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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第2期
植物抗病原物侵染反应与多种生理生化调节相
关，其中包括细胞壁木质化、植物抗毒素的合成、
病 程 相 关 蛋 白（pathogenesis-related proteins，PRP）
基因的表达，这些蛋白如几丁质酶、β-1，3-葡聚糖
酶等。PRP 根据序列相似性及免疫学相关性分为 17
收稿日期 ：2012-08-15
基金项目 ：“十二五”国家科技支撑计划（2012BAD19B04），农业部转基因生物新品种培育重大专项（2009ZX08009-062B）
作者简介 ： 王升阳，男，研究方向 ：植物抗逆基因工程 ；E-mail ：sywang8209@mails.jlu.edu.cn
张勇，男，研究方向 ：植物抗逆基因工程 ；E-mail ：zhangyong199010@gmail.com
通讯作者 ：潘洪玉，教授，博士生导师，研究方向 ：植物病原真菌分子生物学与抗病基因工程 ；E-mail ：panhongyu@jlu.edu.cn
四翅滨藜 Osmotin-like Protein 基因的克隆、序列分析
及其原核表达
王升阳  张勇  王健  刘言志  刘金亮  潘洪玉
（吉林大学植物科学学院，长春 130062）
摘 要 ： 在构建四翅滨藜（Atriplex canescens）全长 cDNA 文库中通过随机克隆测序并进行 EST 分析基础上，得到四翅滨
藜 osmotin-like protein 的 1 个 cDNA 序列，命名为 AcOLP。AcOLP cDNA 包含一个全长为 687 bp 完整开放阅读框，编码 229 个氨基
酸，属于 GH64-TLP-SF 超家族，是一种病程相关 5（PR-5）蛋白，其核酸序列与大洋洲滨藜（Atriplex nummularia）的 osmotin-like
protein 基因的同源性为 94%，对应编码氨基酸序列同源性为 87%。将得到的序列提交 GenBank，序列号为 JN632587.1。与其他植
物 PR-5 蛋白的氨基酸序列比对，AcOLP 具有保守的半胱氨酸残基，与二硫键的形成有关。对 AcOLP 与其他植物的氨基酸序列的
进化分析表明，其与大洋洲滨藜的亲缘关系较近。将 AcOLP 基因与原核表达载体 pET-28a 连接，进行融合表达，在大肠杆菌 BL21
（DE3）中诱导表达出分子质量约 29 kD 的蛋白。
关键词 ： 四翅滨藜 Osmotin-like protein 基因克隆 序列分析 原核表达
Cloning and Sequence Analysis of a Osmotin-like Protein Gene from
Atriplex canescens and Its Prokaryotic Expression
Wang Shengyang Zhang Yong Wang Jian Liu Yanzhi Liu Jinliang Pan Hongyu
（College of Plant Sciences，Jilin University，Changchun 130062）
Abstract:  A osmotin-like protein gene was isolated based on the library from Atriplex canescens and its EST analysis, and named as
AcOLP. The full length of AcOLP contained an open reading frame of 687 bp. It encoded a polypeptide of 229 amino acids, belonging to GH64-
TLP-SF superfamily as a kind of PR-5 proteins. The AcOLP had 94% nucleotide sequence homology and 87% amino acid sequence homology to
the sequence of osmotin-like protein from Atriplex centralasiatica, respectively. The accession number of AcOLP in GenBank was JN632587.1.
Comparison of amino acid sequence with PR-5 proteins from various plants showed AcOLP possessed 16 cysteine residues that were conserved
at their invariant and were presumably involved in disulfide bonding. Phylogenic analysis on the amino acid sequence of AcOLP with other plants
showed that Atriplex canescens was closely related to Atriplex nummularia. AcOLP was inserted into the prokaryotic expression vector of pET-28a
and expressed its fusion protein（about 29 kD）in Escherichia coli BL21（DE3）.
