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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
碱性磷酸单酯酶（Alkaline phosphatase，AKP，
EC3.1.3.1）是一种能催化各种磷酸单酯水解释放出
无机磷的酶，通常以前体的形式广泛存在于原核及
真核生物的外周胞质中，最终在膜通道中形成成熟
的碱性磷酸单酯酶［1］。该酶是一种非特异性的水解
酶，能水解赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸组成的肽
键、酰胺键及酯键等［2］。作为一种膜结合蛋白，一
般可从小牛、猪和鸡等动物的肠粘膜上提取［3］，但
收稿日期 ：2012-12-10
基金项目 ：河南省科技厅科技攻关项目（112102210299），河南省教育厅自然研究计划项目（2011A180026）
作者简介 ：高启禹，男，硕士，讲师，研究方向 ：酶与酶工程 ；E-mail ：gaog345@163.com
壳聚糖修饰的 PLGA 纳米颗粒固定化碱性磷酸
单酯酶的技术研究
高启禹1  李宏彬2  陈红丽1  孔雨3  周晨妍1
（1. 河南新乡医学院生命科学技术学院 河南省遗传性疾病与分子靶向药物重点实验室培育基地，新乡 453003 ；2. 河南新乡医学院公共卫生
学院，新乡 453003 ；3. 河南师范大学生命科学学院，新乡 453003）
摘 要 : 以合成的壳聚糖修饰的乳酸－羟基乙醇酸共聚物（PLGA）为材料，戊二醛为交联剂，固定了在重组大肠杆菌中表
达的碱性磷酸单酯酶，并通过单因素分析及正交试验探讨了酶固定化的最优条件。结果显示，在纳米颗粒质量分数 50 mg、戊二醛
体积分数 4%、交联时间 2.0 h、固定化时间 9.0 h 条件下，固定化酶的酶活回收率可达 76.2%，同时固定化酶反应的最适温度、最
适 pH 值及热稳定性酸碱稳定性得到了拓宽，从而为该酶的进一步应用奠定基础。
关键词 : 纳米材料 壳聚糖 -乳酸 -羟基乙醇酸 碱性磷酸单酯酶 固定化酶
Study on the Technology of CS-PLGA Nanospheres Immobilized
Alkaline Phosphatase
Gao Qiyu1 Li Hongbin2 Chen Hongli1 Kong Yu3 Zhou Chenyan1
（1. College of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Henan Key Laboratory of Hereditary Disease and Molecular Target
Drug Therapy（Cultivating Base），Xinxiang 453003 ；2. College of Public Health，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003 ；
3. School of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453003）
Abstract:  Alkaline phosphatase expressing in recombinant E. coli was immobilized on Chitosan-poly （lactic-co-glycolic acid） by
using glutaraldehyde as cross-linking reagent. The immobilization conditions and characterization of the immobilized enzyme were obtained
through single factor and orthogonal experiment. The results showed that the best condition of immobilization was optimal when the CS-PLGA
nanoparticles concentration was 50 mg, the volume fraction of glutaraldehyde was 4%, cross-linked time was 2.0 h and immobilized time was 9.0 h,
the immobilized enzyme can keep activity about 76.2%. At the same time the optimal temperature, the optimal pH, the thermal stability and pH
stability of alkaline phosphatase were comparatively improved after immobilization. So it confirmed that the technology would form basis of the
further application of immobilized alkaline phosphatase.
