文库进行杂交已获得聚酮合成
酶［18］和脱水酶基因［19］，有望开发应用于工业生产。
此外，鉴于第二代 DNA 测序技术的快速发展［20］，
直接对所构建的宏基因组文库的克隆子进行 DNA 序
列的测定，可以获得丰富的基因信息。利用基因芯
片技术大大提高筛选效率，有可能筛选到某一类结
构或功能的新基因，但同样需要了解相关基因序列，
较难发现全新的生物活性物质。
2 宏基因组学技术的应用——功能酶基因发
现的新策略
2.1 极端环境中功能酶新基因的发现
微生物对环境的极强适应力和微生物本身的
多样性及极高的变异率为发现大量新基因提供了可
能［21］，同时，特殊的自然环境对微生物起到筛选和
富集的作用，因此以特殊环境样品中微生物复杂群
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期48
落作为宏基因组研究对象，为功能酶新基因的发现
提供了更高的可能性。杜丽琴等［22］利用宏基因组
学技术从蔗糖富集的土壤样品中获得了两种蔗糖水
解酶基因，与 GenBank 数据库中已知蔗糖水解酶的
氨基酸序列相似性分别为 38% 和 68%。在极寒、酷
热、高压、高渗透压等极端环境中生物多样性虽然
低，但极端环境微生物是发现新型生物催化剂的重
要来源［21］。 例如，在盐碱地、硫质温泉、冰河土
壤、冰川冰南极冻土等极端环境样品的宏基因组中，
已发现了具有生物学研究价值的大量的功能酶新基
因［23］。我国幅员辽阔，地质环境多样，通过宏基因
组学技术已在温泉、沼气池等环境中发现醛脱氢酶
基因［24］、木聚糖酶基因［25］等。西藏高原土壤中富
含独特的微生物资源，芦晓飞等［26］成功构建了一
个包含 30 624 个克隆且稳定性好的宏基因组 Fosmid
文库，为从西藏高原土壤中挖掘和利用新的功能基
因研究奠定了基础。
此外，环境微生物也是新药物发现的一个重要
来源。据报道，一些从土壤中分离获得的微生物活
性物质有望用于预防和治疗有机磷杀虫剂及神经毒
剂对哺乳动物的作用 ［27］，从蚯蚓生存相关的微生物
群落的宏基因组中发现的一种新型的血小板活化因
子乙酰水解酶可能被应用于生物医药业［28］。虽然微
生物来源的酶和生物活性物质在医药业的应用有一
定的难度，但宏基因组学技术对于从未培养微生物
的基因资源中挖掘具有生物医药应用潜力的新基因
有极大帮助［29］。
2.2 共生菌中功能酶新基因的发现
共生菌是长期与宿主共同生活，呈相互依赖、
互惠互利的共生关系的一大类群特殊微生物，蕴含
着丰富的基因资源及生态资源，过去长期被忽略，
相关研究也很薄弱。共生菌的生理生化特点因长期
与宿主共同进化更具特色。不少从宿主中分离获得
的生物活性物质的真正生产者是与其共生或附生的
未培养微生物，宏基因组学技术在共生菌基因资源
的开发上具有独特的优势。
植物共生菌通常对植物生长有益，如固氮菌。
通过对植物共生菌，地衣共生菌藻，尤其是农作物
共生菌的宏基因组学研究，可以分析共生菌与植物
之间的作用机制。Sessitsch 等［30］通过对水稻根部
中植物共生细菌或内生真菌的宏基因组序列的分析，
发现内生真菌细胞具有植物聚合物降解酶及蛋白质
分泌系统等，内生真菌可能涉及整个水稻的氮循环。
高质量的内生真菌群体对于植物生长的促进，植物
抗逆性的提高，以及病原菌的生物防治和生物修复
具有重要意义。
动物体表和体内也存在大量的微生物，利用宏
基因组学技术可以推测微生物的功能酶对动物的影
响。例如，从山羊皮肤表层中发现了碱性蛋白酶［31］，
白蚁的后肠中发现了木聚糖酶和纤维素水解酶等微
生物功能酶基因［32］。研究较为深入的是反刍动物的
瘤胃，瘤胃里存在着一个较复杂的瘤胃微生物生态
系统，由于瘤胃微生物的存在，反刍动物可以连续、
高效地利用低质粗饲料。但是通过纯培养技术仅分
离到占其总量 11% 左右的瘤胃微生物［33］，而宏基
因组学技术绕开了微生物纯培养，研究对象是瘤胃
环境中全部微小生物的遗传物质总和，已经从瘤胃
宏基因组中发现了木聚糖酶、葡萄糖苷酶、复合糖
基水解酶，纤维素酶等瘤胃微生物的功能酶基因，
受到养殖业、饲料业、食品、造纸和纺织业的关注［34］。
2.3 人类宏基因组中功能酶新基因的发现
人体内部或体表有数以万亿的微生物，包括
细菌、古细菌、真菌、寄生虫和病毒等，据估计有
90% 未在实验室条件下被纯培养［35］。“人体微生物
工程” （the human microbiome project，HMP），旨在
描绘与人体内脏、口腔、皮肤、阴道相关的微生物
群落的基因图谱，研究人体宏基因组结构和功能、
相互之间关系、作用规律和与疾病关系［36］。2004 年，
美国国立卫生研究院专门设立“利用宏基因组学研
究口腔微生物”的研究项目，2006 年，正式成立人
类宏基因组计划国际联盟，启动人类宏基因组计划。
在过去的五年里，在微生物与人类健康和疾病相关
性研究方面已经开展了大量的研究［37］。大多数与人
体共生的微生物具有许多独特的生物学功能，这对
于许多疾病发生机理的阐明、新药的研发等都将产
生重大影响［38］。
3 展望
宏基因组学突破了物种界限，将有助于揭示生
2012年第9期 49金浩等 ：宏基因组学技术在微生物功能酶开发中的应用
命活动的基本规律，拓展对生命本质的认识。例如，
微生物极端环境的耐受机制、共生菌与宿主互相作用
的特性、生物进化的规律等。随着科技的发展以及
宏基因组学技术的完善，微生物功能酶基因将越来
越广泛的应用于工业、农业、医学等领域，使人类
生产和生活朝着更经济、更环保、更清洁的“绿色”
方向发展。多功能酶是近年来酶学研究的新课题，但
目前还没有多功能酶经过宏基因组学技术筛选获得。
但宏基因组学技术并非完美无缺，还存在着不
少“瓶颈”问题有待解决。例如，现行的环境样品
总基因组 DNA 提取方法对提取的 DNA 的纯度、片
段长度及其代表性的要求还有待提高 ；另外，宏基
因组文库的高通量筛选，尤其是功能驱动的筛选检
出率不高，要做到高通量高效率的筛选仍然是十分
棘手的问题。本实验室经过对环境宏基因组的蛋白
酶、酯酶的相关大量研究，在宏基因组 DNA 的提取
方面已经能够获得一定的成果，但是宏基因组文库
的高通量筛选仍存在一定的难度，文库的构建以及
载体和感受态细胞的选择直接影响功能驱动筛选对
文库的筛选筛出率，而利用设计兼并引物进行的序
列驱动筛选获得了大量不同种属蛋白酶的片段，但
较难获得功能酶基因全长。根据不同的研究目的，
选择不同的文库构建方法和筛选方法会比较成功获
得功能酶新基因。
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（责任编辑 狄艳红）