全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
环境 DNA（environmental DNA，eDNA）是指从
环境中（如土壤、水、空气等）提取的所有 DNA 集
合，包括环境微生物以及从生物体上脱落下来的活
细胞 DNA 和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外
DNA［1，2］。在自然界中 eDNA 量的变化是一个动态
收稿日期 ：2014-03-28
基金项目 ：国家农业部种质资源保护项目（2013），中国长江三峡集团公司项目（0799526）
作者简介 ：徐浩，男，硕士，研究方向 ：分子生态学 ；E-mail ：haoxusw@163.com
通讯作者 ：李云，男，博士，教授，研究方向 ：鱼类生理生态学 ；E-mail ：yunlicn@126.com
环境 DNA 研究技术及其在生态学领域的应用
徐浩  罗茜  李云  薛洋  叶勤
（西南大学动物科技学院 淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆 400716）
摘 要 ： 环境 DNA（environmental DNA，eDNA）是指从环境样本中提取的所有 DNA 的集合，包括环境微生物以及从生物
体上脱落下来的活细胞 DNA 和因生物死亡后细胞破碎而游离出的胞外 DNA。按照宏基因组学概念，eDNA 研究技术主要是指直接
从环境样本中提取基因组 DNA 后进行测序分析的方法。较传统的研究方法，eDNA 应用最大的优势在于更有效地解决了特定环境
样本中宏量生物的分类问题，利于更进一步研究生态学问题，该技术耗时短、成本低，准确度高。第二代高通量测序技术的开发
成功，进一步拓展了 eDNA 的应用范围，并开始从微生物学向动、植物学领域拓展，促进了传统生态学领域在研究方法和思想上
的一场革新。对 eDNA 的研究技术在生物多样性分析、动物食性分析、生物量估测等生态学领域的应用进行了综述，最后对 eDNA
研究技术的发展趋势和前景作出展望。
关键词 ： 环境 DNA 宏基因组学 生态学 物种分类
Applications of Environmental DNA Approaches to
Ecological Researches
Xu Hao Luo Xi Li Yun Xue Yang Ye Qin
（Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development（Ministry of Education），College of Animal Science and Technology，
Southwest University，Chongqing 400716）
Abstract: Environmental DNA（eDNA）refers to DNA that can be extracted from environmental samples, without first isolating any
target organisms, which includes DNA of environmental microorganisms, alive cellular fallen off from organisms, and extracellular DNA resulting
from natural death organisms and subsequent destruction of cell structure. According to metagenomics concept, eDNA technologies mainly
refers to the methods of sequencing analysis with genomic DNA from environmental samples. Comparing with the traditional way, the significant
advantage of eDNA technologies is more efficient in solving the classification problem of mass organisms in given environmental sample, which
exert shorter time-consuming, lower cost, higher accuracy. The next generation of high-throughput sequencing technology（NGS）further
expands the application fields of eDNA technologies, from microbiological field to zoological and botanic fields, and results in an innovation in
research methods and ideas in traditional ecology. The present review summarized the eDNA technologies and applications aspects in analysis of