Key words:  Nanoparticle Chitosan-poly（lactic-co-glycolic acid） Alkaline phosphatase Immobilized enzyme
由于从动物体所获得的目的蛋白在稳定性、材料来
源及分离纯化上存在严重的缺陷，因此影响着 AKP
在 DNA 体外重组及化妆品等领域的广泛应用。同时
作为分离获得的游离酶，在保质期、重复利用率、
应用成本及稳定性上往往无法满足生产需要。因此
选用一定的固定化材料对游离酶进行固定，可有效
改善酶的应用范围及应用价值。目前纳米材料已成
为酶固定化新型载体研究的热点，已在酶的固定化
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期200
研究中得到了广泛的探讨［4，5］。壳聚糖修饰的乳酸－
羟基乙醇酸共聚物（PLGA）作为纳米材料，能够体
现纳米载体良好的生物相容性、较大的比表面积、
较小的颗粒直径、较小的扩散限制、有效提高载酶
量及在溶液中能稳定存在等优点［6］。
本研究在重组大肠杆菌碱性磷酸单酯酶基因
的克隆、表达及纯化的基础上，通过合成的壳聚
糖 -PLGA 纳米材料为载体，对碱性磷酸单酯酶进行
了固定，同时采用戊二醛为交联剂，优化 AKP 的固
定化条件，探讨固定化酶与游离酶的酶学特性，旨
在为该酶的进一步应用提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
PLGA（M=10 000-30 000，乳酸与羟基乙醇酸
的摩尔比为 50∶50，山东省医疗器械研究所），壳
聚糖（低分子量，脱乙酰度 85%，Sigma 公司），重
组大肠杆菌 phoA（由华东理工大学分子生物学实验
室提供），Sephadex G-75、DEAE-纤维素（北京鼎国
生物技术有限公司），谷胱苷肽（氧化型、还原型）、
尿素、琼脂糖、戊二醛等试剂采购于国药集团化学
试剂有限公司。
1.2 方法
1.2.1 CS-PLGA 纳米粒的制备 采用超声乳化法制
备纳米粒，见参考文献［7，8］。
1.2.2 碱性磷酸单酯酶的分离与纯化 将含有外源
基因的重组菌培养后收集培养液，4 000 r/min，常温
离心 20 min 后收集菌体并超声破碎，将破碎液在 4℃、
12 000 r/min 下离心 20 min，弃上清液，在沉淀中加
入 6 mL 去离子水，搅拌后于 4℃、12 000 r/min 下
离心 20 min，重复洗涤后保留沉淀。在沉淀中加入
1 mL 溶解液（8 mol/L 尿素），搅拌并于 4℃冰箱放
置溶解 2 h。其后在 4℃、12 000 r/min 下再离心 20
min，得上清液。在冰浴条件下缓慢加入复性液（0.01
mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液 +1 mmol/L 氧化型谷胱
苷肽 +1 mmol/L 还原型谷胱苷肽的混合液 +1 mmol/L
MgCl2+0.16 mol/L 尿素），同时用玻棒轻轻搅匀后置
于冰箱复性 48 h，测活。
将 粗 酶 液 采 用 DEAE-纤 维 素 凝 胶 及 Sephadex
G-75 凝胶层析后洗脱、浓缩、透析，获得纯化的碱
性磷酸单酯酶液。
1.2.3 标准曲线的建立 标准曲线的建立见参考文
献［9］。在 405 nm 处测吸光值，得标准曲线，其线
性回归方程为 ：y=1.242 9x-0.054 3，R2=0.991 8。结
果表明对硝基苯酚在此浓度范围内与吸光度呈良好
的线性关系，可以用于酶活力的测定。
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
0.8 1
y=1.2429x-0.0543
R2=0.9918
0
p-Nitrophenolmg/mL
O
D
40
5n
m
0.60.40.2
图 1 对硝基苯酚标准曲线
1.2.4 碱性磷酸单酯酶酶活测定 以对硝基酚磷酸
二钠为底物，根据水解磷酯键所产生的对硝基酚量
测定酶活力。在 37℃、pH10.0 条件下，每分钟转化
产生 1 μmol/L 对硝基酚的酶量为 1 个酶单位。具体
为 ：分别在试管中加入 250 μL、0.02 mol/L 对硝基
酚磷酸二钠及 750 μL Na2CO3-NaHCO3（pH10.0，0.1
mol/L）的底物缓冲液，混匀，在水浴 37℃预热 5
min，加入 250 μL 酶液（空白对照管用缓冲液替代），
立即混匀后，37℃保温反应 20 min。立即加入 0.5
mL 0.5 mol/L NaOH 溶液终止反应，于分光光度计中
测定 A405 值。固定化酶活力测定时用一定量的固定
化酶替换原酶液并用缓冲液定容，测定相应吸光值
并确定相对酶活力。
相对酶活力 ：以同组试验中酶活最高点的值记
为 100，相对酶活为其他试验点酶活值与该值之比。
固定化酶活力回收率（%）= 固定化酶活力 / 投
入的游离酶活力 ×100%
1.2.5 碱性磷酸单酯酶的固定化 取 50 mg CS-PL-
GA 纳米粒，加入 1 mL Tris-HCl 缓冲液（0.05 mol/L，
pH7.6）充分搅拌后超声 15 min。再加入 10 mL 分离
纯化的酶溶液，在 4℃搅拌吸附 2 h 后用 4% 的戊二
2013年第5期 201高启禹等 ：壳聚糖修饰的 PLGA 纳米颗粒固定化碱性磷酸单酯酶的技术研究
