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CP7菌株抗菌物质对真菌的活性及其作用机制研究



全 文 :·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第9期
收稿日期 : 2012-02-24
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目(30570036)
作者简介 : 黄旭华 , 男 , 硕士研究生 , 助理研究员 , 研究方向 : 家蚕病理与蚕病防治技术 ; E-mail: hgjsoil@163.com
通讯作者 : 廖富蘋 , 女 , 教授 , 研究方向 : 家蚕病理学与昆虫分子生物学 ; E-mail: fpliao@scau.edu.cn
在芽孢杆菌产生的抗菌肽中,多数抗细菌,只
有少数抗真菌,而且在抗真菌多肽中,多数抑菌活
性不强,抗菌谱窄,不能同时抑制丝状真菌和酵母
菌[1, 2]。CP7 菌株是一株属多黏类芽孢杆菌(Paenib-
acillus polymyxa)的新菌株[3],其发酵液具有强烈
的抑菌作用,经课题组系统研究发现,CP7 抗菌物
质对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌均有活性
作用,其中抗革兰氏阳性菌组分是具有 23 个氨基酸
残基的碱性多肽 Cpacin[4],抗革兰氏阴性菌组分是
多黏菌素 polymyxin [5],β-1,3-1,4-葡聚糖酶是 CP7
抗菌物质中抗真菌的活性组分或其中之一[6],且三
者之间没有交叉拮抗作用。陈迎等[7]分析了 CP7 抗
CP7菌株抗菌物质对真菌的活性及其作用机制研究
黄旭华1,2 廖富 1 林健荣1 朱方容2 林强2 汤庆坤2 黄深惠2
(1 华南农业大学动物科学学院,广州 510642 ;2 广西区蚕业科学研究院,南宁 530007)
摘 要: 旨在研究多黏类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)CP7菌株分泌的抗菌物质对玉米大斑菌和白色念珠菌的活性作
用。结果显示,CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌和白色念珠菌的菌丝、孢子生长有强烈的抑制作用,CP7菌抗菌物质处理后,玉米
大斑菌的菌丝出现畸形、扭曲,细胞外壁皱缩,原生质发生凝聚,产生空泡,细胞器消溶,核区出现核固缩等现象;白色念珠菌
的细胞壁和细胞膜模糊,原生质有凝聚现象,细胞器消溶,细胞核变形。推测 CP7菌株抗菌物质是破坏真菌的细胞壁和细胞膜结构,
形成通道,引起内容物外渗,破坏细胞内部结构,使原生质凝聚,细胞核固缩,最终使菌体死亡。
关键词: CP7菌株 多黏类芽孢杆菌 抗菌物质 玉米大斑菌 白色念珠菌 抗菌活性
Study on Antibacterial Activity and Mechanism of Antimicrobial
Substance Extracted from CP7 Strain Against Fungi
Huang Xuhua1,2 Liao Fupin1 Lin Jianrong1 Zhu Fangrong2 Lin Qiang2 Tang Qingkun2 Huang Shenhui2
(1College of Animal Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642;2Guangxi Academy of
Sericulture Sciences,Nanning 530007)
Abstract: Antimicrobial substance produced by Bacillus sp. CP7 was studied for its activity to inhibit Exserohilum turcicum (Pass.)
Leonard & Suggs and Candida albicans. The result showed that the CP7 antimicrobial substance had an strong inhibition on the mycelial and
spore growth of Exserohilum urcicum (Pass.) Leonard & Suggs and Candida albicans. The hyphae of Exserohilum urcicum (Pass.) Leonard &
Suggs became malformed and twisted, the external cell wall was shrinkage, and the bioplasm of the hypha occurred agglutinating and vacuoles in
the middle, the cell organs were dissolved partly, the nucleus appeared stone pycnosis. The CP7 antimicrobial substance had a certain inhibition
on the spore germinating, germ tube growth and germ tube forming spore of the Candida albicans, the cell wall and the membrane of the Candida
albicans were all faintness, its protoplasm had a agglomerate phenomenon, its organelles were dissolved partly, and its nucleus was deformed.
Therefore, the mechanism of the CP7 antimicrobial substance to fungi was showed that the cell wall and membrane of fungus was breaking, and
forming the channels which caused the inner substance exosmosis, so as to destroy the interior structure, the bioplasm became agglutinating, the
stone pycnosis of nucleus appeared, and finally resulted in the cell perished.