biological diversity, animal diets, aquatic biomass estimation, etc. Finally, the trends and prospects regarding eDNA technologies development
are presented.
Key words: Environmental DNA Metagenomics Ecology Species classification
过程，不断产生的同时也不断的降解，但也有如化
石一样能长久存在的古 eDNA［3］。
涉 及 环 境 DNA 的 研 究 最 早 始 于 1987 年， 即
由微生物学家从湖底沉积物中成功提取出环境微生
物 DNA［4］。而首先出现“eDNA”这个词应该是在
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期50
2000 年的一篇文献中［5］，该文献提出传统的培养方
式培养出的细菌并不能反映所取环境中细菌群落的
多样性，因为大多数的细菌在实验室条件下不可培
养。研究者通过从土壤中直接提取细菌 DNA 基因
组并利用细菌人工染色体构建环境基因组文库，经
16S rRNA 序列比对鉴定出了大量的微生物种类，证
明了 eDNA 可用于研究微生物多样性以及物种鉴定。
随之而来的是在生态学研究中关于 eDNA 应用的文
献大量出现［6-8］，逐渐从微生物学拓展到了动植物
学的研究领域中。
可以说 eDNA 应用是伴随着宏基因组学的发展
而发展起来的。1998 年，微生物学家 Handelsman［9］
首先提出了宏基因组学（Metagenomics）的概念，意
指土壤微生物的全部基因组的集合。近年来，随着
DNA 测序技术的不断进步以及测序成本的下降极大
地推动了宏基因组学的发展。现今，宏基因组学可
以广义的定义为对环境中直接获得的总 DNA 进行分
析的所有研究［10］。与传统的个体生物研究相比，宏
基因组学是将环境样本所有生物以整体为研究对象，
是直接从环境样本中提取基因组 DNA 后进行测序分
析的方法［11］。而 eDNA 应用正是以环境生物 DNA
为研究对象，从整体到局部的过程，相信能在生态
学各领域中得到很好的应用。
1 用于 eDNA 的主要研究技术
1.1 NGS技术
第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）
即是目前最新的高通量测序技术。其技术的核心思
想是边合成边测序，通过捕捉新合成的末端的标记
来确定 DNA 的序列。现有的技术平台主要包括 454
Pyrosequencer GS FLX Titanium（Roche）、Solexa GA
（Illumina）、HeliScope（Helicos BioSciences）、SOLiD
4（Life/Applied Biosystems）［12］ 和 SMRT（Pacific
Biosciences）［13］。各技术平台应用范围非常广泛，
且各有所长，其中 Roche 454 GS FLX 测序技术最适
合用于生态学中宏基因组学的研究。其测序 PCR 反
应发生在固相的微珠上，整个 PCR 反应相关的酶和
试剂都被油包水的液滴包裹，每个油滴系统只包含
一个 DNA 模版进行独立的 PCR 扩增。扩增后，每
个 DNA 分子可以得到富集，每个微珠代表着一个
克隆集落。测序过程中，GS FLX 系统会将引物上
dNTP 的聚合与荧光信号释放偶联起来，通过检测荧
光信号达到 DNA 测序的目的。例如，林平等［14］通
过 Roche 454 GS FLX 测序技术对病原菌 16S rDNA
的分析检测病人痰中细菌。从 101 例样本中发现了
129 个菌属，其中大量的是临床不易培养的菌属，
如支原体属、嗜血杆菌属、莫拉菌属等，而临床培
养 出 的 细 菌 只 有 12 种。 由 此 可 见，Roche 454 GS
FLX 技术能将信息量巨大的 DNA 集转化为具体的种
属。与传统的 Sanger 测序相比较，NGS 在很多技术
上都有了突破，包括文库的构建、锚定桥接、预扩
展等等，使得上百万的测序反应同时发生在一个反
应里［15］，既降低了测序成本，也缩短了测序时间。
尽管读取准确度以及读取片段的长度都不及 Sanger
测序，但这些不足可以通过测序的覆盖率和生物信
息学的方法来克服，在很短的时间内完成对上百亿
碱基的测序，可实现极短时间内对 eDNA 序列进行
细致的研究。
1.2 DNA宏条形码技术
DNA 条形码的主要作用是用于物种水平的鉴
别，通过所得的 DNA 序列与标准条形码（Standard
barcoding）比对，就可以知道目标生物的种类。自
2002 年，Tautz 等［16］提出要用 DNA 序列作为生物
分类系统的主要平台，即 DNA 分类学后，加拿大
Guelph 大学的动物学家 Hebert 等［17］ 在 2003 年明
确 提 出 了 DNA 条 形 码（DNA Barcoding） 的 概 念。
如今已有专门的 DNA 条形码数据库（International