醛溶液交联 1.5 h。再于 4℃下固定 10 h，离心弃去
上清液，再用缓冲液洗去固定化酶表面游离酶后得
固定化酶，4℃保存备用。
1.2.6 正交试验数据处理方法 依据单因素试验结
论，进行正交试验设计，优化碱性磷酸单酯酶的固
定化条件。
2 结果
2.1 纳米材料的电镜扫描分析
纳米粒的扫描电镜显示（图 1），未被壳聚糖修
饰的 PLGA 纳米粒球状形态较规则（图 1-A），相互
间结合度较小，而被修饰的纳米材料结合较紧密（图
1-B），说明 PLGA 纳米粒表面被壳聚糖进行了有效
修饰。
的影响因素为研究对象，探讨在单因素条件下固定
化酶的相对酶活力。
2.3.1 CS-PLGA 纳米粒的质量分数对固化酶活力的
影响 由图 3 可知，CS-PLGA 纳米颗粒的质量分数
对固定化酶的活力有一定的影响，当质量分数浓度
高于 50 mg 时，固定化酶的相对活力有所下降，可
能较高浓度的载体在扩散限制、有效载酶量等方面
影响酶促反应的进行。
A B
图 1 纳米粒子的电镜扫描
2.2 突变酶的表达及纯化
SDS-PAGE 分析（图 2）表明，重组大肠杆菌
中碱性磷酸单酯酶得到了高效表达，同时经凝胶层
析后获得了纯度较高的酶液，其分子量介于 43-66.2
kD 之间，与 AKP 的理论分子量约 50 kD 相符合。
M 1
79.4
kD
66.2
43.0
31.0
20.1
2 3
50
kD
M ：蛋白 Marker ；1 ：上清液 ；2 ：透析袋浓缩后的上清液 ；
3 ：过柱后合并的上清液
图 2 SDS-PAGE 分析凝胶层析产物
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20
CS-PLGA䍘䟿࠶ᮠmg
30 40 50 60 70 80
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
图 3 CS-PLGA 纳米粒质量浓度对固定化酶活力的影响
2.3.2 戊二醛体积分数对固化酶活力的影响 采用
双功能试剂戊二醛进行交联固定对酶的固定化效果
具有重要影响。图 4 表明，在戊二醛浓度较低时，
酶的结合量少，因而固定化酶活性较低。但当戊二
醛浓度过高时，过多的戊二醛与酶结合，使酶的空间
刚性增加，柔性降低，从而影响酶与底物的结合，
其适宜的戊二醛浓度约为 4%。
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 ᠺҼ䟋փ〟࠶ᮠmL/L
R
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zy
m
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ity
%
4 6 8
图 4 戊二醛体积分数对固定化酶活力的影响
2.3 单因素试验结果
设定固定化方法中其他影响因子不变，以选择
2.3.3 交联时间对固定化酶活力的影响 由图 5 可
知，固定化碱性磷酸单酯酶的活力在交联时间 1.5 h
时最高。主要是由于低于 1.5 h 时，戊二醛和酶蛋白
的结合不完全，而高于 1.5 h 时，过多的醛基对酶分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期202
子本身进行了相应的修饰，致使固定化酶活力降低。
据其 K 值判断组成的最优组合为 A2C3B2D1，即最佳
固定化条件为纳米颗粒质量分数 50 mg、戊二醛体
积分数 4%、交联时间 2.0 h、固定化时间 9.0 h。经
验证试验，在极差分析得到的最佳条件下，测得固
定化酶的酶活回收率为 76.2%。
2.4 固定化和游离酶最适pH值及pH稳定性
酶分子在水溶液环境中的解离状态和酶与底物
的亲和力都受到 pH 的影响。经标准差（SD）分析
及图 7 显示，AKP 被固化后其最适反应 pH 值有所
变化，pH 分别由 9.5 变化为 10.0，且保持了较高的
活性。同时对热稳定性的研究（图 8）发现，在碱
性条件下，固定化酶更稳定。
0
20
40
60
80
100
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Ӕ㚄ᰦ䰤h
R
el
at
iv
e
en
zy
m
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tiv
ity
%
图 5 交联时间对固定化酶活力的影响
2.3.4 固定化时间对固定化酶活力的影响 由图 6
可以看出，固定化酶的活力受固定化时间的影响。
在固定化时间为 10 h 时，固定化酶的活力达到最大
值。同时由于酶与载体的结合需要相应的时间，因
此固定化初期其酶活较低，但在达到最大值后，延
长固定化时间会导致酶交联程度过高，形成的载体
结构对酶的结合能力降低，从而影响到酶促反应的
速率。
90
100
80
70
60
50
40
30
20
10
0
5 6 7 8 9 10 11 12പᇊॆᰦ䰤h
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
13 14 15 16
图 6 固定化时间对固定化酶活力的影响
2.3 CS-PLGA纳米材料固定木聚糖酶的条件优化
由表 1 和表 2 可知，对于固定化碱性磷酸单酯