Key words:  Atriplex canescens Osmotin-like protein Gene clone Analysis of sequence Prokaryotic expression
个家族［1］，其中病程相关 5（PR-5）蛋白是第 5 家
族，具有 β-1，3 葡聚糖酶、抗真菌侵染、抗冻、抗
渗透压力等多种生物学活性，参与植物系统获得抗
性（SAR）和过敏反应（HR），在植物抵御生物和
非生物胁迫中具有重要作用［2］。另外，PR-5 蛋白与
2013年第2期 107王升阳等 ：四翅滨藜 Osmotin-like Protein 基因的克隆、序列分析及其原核表达
甜蛋白的氨基酸序列同源性高，也被称为类甜蛋白
（thaumatin-like protein，TLP）。同时，由于 PR-5 蛋
白独特的抗真菌活性，良好的稳定性，而且对人体
无毒，使它成为一种潜在的绿色抑菌药剂。PR-5 蛋
白包含了具有多种抗逆功能的渗调蛋白（osmotin）
和类渗调蛋白（osmotin-like protein，OLP）。在植物
体中，osmotin 是一种阳离子蛋白，OLP 与 osmotin
相比，pI 偏低，并富含丝氨酸、苏氨酸，可能使它
在植物中具有不同的生理生化功能［3］。Osmotin 最
初作为在高浓度 NaCl 环境中培养的烟草细胞中主
要积累的一种蛋白而分离得到［4］；许多研究已经证
明，OLP 可被微生物侵染和多种非生物胁迫因素激
活表达［5］。目前，尽管人们还不完全清楚 OLP 的生
物功能，但是一些试验已经证明 OLP 可作为一种抗
真菌的体外蛋白［6］。目前，国内外学者陆续从大洋
洲 滨 藜（Atriplex nummularia）、 番 茄（Lycopersicon
esculentum）、阿拉伯芥（Arabidopsis thaliana）、野海
茄（Solanum dulcamara）、 辣 椒（Capsicum annuum）
等植物中克隆了 osmotin-like protein 基因。迄今为
止，有关四翅滨藜 osmotin-like protein 基因的研究还
鲜有报道。本试验从四翅滨藜的 cDNA 文库中筛选
出 AcOLP 基因，并对其进行序列分析和原核表达的
相关研究。
1 材料与方法
1.1 材料
四翅滨藜 cDNA 文库大肠杆菌菌株 DH10B 由
本实验室构建并保存 ；大肠杆菌 E.coli DH5α、E.coli
BL21（DE3）菌株与表达载体 pET-28a 由本实验室
提供 ；克隆载体 pMD18-T Vector 购自 TaKaRa 公司。
1.2 方法
1.2.1 文库目标克隆子的获得 随机挑选文库克隆，
提取质粒 DNA，以载体 pYES-DEST52 上游（T7）：
5-TAATACGACTCACTATAGGG-3 和 下 游（R）：5-
AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3 为 测 序 引 物，
进行全序列测定得到 EST 序列，然后在 NCBI BLA-
STX 库进行比对。
1.2.2 AcOLP 基因的克隆及测序 根据目的基因序
列，设计合成一对 PCR 扩增特异性引物。上游引
物 ：5-CGGGATCCATGAATTCCTCCTTGATGAAAT
C-3，下划线为 BamH Ⅰ酶切位点 ；下游引物 ：5-
CCCTCGAGTCAAGGACAAAATGTAACTAC-3，下划
线为 Xho Ⅰ酶切位点。以四翅滨藜 cDNA 为模板进
行 PCR， 反 应 体 系（25.0 μL） 为 ：ddH2O 18.0 μL、
10×Pfu PCR Buffer（含 Mg2+）2.5 μL、Forward Primer
1.0 μL、Reverse Primer 1.0 μL、dNTPs 1.0 μL、Tem-
plate 1.0 μL、Pfu 酶 0.5 μL。反应程序为 ：94℃预变
性 5 min ；94℃变性 30 s，55℃退火 30 s、72℃延伸
2 min，30 个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 产物经过
电泳检测鉴定正确后，进行回收，将回收的 AcOLP