Key words: Strain CP7 Paenibacillus polymyxa Antimicrobial substance Exserohilum turcicum Candida albicans Antibacterial
activity
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期126
菌物质粗提液对革兰氏阳性菌(黑胸败血菌)的杀
菌机制 ;陈海英等[8]分析了 CP7 抗菌物质粗提液
对荔枝霜疫霉菌的抗菌活性及作用机制。为了深入
探讨 CP7 菌抗真菌活性物质对真菌的抗菌谱和作用
机理,本研究选择对玉米危害性强的丝状真菌玉米
大斑菌和人畜常见的酵母菌白色念珠菌为作用对象,
研究其对真菌不同发育时期的活性作用,从未来生
产开发和实际利用的角度考虑,采用 CP7 菌抗菌物
质粗提液而不是单一的抗菌蛋白组分,探讨其对真
菌的作用机理,以期为该菌株抗菌物质的开发利用
提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
CP7 菌株由课题组分离获得(2005 年送交中国
典型培养物保藏中心保存。武汉,编号 CCTCCNo :
M205119);玉米大斑菌(由华南农业大学资环学
院方羽生教授分离和馈赠)和白色念珠菌(CMCC
10231),YEPD 培 养 基(Yeast extract 1%,Tryptone
2%,葡萄糖 2%)、发酵培养基(豆麸 5%,可溶性
淀粉2.7%,MgSO4·7H2O 0.1%,K2HPO4·3H2O 0.15%)、
PDA 培养基(马铃薯汁 20%,葡萄糖 1.5%,1.5%
琼脂粉)、1640 培养基、沙氏培养基(Tryptone 1%,
葡萄糖 4%,0.025% 氯霉素,2.0% 琼脂粉)。
1.2 方法
1.2.1 CP7 菌株抗菌物质粗提液的制备 将 CP7 菌
株接种于 5 mL YEPD 液体培养基中,30℃,180 r/min
培养过夜,然后以 1% 接种于发酵培养基中,30℃,
180 r/min 振荡培养 48 h,发酵液在沸水浴中加热 20
min,离心(10 000 r/min,30 min)后收集上清液即
为抗菌物质粗提液,于 4℃保存备用。
1.2.2 CP7 菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝生长和孢
子形成的抑制作用 参照李树正[9]方法使玉米大斑
菌生长同步化,将斜面菌种接种于 PDA 平板,培养
至形成菌落,用打孔器打取菌落边缘菌块作为接种
物,转接到新的 PDA 平板上,25℃培养至菌落形成
约 4 cm,用打孔器打取菌落边缘菌块,即得生长相
对一致的接种物。CP7 菌抗菌物质对玉米大斑菌生
长的影响采用含药培养基培养法,即将 CP7 菌抗菌
物质粗提液加入培养基中,制成分别含 10%、30%、
50%、70% 和 90% 抗菌物质的平板培养基,以未加
抗菌物质(0%)组作为对照,然后接种菌块,25℃
培养,每隔 24 h 测一次菌落直径,培养 120 h,检测
菌丝生长情况,菌丝生长抑制率 =(对照组菌落直
径 - 处理组菌落直径)/ 对照组菌落直径 ×100%[10];
将培养120 h的菌落,用打孔器于距菌落边缘3-4 mm
处打取菌块,挑取表面菌丝制成水玻片,在显微镜
下观察孢子形成数目。
1.2.3 CP7 菌抗菌物质对玉米大斑菌孢子萌发的抑
制 接种玉米大斑菌于 PDA 斜面上,25℃培养 5 d,
用 10 mmol/L 磷酸盐缓冲液冲洗下孢子,4 层纱布过
滤,除去菌丝,得到孢子悬浮液。在 96 孔板中分别
加入 90 μL 孢子悬浮液和 150 μL 1640 液体培养基,
再分别加入 20 μL CP7 菌抗菌物质粗提液和 140 μL
无菌水,得到含 5.0% 粗提液的孢子处理液,同样方
法制得含 10%、15%、20%、25% 和 30% 粗提液的
孢子处理液。25℃培养 12 h,在倒置显微镜下观察
(200×)孢子萌发情况。
1.2.4 CP7 菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝形态和细
胞超微结构的影响 将玉米大斑菌的孢子接种于
1640 液体培养基中,25℃静止培养 24 h,形成菌丝
悬浮液,加入 CP7 菌抗菌物质粗提液,使粗提液最
终浓度为 40%,以无菌水处理作为对照,处理 8 h,
利用显微镜(600×)观察菌丝形态的变化 ;接种
玉米大斑菌于 PDA 平板上,25℃培养 5 d,形成菌