酶的活力，根据极差分析 R 值可以看出，影响固定
化酶酶活的因素主次顺序依次为 A、C、B、D，根
表 1 因素水平表
水平
CS-PLGA 质量
分数 （A）（mg）
戊二醛体积分
数（B）（%）
交联时间
（C）（h）
固定化时间
（D）（h）
1 45 3 1.0 9
2 50 4 1.5 10
3 55 5 2.0 11
表 2 正交试验结果分析
水平 A B C D 相对酶活力（％）
1 1 1 1 1 78.7
2 1 2 2 2 89.6
3 1 3 3 3 86.2
4 2 1 2 3 92.2
5 2 2 3 1 100.0
6 2 3 1 2 88.6
7 3 1 3 2 85.3
8 3 2 1 3 77.9
9 3 3 2 1 85.6
K1 254.5 256.1 245.2 264.3
K2 280.7 267.5 267.4 263.5
K3 248.9 260.4 271.5 256.3
K1 84.8 85.4 81.7 88.1
K2 93.6 89.2 89.1 87.8
K3 83.0 86.8 90.5 85.4
R 10.6 3.8 8.8 2.7
100
120
80
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
40
60
20
0
7 8 9 10
pH
11 12 13
Free enzyme
SD=33.7
Immmobilized
enzyme
SD=28.6
图 7 pH 对游离酶及固定化酶酶活力的影响
2013年第5期 203高启禹等 ：壳聚糖修饰的 PLGA 纳米颗粒固定化碱性磷酸单酯酶的技术研究
2.5 固定化木聚糖酶的最适温度和热稳定性
温度对酶活性有显著影响，在一定的温度范围，
由于产生了更多的活化分子而使酶的活性升高，但
温度过高会引起蛋白变性，导致酶活性逐渐丧失。
图 9 显示，游离酶与固定化酶的最适温度未发生明
显变化，均为 45℃，但经 SD 分析发现，固定化酶
的适应温度范围较自由酶更加广泛。同时对固定化
酶的热稳定性研究（图 10）发现，在 45℃水浴保温
90 min 后，固定化酶的活性保持在 60% 左右，而游
离酶的活力约为 40%，说明酶被固定化后其热稳定
性有所增强。
3 讨论
自酶固定化技术诞生近百年以来，各种固定化
载体材料获得了大量研究，特别是随着纳米技术的
发展，纳米材料作为固定化酶的新型载体，在酶的
固定化应用上体现了极高的表面积 / 体积比，致使
固定化的物质集中化，从而提高了酶的固载量，获
得了较优良的固定化酶。但是在对不同酶进行纳米
材料固定化的应用研究中发现，单一地采用未经修
饰的纳米材料的固定化效果往往会因为材料本身的
自我团聚而导致酶活性的严重下降［10］。因而采用某
些试验技术，在合成的纳米载体表面引入不同的化
学 基 团（ 如 -CHO、-NH、-OH、-COOH、-SH 等 ），
或连接上具有特殊功能的大分子物质（如糖类、酯
类等），从而构建具有复合功能的纳米材料。研究表
明，复合材料的固定化效果更加明显，能在保持较
高酶活的同时，拓宽了酶的稳定性，改善了酶的操
作半衰期等［11］，从而为提高酶的工业化应用奠定了
较好的应用前景。
4 结论
通过对 PLGA 纳米材料载体进行壳聚糖的修饰，
获得了复合材料 CS-PLGA，同时采用戊二醛为交联
剂，对在重组大肠杆菌中表达的碱性磷酸单酯酶进
行了分离纯化和固定，探讨了酶的最佳固定化条件。
通过单因素分析、正交设计研究发现，在纳米颗粒
质量分数 50 mg、戊二醛体积分数 4%、交联时间 2.0
h、固定化时间 9.0 h 条件下，固定化酶的活力最高。
同时对游离酶及固定化酶的最适 pH、最适温度及
pH 稳定性和热稳定性进行了相应的探讨，研究发现，
AKP 采用纳米载体 CS-PLGA 固定后，拓宽了其最适
反应条件及其稳定性。
参 考 文 献
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Free enzyme
SD=6.6
Immmobilized
enzyme
SD=5.2
100
120
80
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
40
60
20
0
7 8 9 10
pH
11 12 13
图 8 游离酶及固定化酶的 pH 稳定性
Free enzyme
SD=27.7
Immmobilized
SD=18.4
100
120
80
R
el
at
iv
e
en
zy
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e
ac
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ity
%
40
60
20
0
20 30 40⑙ᓖć 50 60
图 9 温度对游离酶及固定化酶的影响
Free enzyme
SD=25.9
Immmobilized
SD=19.3
100
120
80
R
el
at
iv
e
en
zy
m
e
ac
tiv
ity
%
40
60
20
0
200 40⑙ᓖć 80 10060
图 10 游离酶及固定化酶的温度稳定性
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（责任编辑 马鑫）