基因片段进行加“A”反应后与 pMD18-T Vector 连
接，连接反应按照试剂盒说明书进行，16℃条件
下连接 1 h，构建重组质粒 pMD18T-AcOLP。连接
产物用 CaCl2 化学转化法转化 E.coli DH5α 感受态，
LB（Amp+）平板上 37℃培养箱培养过夜。挑取平
板上的单菌落，接种于 LB（Amp+）液体培养基中，
37℃，200 r/min 振荡培养过夜。采用碱裂解法小量
提取质粒，经 BamH Ⅰ和 Xho Ⅰ双酶切验证、PCR
鉴定，将获得的 3 个阳性重组质粒送至 Invitrogen 公
司测序。根据测序结果进行序列比较和分析。
1.2.3 AcOLP 基因的原核表达 用 BamH Ⅰ和 Xho
Ⅰ对重组质粒 pMD18T-AcOLP、表达载体 pET-28a
分别进行双酶切，电泳检测，回收，以 T4 DNA 连
接酶于 16℃过夜连接，连接产物转化到感受态细胞
E.coli DH5α 中，将转化产物涂布于 50 mg/L 卡那霉
素的 LB 平板上，37℃培养过夜。按照上述方法对平
板上挑取的菌落进行酶切验证和 PCR 鉴定。将获得
的原核融合表达重组质粒 pET28a-AcOLP 转化 BL21
（DE3）受体菌株中。PCR 和酶切验证正确后，挑取
其阳性克隆接种于 3 mL 含卡那霉素的液体 LB 培养
基中，37℃，200 r/min 振荡培养过夜，以 1∶100 的
比例扩大培养，当 OD600 至 0.4-0.6 时，加 IPTG 至
终浓度为 1 mmol/L， 分别诱导 0、2、4、6 和 8 h。
离心收集菌体，加入 1/10 体积的 2×SDS 上样缓冲液，
煮沸 10 min，进行 SDS-PAGE 电泳。
2 结果
2.1 四翅滨藜osmotin-like protein基因的克隆
以四翅滨藜 cDNA 为模板，用所设计的特异性
引物进行 PCR 扩增，对其产物进行 1％的琼脂糖凝
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期108
胶电泳，大约在 700 bp 出现明显特异性条带（图 1）。 229 个氨基酸。将得到的序列提交 GenBank，序列
号为 JN632587.1。以 ExPASy 网站的 Compute pI/Mw
tool 计 算 可 得 AcOLP 的 等 电 点 为 6.04， 分 子 量 为
24.07 kD。在 NCBI 网站上对 AcOLP 基因编码的氨基
酸序列进行保守区域分析。分析结果表明，该基因
编码的蛋白质共有 229 个氨基酸残基，属于 GH64-
TLP-SF 超家族，是一种病程相关 5（PR-5）蛋白。
推导的 AcOLP 氨基酸全长序列与其他植物中相关的
PR-5 蛋白序列的比对结果，如图 2 所示。AcOLP 含
有 17 个 Cys 残基，其中 16 个在 PR-5 蛋白中是高度
保守的，可能与二硫键的形成有关［7］；在 N 端 1-28
氨基酸为预测的信号肽序列，可能与 osmotin-like
protein 在内质网中的跨膜转运有关，信号肽的最后
一个氨基酸为 Ala，这在 osmotin-like protein 也是较
为保守的［8］。
2.2.2 序列同源性分析 AcOLP 与其他物种的相关
序列有较高的同源性。核酸序列同源性分析表明，
M
2000
AcOLP
bp
2000
750
500
250
100
1 2 3
M ：DL2000 分子标记 ；1-3 ：扩增产物
图 1 PCR 扩增产物电泳图
2.2 序列测定与分析
2.2.1 结构域和保守性分析 选取质粒 PCR 鉴定
表现出阳性克隆及酶切鉴定可以切出目的片段的
菌株进行测序。测序结果表明，AcOLP 基因包含
有全长为 687 bp 开放阅读框，编码的多肽链含有
Atriplex canescens
Atriplex nummularia
Chenopodium quinoa
Avena sativa
Hordeum vulgare
Pinus monticola
Consensus
Atriplex canescens
Atriplex nummularia
Chenopodium quinoa
Avena sativa
Hordeum vulgare
Pinus monticola
Consensus
Atriplex canescens
Atriplex nummularia
Chenopodium quinoa
Avena sativa
Hordeum vulgare
Pinus monticola
Consensus
Atriplex canescens
Atriplex nummularia
Chenopodium quinoa
Avena sativa
Hordeum vulgare
Pinus monticola
Consensus
Atriplex canescens
Atriplex nummularia
Chenopodium quinoa
Avena sativa
Hordeum vulgare
Pinus monticola
Consensus
Atriplex canescens
Atriplex nummularia
Chenopodium quinoa
Avena sativa
Hordeum vulgare
Pinus monticola
Consensus
39
s t n y*
tvw l w r t *
* * *t R R R
d d dg f n p * *
syp****asg *v*
f k p* a ys ya kd t * R ny *
y
s
p t aey t l
39
39
35
35
40
79
75
76
74
74
79
119
114
116
112
112
117
153
148
153
152
151
156
193
188
193
192
191
196
228
223
227
227
226
231
下划线为 N 端信号肽序列 ；* 表示保守的 Cys 残基 ；方框为保守的结构域
图 2 六种 PR-5 蛋白氨基酸序列比对图
2013年第2期 109王升阳等 ：四翅滨藜 Osmotin-like Protein 基因的克隆、序列分析及其原核表达
M ：低分子量蛋白标记 ；1-5 ：IPTG 诱导 0、2、4、6 和 8 h 的 BL21（DE3）
图 4 AcOLP 在大肠杆菌 BL21（DE3）中表达的 SDS-
PAGE 电泳图
97.2
kD
M 1 2 3 4 5
66.4
44.3
29.0
20.1
AcOLP
AcOLP 基 因 与 大 洋 洲 滨 藜 osmotin-like protein 基 因
（M84468.1）同源性最高，为 94% ；与其它植物如大
米草（Spartina anglica）、西藏南美藜（Chenopodium
quinoa） 的 osmotin-like protein 基 因 的 同 源 性 也 在
81% 以上。AcOLP 基因编码的蛋白序列与大洋洲滨
藜 osmotin-like protein 蛋白（AAA32909.1）序列同源
性达 87%，与上述其他植物中的 PR-5 蛋白序列同源
性基本都在 50% 以上。表明 osmotin-like protein 合
成过程在植物进化中属于较保守进化。
2.2.3 系统发育关系分析 利用 MEGA5.05 软件对
四翅滨藜、大洋洲滨藜、燕麦（Avena sativa）、二穗
短柄草（Brachypodium distachyon）、西藏南美藜等的
PR-5 蛋白序列进行比对并构建系统发育树状图（图
3），可以看出，比对的 PR-5 蛋白被分成了两大类，
四翅滨藜与大洋洲滨藜的亲缘关系最近，四翅滨藜、
大洋洲滨藜、西藏南美藜比对的 PR-5 蛋白属于类渗
100
100
100
98
100
99
56
80
99
99
81
79
80


Picea sitchensis ABR17554.1े㖾Ӂᖜ
Pinus monticola ADB97928.1࣐ᐎኡᶮ
Pseudotsuga menziesii AAQ84889.1㣡ᰇᶮ
Cryptomeria japonica BAC15615.1ᰕᵜḣᖜ
Sequoia sempervirens ADR80225.1े㖾㓒ᵹ
Thuja occidentalis AAV65287.1ᰕᵜ俉᷿
Cupressus sempervirens AAR21073.1ൠѝ⎧᷿ᵘ
Juniperus rigida AAR21071.1ᶌᶮ
Vitis vinifera XP_002283030.1㪑㨴