落,在菌落边缘滴入 CP7 菌抗菌物质粗提液,以 10
mmol/L pH7.2 磷酸盐缓冲液做对照,处理 8 h,割取
菌落边缘处理的菌丝块,分别按照常规方法制备扫
描电镜和透射电镜样品,观察玉米大斑菌菌丝外部
形态和内部结构的变化。
1.2.5 CP7 菌抗菌物质对白色念珠菌孢子的活性作
用 在 1 个离心管(规格为 1.5 mL)中,加入对数
生长期的白色念珠菌孢子菌悬液(1×105 个 /mL)
30 μL,再加入 30 μL CP7 菌抗菌物质粗提液和 240
μL 无菌水,得到含 10% 粗提液的孢子处理液,同
样方法制得含 30%、50%、70%、90% 粗提液的孢
子处理液,37℃条件下孵育 1 h,离心洗涤,再分别
加入 100 μL 沙氏液体培养基,摇匀,移到 96 孔板中,
30℃孵育 8 h。于倒置显微镜(200×)下观察,计
算杀孢子率[11]。
2012年第9期 127黄旭华等 :CP7 菌株抗菌物质对真菌的活性及其作用机制研究
1.2.6 CP7 菌抗菌物质对白色念珠菌芽管的活性作
用 将静止期白色念珠菌孢子悬液加入 1640 培养基
中(1×105 个菌体 /mL),37℃条件下培养 3 h,孢
子发育形成芽管。具体操作同 1.2.4。
1.2.7 CP7 菌抗菌物质对白色念珠菌孢子形成芽管
的影响 将静止期白色念珠菌孢子悬液置于 1640 培
养基中(1×105 个菌体 /mL),在一个离心管中,加
入孢子悬液 30 μL,再加入 30 μL CP7 菌抗菌物质粗
提液和 240 μL 无菌水,得到含 10% 粗提液的孢子
处理液,同样方法制得含 30%、50%、70% 和 90%
粗提液的孢子处理液,37℃条件下孵育 3 h,离心洗
涤,再分别加入 100 μL 1640 液体培养基,摇匀,移
到 96 孔板中,25℃孵育 8 h,于倒置显微镜(200×)
下观察,计算孢子发芽率。
1.2.8 CP7 菌抗菌物质对白色念珠菌孢子和菌丝作
用的形态观察 在 2 个离心管(规格为 1.5 mL)中
分别加入 CP7 菌抗菌物质粗提液与白色念珠菌孢子
悬液(2×105 个 /mL)混合液(1 1)和 CP7 菌抗菌
蛋白粗提液与菌丝悬液混合液(1 1)1.0 mL,37℃
恒温水浴 3 h,按扫描电镜常规样品制备方法进行制
样,上镜观察。
1.2.9 CP7 菌抗菌物质对白色念珠菌孢子和菌丝作
用的细胞超微结构观察 在 2 个离心管(规格为 1.5
mL)中分别加入 CP7 菌抗菌物质粗提液与白色念
珠菌孢子悬液(2×105 个 /mL)混合液(1 1)和
CP7 菌抗菌物质粗提液与菌丝悬液混合液(1 1)1.0
mL,37℃恒温水浴 3 h,离心,再加入融化的 2% 琼
脂(45℃),待其凝固后用 4% 戊二醛固定过夜,按
透射电镜常规样品制备方法进行制样,上镜观察。
2 结果
2.1 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝生长的抑制
作用
采用含药培养基法,测定了 CP7 菌抗菌物质对
玉米大斑菌菌丝生长的抑制作用,结果如图 1 所示。
从图 1 可以看出,CP7 菌抗菌物质对玉米大斑
菌菌丝的生长有强烈的抑制作用,在培养基中加
入 10% 的抗菌物质粗提液培养 120 h 后,对玉米
大斑菌菌丝生长即有显著的抑制作用,抑制率达到
77.3% ;当抗菌物质粗提液浓度提高到 20% 时,对
玉米大斑菌菌丝生长抑制率提高到 86%。
2.2 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌孢子形成的影响
玉米大斑菌菌丝生长成熟后,就分化产生分生
孢子。观察在不同含药浓度的培养基上玉米大斑菌
菌丝形成孢子的情况,结果如表 1 所示。
图 1 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝生长的抑制作用
粗提液浓度(%) 孢子数(个) 抑制率(%)
2.5 30 33.3
5.0 27 40.0
10.0 21 53.3
20.0 6 86.6
对照 45 0
抑制率 =(1- 试验组孢子数 / 对照组孢子数)×100%
表 1 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌孢子形成的影响
从表 1 可以看出,CP7 菌抗菌物质对玉米大斑
菌孢子的形成具有较强的抑制作用,当培养基中含
抗菌物质粗提液为 20%,对孢子形成的抑制率达
86.6% ;当浓度提高到 30% 时,其抑制率为 100%。