barcode of life），10 年来超过 10 万个物种的 DNA 条
形码数据的信息存储其中。但发展至今，传统的
DNA 条形码已经不能满足人们在 eDNA 应用中的需
求。首先，与提取的组织 DNA 不同，eDNA 通常受
到不同程度的降解，甚至会降解掉 DNA 条形码部
分的片段。其次，eDNA 来源复杂，包含着所属环
境的所有物种的 DNA，如 CYTB、16S rRNA、COI、
rbcL 和 ITS rDNA 等传统的条形码鉴定出的群落物种
只能算是冰山一角。所以，Pompanon 等［18］在 2011
年提出了一种新型 DNA 条形码，即 DNA 宏条形码
（DNA metabarcoding），但是该概念目前还没有一个
非常具体和权威的定义。其作用并不是用于鉴别单
2014年第10期 51徐浩等：环境 DNA研究技术及其在生态学领域的应用
一、少许的样本，而是用于多重分类单元的分类鉴
定。通过合理的通用引物设计和宏 DNA 条形码选择
可以做到对环境群落物种进行准确的分类鉴定。然
而，就目前的宏条形码技术发展的水平而言，全面
的鉴定环境生物还存在着非常大的挑战。例如，如
何合理的选择 DNA 宏条形码以及通用引物的设计。
对此，Pompanon 等［19］在利用 NGS 技术检测动物食
性的研究中对该难题做了详细的探讨，为更深入开
发宏条形码技术提供了宝贵意见。
2 eDNA 在生态学中的应用
eDNA 应用的最核心的手段是能够对复杂的宏
量生物环境样本 DNA 进行准确分类，可以说 eDNA
应用于分类是对传统分类学方法的一次革新，并且
随着 NGS 技术的出现极大地降低了测序成本，使得
一些研究者敢于做一些以前受技术限制和经费限制
的实验，大大拓展了研究领域。下面将近年来 eDNA
技术在生态学中的最新应用作了回顾。
2.1 物种多样性研究
随着全球气候变化和人类活动的影响，生物多
样性保护的重要性愈加突出，生物多样性已开始成
为国内外研究的热点，而物种多样性作为生物多样
性最基础的研究内容，准确鉴别物种就显得尤为重
要。传统形态学分类方法对研究人员的专业知识和
实践经验要求高，鉴定物种费时费力，准确性也不
高。借助分子生物学方法来鉴定物种［20-25］，解决了
形态学鉴定方法的诸多弊端，而 NGS 技术和 eDNA
应用的出现可以说是在前面方法的基础上更进一步。
目前已经有少量关于 eDNA 应用于物种多样性研
究的文献报道。例如，Blaalid 等［26］对拳参属植物
（Bistorta vivipara）演替过程中与其处于共生关系的
外生菌根真菌多样性以及分布情况进行了研究。从
60 个根系中提取真菌 eDNA，通用引物 PCR 扩增后
采用 Roche 454 GS FLX 测序，进行数据分析后得到
470 个操作分类单位（OTUs），每个根系的 OTUs 在
8-41 个之间，并发现了真菌的多样性沿着顶极植被
逐渐增多，其中根担子菌是优势菌株 ；Philip 等［27］
通过对丹麦港口海域的鱼类物种多样性进行评估发
现，该海域中有 15 种鱼类。既包括重要的经济鱼类，
如大西洋鳕、欧洲鳗鲡、欧鲽和大西洋鲱鱼，也有
非经济鱼类，如短角大杜父鱼、尖海龙及岩梳隆头
鱼，同时还发现欧洲沙丁鱼——洄游鱼类。除此之外，
他们还发现了多种鸟类，包括红喉潜鸟、原鸽、疣
鼻天鹅和鸬鹚。另外，与常规的 9 种鱼类多样性调
查方式相比发现，利用 eDNA 除了能检测出传统方
法调查到的鱼类，还能检测到用传统方法不能调查
到的鱼类。以上说明 eDNA 技术能成功应用于物种
多样性研究，有助于更加全面的了解物种资源情况。
2.2 水生动物生物量的估测
一直以来，人们对植被生物量评估方法研究比
较多［28-30］，而在动物生物量评估方面的研究相对
较少。其中一个重要的原因是动物好动、易躲藏且
难以捕捉，为调查带来了诸多的困难。目前，科学
家们仍没有找到一种合适的方法能对动物进行量的
评估。但是最近出现的应用 eDNA 对鱼类生物量进
行评估的文献报道，其方法可能对动物生物量评估
的研究起到促进作用。为 Teruhiko 等［31］对日本的
“Iba-naiko”湖中的鲤鱼进行生物量的评估。他们提
出了一个假设——某物种的生物量与其释放在环境
中的 DNA 成正比，那么通过检测该物种的 eDNA 浓
度就可以反映出其在环境中的生物量。首先，在实
验室和池塘里模拟野外环境，探索 eDNA 和鲤鱼数
量的线性关系，证明了 eDNA 浓度与鱼的数量呈正
相关，并建立线性方程。然后，取样于“Iba-nailo”
湖中的湖水，估测鲤鱼在湖中的数量以及分布，结
果发现温度越高的地方鲤鱼的数量越多。与传统捕
捞方式相比，前者采样不受复杂的地质和灌木条件
影响，且对环境不会造成任何破坏。通过这种方法
我们可以更快的估计出物种生物量。尽管以上结论
的准确度以及在未来的适用性还有待进一步验证，
但其研究方法能为未来在改进生物量评估手段上提
供很好的思路，相信在濒危物种的保护，以及水产
养殖的科学管理等领域中应用前景广阔。
2.3 动物食性分析
食性分析最早是通过消化残留物观察法和肠道
解剖法。对于通常所熟知的动物可以通过此方法在
一定程度上得以了解，但对于无脊椎动物、夜行性
以及生活在土壤和水下的生物通过视觉观察是很难
做到的［32］。另外，显微观察具有一定的局限性，它
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期52
依赖于观察者对咀嚼后半消化食物碎片的准确判
断［33-36］。为了能更准确的研究动物的食性，生态学
家从分子生物学方法上着手，具体的技术包括蛋白
免疫印迹［37］、近红外线光谱（Near infrared spectro-
scopy，NIRS）［38］、稳定同位素分析［39］、温度 / 变
性梯度凝胶电泳（Temperature gradient gel electropho-
resis，TGGE/Denatured gradient gel electrophoresis，
DGGE）［40］。但是每种技术都有各自的优缺点，并
且适用性不一［32］，如蛋白免疫印迹技术适合于研
究狭食性的捕食者［41］，对于宽食谱的动物就无能
为力了 ；NIRS 技术方便检测植食性动物消化的总
氮［42］，但很难分析出食物中具体的植物种类 ；稳定
同位素分析技术主要用于研究动物在一段较长时期
内的摄食情况，而不仅仅是短期的一个摄食情况［43］；
TGGE/DGGE 技术主要用于研究动物的肠道、粪便
等微生物群落［44，45］，在研究动物食性方面常常受
到 DNA 条带分离技术的限制。近年来 eDNA 也开始
被应用于动物食性的研究，其最大的优势在于能分
析出动物短期的食物。如 Shehzad 等［46］研究了一种
生活在野外的、人们对其食性了解甚少的豹猫的食
性，他们从 38 只豹猫粪便中提取了 eDNA，序列分
析后发现其食物包括鱼类、两栖动物、鸟类、哺乳
动物共 18 种生物。另外，应用 eDNA 技术研究食性
的报道还包括海狗、企鹅、蝙蝠、熊、田鼠和蠕虫
等［47-52］。可见，eDNA 应用于动物食性研究潜力巨大，
再结合之前的分子生物学方法取长补短，相信能在
全面了解动物的食性方面取得更大进展。
2.4 重建古植物史
目前研究古植物学主要还是通过植物大化石和
孢子花粉地质记录的方法。大化石包括根、茎、叶、
孢子囊穗或球果等，因其肉眼可见，保存形式多样、
信息较全，研究历史悠久，但无论是动物界还是植
物界，能保存成化石者只是其极细小的一部分，导
致地质记录严重不全［53］。与此相反，孢子花粉产量
非常高［54］，并且其外壁大多由孢粉素组成，非常坚
固，强酸强碱和一定程度的高温高压对其影响不大，
保存能力极强［55］，但许多孢子花粉植物亲缘关系目
前仍分不清楚［53］，很难对古植物群系进行准确描
述，故以上两种研究方法都存在各自的局限。近年
来，有大量通过分析沉积古 DNA（sedaDNA）来研
究古环境的文献报道［56-63］，其方法是提取保存至今
的古 eDNA，通过 NGS 测序得到 eDNA 基因组，分
析其序列然后将古植物进行分类。例如，Mikkel 等［63］
通过对南格陵兰岛湖底层沉积物中古 DNA 的序列分
析重建了格陵兰岛的古植物群系，并将 eDNA 方法
和传统的两种方法所得出的结果相对比。从采集的
38 个样本中，通过 Roche 454 GS-FLX 测序法得到了
252 902 个 DNA 序列，数据分析出古湖中古植物包
括 13 个科。而传统的孢子花粉和大化石地质记录分
别是 36 个科和 17 个科，检测到的数量都比 eDNA
法多，但是后者有 2 个科却在前两种方法中没有记
录。因此，eDNA 应用对前两种方法的研究起到查
漏补缺的作用。不仅如此，eDNA 法与前两者的检
测结果也有部分重叠，对传统的检测结果起到了验
证的效果。可见，将 3 种方法相结合能更准确地描
述古植物史。
3 展望
至今，环境生态学研究仍然面临方法有限、采
样空间局限、数据处理慢及监测结果不准等问题［64］。
但是近年分子生物学技术的应用开启了生态学领域
的一场革命，有了 NGS 等技术的支撑，将极大地提
升人类从生态系统中获取数据的能力，其监测模式
的核心思想就是利用 eDNA 结合 NGS 技术平台快速
准确的对环境生物进行分类鉴定以及生物多样性和
物种分布的调查。但是，目前 eDNA 技术的应用在
满足人们对环境信息采集的同时也面临着很大的挑
战。首先，尽管人们有能力得到环境基因组序列，
但是在信息处理方面的能力还显不足。虽然各种统
计建模在环境应用中并不陌生，但是环境基因组因
其序列来源极度复杂、采集数据的稳定性影响因子
多，使得统计建模变得更加困难。其次是 eDNA 数
据的储存问题，随着 eDNA 应用越来越多，将会累
积大量的数据，仅仅一个环境样本就会产生千万数
量级的 DNA 宏条形码，这就需要有更大容量的数据
库来存储，就像“GenBank”一样，将有用的数据进
行有效的管理和分享［65］。总之，长远来看，eDNA
技术将替代一些传统技术，但是在大多数情况下它
与传统方法有机结合相互补充才能够发挥更好效果，
2014年第10期 53徐浩等：环境 DNA研究技术及其在生态学领域的应用
这需要生态学家、生物信息学家和统计学家的密切
协作才能实现。目前，eDNA 研究尚处于初级阶段，
其应用和发展前景非常广阔，这些新方法的应用将
促进人们了解从分子到整个生态系统各个层次的组
织结构和相互作用，整合生态学的思想也许将改变
传统上人们对生态学的认识。
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（责任编辑 狄艳红）