Sorghum bicolor XP_002456520.1儈㋡
Oryza sativa NP_001067336.1≤に
Avena sativa AAB02259.1⠅哖
Brachypodium distachyon XP_003575452.1Ҽょ⸝ᷴ㥹
Hordeum vulgare AAK55325.1བྷ哖
Triticum aestivum AAM15877.1Პ䙊ሿ哖
Chenopodium quinoa AAM62423.1㾯㯿ই㖾㰌
Atriplex canescens AEY75256.1
Atriplex nummularia AAA32909.1 大洋洲滨藜
100
100
0.1
箭头代表 AcOLP 在系统发生树中的位置
图 3 四翅滨藜与部分物种 PR-5 蛋白氨基酸推导序列系统进化树
调蛋白（osmotin-like protein，OLP）。
2.3 AcOLP基因原核表达
将 鉴 定 为 阳 性 的 pET28a-AcOLP BL21（DE3）
菌体经过终浓度为 1 mmol/L 的 IPTG 分别诱导 0、2、4、
6 和 8 h。将诱导表达的蛋白经 SDS-PAGE 电泳检测，
结果（图 4）表明在 29 kD 处出现一条特异性蛋白带，
与预期大小一致，说明 AcOLP 基因编码的蛋白在大
肠杆菌中得到了正确的表达。并且随着诱导时间的
增加，目的蛋白的表达量逐渐增加，到 4 h 达最大值。
3 讨论
我们从四翅滨藜 cDNA 文库中克隆了 AcOLP 基
因，测序结果和同源性分析表明该基因编码蛋白属
于 PR-5 家族蛋白，同时将获得的 AcOLP 基因连接
到原核表达载体上诱导其原核表达。有关研究表明，
0.1
osmotin-like protein 能 抵 抗 致 病 疫 霉（Phytophthora
infestans）的侵染，致病疫霉可引起马铃薯和番茄的
晚疫病，但是目前还不清楚其高度保守的 Cys 是否
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第2期110
与抗真菌作用有关。Osmotin-like protein 可被多种非
生物因素和生物因素所诱导，例如，ABA、SA、高
浓度盐溶液、机械损伤、低温、真菌侵染，说明这
种蛋白在渗透胁迫和抵御病原体侵染方面的双重功
能［9］。金属阳离子影响 PR-5 蛋白与真菌细胞壁受
体的作用。一种来源于烟草的 PR-5 蛋白 osmotin，
对其与酵母抑制作用进行研究，发现酵母细胞壁上
聚甘露糖上的一个磷酸化位点是 osmotin 的受体［10］，
而且其结构中的酸性凹槽是 osmotin 作用位点，此
外这 2 个位点都是带负电荷。K+ 通过与磷酸基团结
合影响 osmotin 与它的结合，从而抑制 osmotin 在菌
体细胞壁上的识别 ；此外，Ca2+ 会与 K+ 竞争结合受
体，能促进 osmotin 与磷酸基团的互相结合，因而增
强 osmotin 对菌体的毒性［11］。Osmotin-like protein 较
osmotin pI 值偏低，因而可能具有更强的抗菌作用。
而这一研究被运用在草莓贮运过程中，草莓被含
Ca2+ 的溶液处理后，草莓在贮运中的腐败减少［12］，
而且从草莓中发现的 2 个 PR-5 蛋白 FaOLP［13］ 和
FaOLP2［14］也验证了这一点。因此，本研究结果为
osmotin-like protein 的体外活性测试和通过植物基因
工程提高植物的抗病性研究提供基础。
4 结论
本研究从四翅滨藜 cDNA 文库中扩增并克隆了
AcOLP 基因，测序结果和同源性分析表明，osmotin-
like protein 基因在高等植物的 PR-5 蛋白基因间保
守性较高，四翅滨藜和大洋洲滨藜的 osmotin-like
protein 的 N-信号肽序列完全一致。AcOLP 中含有 16
个保守的 Cys，与二硫键的形成有密切的关系，有
利于 AcOLP 结构的稳定。将 AcOLP 基因与原核表
达载体 pET-28a 连接，进行融合表达，在大肠杆菌
BL21（DE3）中诱导表达出分子质量约 29 kD 的蛋白。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）