2.3 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌孢子萌发的影响
在玉米大斑菌孢子悬浮液中加入不同浓度的
CP7 菌抗菌物质粗提液,再进行培养,观察 CP7 菌
抗菌物质对玉米大斑菌孢子萌发的抑制作用,抑制
曲线如图 2 所示。
图 2 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌孢子萌发作用的影响
1. 未加抗菌物质(0%);2. 添加 10% 抗菌物质 ;3. 添加 20% 抗菌物质
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期128
从图 2 可以看出,当混合液中含抗菌物质粗提
液浓度为 20% 或以上时,100% 的孢子就不得萌发,
即孢子萌发受到完全抑制。因此,CP7 菌抗菌物质
对玉米大斑菌孢子萌发有强烈的抑制作用。
2.4 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝作用的形态
观察
利用光学显微镜(图 3)和扫描电子显微镜(图
4)观察玉米大斑菌菌丝形态,发现经抗菌物质处理
的菌丝畸形、扭曲,菌丝伸长和菌落增大有限,菌
丝萎缩呈不规则,表面粗糙、凹陷,细胞外壁皱缩
干瘪,内容物发生凝聚,有空泡 ;而对照菌丝自然
交叉、伸展,长而均匀,表面致密光滑、圆润,整
体饱满粗壮、舒展,细胞内容物分布均匀。
细胞膜模糊,界限不明显 ;细胞表面有一层电子密
度高的絮状物,推测是细胞内容物外渗所致 ;在细
胞核区出现核固缩,其周围出现有白晕,这是染色
质凝聚后形成空隙所致,而且细胞质分布不均匀,
原有的微细结构消失,这都是细胞坏死的标志之一。
而对照组细胞壁和细胞膜完整,细胞质分布均匀,
细胞器有序分布(图 5)。
图 4 电子显微镜观察 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌
菌丝形态的影响
图 3 光学显微镜观察 CP7菌抗菌物质对玉米大斑
菌菌丝形态的影响(200×)
2.5 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝作用的细胞
超微结构观察
利用透射电子显微镜观察玉米大斑菌菌丝的超
微结构,发现 CP7 菌抗菌物质处理菌丝的细胞壁和
图 5 CP7菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝作用的
内部结构变化(26 500×)
2.6 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌孢子和芽管生长及
孢子形成芽管的抑制作用
利用不同浓度的 CP7 菌抗菌物质处理白色念珠
菌孢子和芽管后,活的孢子或芽管能够发育形成菌
落,而死孢子或芽管仍为单个细胞。从表 2 可知,
CP7 菌抗菌物质对白色念珠菌孢子和芽管都有明显
的抑制作用,而且均呈明显的剂量效应,当混合液
中含抗菌物质粗提液为 30% 时,对孢子和芽管的抑
制率分别达到 58% 和 33.3% ;当 90% 时,可使 86%
的白色念珠菌孢子生长受到抑制,使 86.2% 的芽管
生长受到抑制。
利用不同浓度的 CP7 菌抗菌物质处理白色念
珠菌孢子后,从表 2 可知,CP7 菌抗菌物质对白色
念珠菌孢子形成芽管也有明显的抑制作用,也是呈
明显的剂量效应,当混合液中含抗菌物质粗提液为
30% 时,即有 53.6% 的孢子受到抑制而不能发育形
成芽管 ;当浓度为 90% 时,可使 94.1% 的孢子形成
芽管的能力受到抑制。
2.7 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌孢子和芽管作用
的形态观察
采用扫描电镜观察白色念珠菌孢子和芽管后的
表面形态。如图 6 所示,经 CP7 菌抗菌物质处理后
的白色念珠菌孢子和芽管的表面形态与对照比较,
2012年第9期 129黄旭华等 :CP7 菌株抗菌物质对真菌的活性及其作用机制研究
无明显的变化,但对照组孢子表面致密光滑,而处
理组孢子表面有杂质附着 ;图 7 表明,处理组芽管
保持管状形态,而对照组芽管则进一步发育形成孢
子,其他表面特征无明显变化,说明白色念珠菌芽
管经过 CP7 菌抗菌物质处理后,其发育进程受到了
抑制。
布较均匀,而处理组芽管的细胞壁、细胞膜变形、
破损,细胞壁和细胞膜之间有异物,不清晰,细胞
质不均匀,有空泡变性,细胞器、细胞核变性消失。粗提液浓度(%) 抑菌率(%)孢子 芽管 孢子形成芽管
90 86.0 86.2 94.1
70 78.3 79.6 79.8
50 64.6 67.4 65.9
30 58.0 33.3 53.6
10 37.0 8.8 41.2
0 0 0 0
表 2 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌孢子、芽管生长和
孢子形成芽管的抑制作用
抑菌率 =(1-试验组菌落数 / 对照组菌落率)×100%
图 7 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌芽管作用
图 6 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌孢子作用
2.8 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌孢子和芽管细胞
超微结构的影响
采用透射电镜观察经 CP7 菌抗菌物质处理白色
念珠菌孢子和芽管后内部结构的变化,如图 8 所示,
对照组白色念珠菌孢子的细胞壁、细胞膜完整,细
胞质较均匀,细胞核结构清晰 ;而处理组孢子的细
胞壁、细胞膜变形、不完整,细胞质不均匀,有空泡
形成,细胞核固缩,表明细胞已坏死 ;如图 9 所示,
对照组芽管细胞的细胞壁、细胞膜完整,细胞质分
图 8 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌孢子作用的
超微结构 (26 500×)
图 9 CP7菌抗菌物质对白色念珠菌芽管作用的
超微结构(26 500×)
3 讨论
用 CP7 菌抗菌物质粗提液对玉米大斑菌和白色
念珠菌的不同发育阶段的活性作用进行了测试。从
试验结果可知,CP7 菌抗菌物质对玉米大斑菌菌丝
有强烈的抑制作用,对白色念珠菌的生长也有很好
的抑制作用 ;对两种病菌孢子的形成、萌发和生长
均有较强的抑制作用 ;由于孢子的多少,萌发率的
高低是造成病害再次浸染严重与否的主要因素之
一[10],因此,预示 CP7 菌抗菌物质可作为防治真菌
病害的有效药物。
据资料报道,抗真菌成分对真菌的作用机理
主要有几种 :(1)对真菌细胞壁的作用,通过抑
制细胞壁的重要组分葡聚糖及几丁质的合成,破
坏病原菌细胞壁的合成,达到杀菌的作用,如
Echinocandins、Nikkomycin Z[12]等 ;(2)对真菌细
胞膜的作用,抗真菌蛋白与膜作用,破坏脂膜,如
Cecropins、Magainins 和 Dermaseptins 等[13,14];(3)
对真菌细胞内细胞器(线粒体及核酸大分子)的作
用,如 Histatins、Ib-AMP1 及 Buforins[15,16]。本研究
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第9期130
利用CP7菌抗菌物质处理玉米大斑菌和白色念珠菌,
观察发现两种病菌的细胞壁、细胞膜破损,细胞质
产生凝聚,细胞核固缩和细胞器消溶的现象,说明
菌体的内、外结构都受到破坏,在玉米大斑菌细胞
表面还发现有一层电子密度高的絮状物质,推测是
从细胞内泄漏的物质,因此,CP7 菌抗菌物质对玉
米大斑菌和白色念珠菌的作用也是通过破坏菌体细
胞壁、细胞膜等组织结构,引起细胞质凝聚、细胞
器解体,胞内物质外泄而起到抑杀菌体的效果,这
种杀菌方式,与其他抗菌肽作用于细菌一样,不易
引起耐药性[17]。陈海英等[8]研究 CP7 菌抗菌物质
对荔枝霜疫霉菌的作用机制,也证实 CP7 菌抗菌物
质对真菌的作用也是通过破坏菌体、孢子的细胞壁、
细胞质等组织结构,引起细胞器溶解,胞内物质外
泄而起到抑杀菌体的作用。文凤云等[6]研究已经证
实,CP7 菌抗菌物质粗提液中抗真菌的主要成分为
β-1,3-1,4-葡聚糖酶,但有关 β-1,3-1,4-葡聚糖酶抗
真菌作用机理研究尚未见有其他报道。
4 结论
CP7 菌抗菌物质对玉米大斑菌的菌丝生长、孢
子形成和孢子萌发具有强烈抑制作用,对白色念珠
菌的孢子萌发、芽管生长和孢子形成芽管也具有较
强的抑制作用,说明多黏芽孢杆菌 CP7 菌株分泌的
抗菌物质对丝状真菌和白色念珠菌均有活性作用,
在真菌病害防治方面具有潜在的应用价值。CP7 菌
抗菌物质对真菌的作用也是通过破坏菌体细胞壁、
细胞膜等组织结构,影响细胞内部结构,引起细胞
质凝聚、细胞器解体,细胞核固缩,胞内物质外泄
而达到抑杀菌体的目的,从而使作用靶标不容易产
生耐药性,为该菌的开发利用提供了重要依据。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫)