全 文 ：·技术与方法·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
收稿日期 : 2012-02-23
基金项目 : 国家自然科学基金项目（31060128）, 广西科学院基本科研业务费资助项目（11YJ24WL01）, 广西师大博士科研启动基金
作者简介 : 孙美娟 , 女 , 硕士研究生 , 研究方向 : 拉曼光谱在生物中的应用 ; E-mail: meijuansun87@gmail.com
通讯作者 : 陶站华 , 男 , 副研究员 , 研究方向 : 生物光谱学 ; E-mail: taozhanhua@163.com
拉曼光谱技术在微生物学中的应用
孙美娟1，2 刘军贤2 王雪1，2 陶站华1
（1 广西科学院生物物理实验室，南宁 530007 ；2 广西师范大学物理科学与技术学院，桂林 541004）
摘 要： 拉曼光谱具有快速、灵敏、无损、实时监测等显著特点，在微生物学领域得到广泛应用。分别介绍共焦显微拉曼光谱、
共振拉曼光谱、表面增强拉曼光谱、拉曼成像、相干反斯托克斯拉曼光谱、激光镊子拉曼光谱和 Raman-FISH的原理和特点，并重
点总结和分析不同拉曼光谱技术在微生物的结构、化学组成，以及代谢过程等相关研究中的应用优势。合理利用这些技术在基础
微生物、发酵微生物和微生物诊断等方面具有潜在的应用价值。
关键词： 拉曼光谱 微生物 应用
Application of Raman Spectroscopy in the Microbiology
Sun Meijuan1，2 Liu Junxian2 Wang Xue1，2 Tao Zhanhua1
（1Lab of Biophysics，Guangxi Academy of Sciences，Nanning 530007；2College of Physics and Technology，
Guangxi Normal University，Guilin 541004）
Abstract: Raman spectroscopy has been applied extensively in the field of microbiology in recent years due to its characteristics of
quickness, sensitivity, non-destructiveness and Real-time detection. In this paper, we first introduce the principles and characteristics of confocal
Raman microspectroscopy, resonance Raman spectroscopy, surface-enhanced Raman, Raman imaging, coherent anti-Stokes Raman, laser
tweezers Raman and Raman-FISH respectively, and then focus on the application advantages of different Raman spectroscopy technologies
employed to study the structure, chemical composition and metabolism of microbes. The proper use of these technologies in basic microbiology,
microbial fermentation, diagnostic microbiology and other related aspects is very potential, especially in application.
Key words: Raman spectroscopy Microbe Application
微生物学是研究微生物在一定条件下的形态结
构、生理生化、以及微生物的进化、分类、生态等
规律及其应用的一门学科［1］。新技术和方法的引用
对于微生物学的发展至关重要，荧光标记技术、细
胞膜电生理技术以及高分辨率显微镜使我们对微生
物生命活动的直接探索成为可能，但各种抗体、染
色技术不仅价格昂贵而且会对生理状态下的微生物
细胞造成不同程度的影响或损伤。除此以外，大部
分技术还存在着试验操作复杂，耗时长等诸多弊端。
拉曼光谱的应用和发展，为微生物学研究提供了一
种新的方法。
拉曼光谱是一种产生于分子或者晶格振动能级
的光子的非弹性散射光谱，拉曼光谱特征峰位置、
强度和线宽可提供分子振动、转动方面的信息，据
此可以反映分子中不同的化学键和官能团［2］。拉曼
光谱是分析分子结构和含量的有用工具［3］，现已越
来越多地应用于微生物的细胞结构、化学组成以及
代谢过程的研究［4-6］。与其他微生物检测技术相比，
拉曼光谱具有以下优势：不触及试样，无需样品制备，
具有非入侵性 ；可对微生物的生长过程进行原位实
时研究 ；检测迅速，灵敏度高，重复性好。
早期的拉曼光谱仪以汞弧灯为光源，样品产生
的拉曼散射谱线极其微弱，因此应用受到限制。直
至 20 世纪 60 年代激光光源的问世，微弱信号检测
技术的提高和计算机的应用克服了早期拉曼光谱技
术的弱点，使拉曼光谱作为一种鉴定物质结构的分
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期64
析测试手段而被广泛应用。随后共焦显微拉曼、增
强拉曼光谱技术、拉曼成像等一系列新技术的出现，
为拉曼光谱技术的应用提供了广阔的前景。本文是
结合拉曼光谱技术的发展，分析了不同拉曼光谱技
术在微生物学研究领域中的应用优势。
1 共焦显微拉曼光谱技术（confocal raman
microspectroscopy，CRM）
共焦显微拉曼光谱技术是将共焦光学显微技术
与拉曼光谱结合起来的一种应用技术，共焦显微拉
曼系统利用显微物镜将激光束聚焦到样品上，减少
了周围物质的干扰，可精确获取局部区域的拉曼光
谱信息，并且还可以通过改变聚焦深度的方法，观
测不同深度层面的拉曼信号。相比于传统的拉曼光
谱技术，共焦显微拉曼光谱的横向及轴向分辨率都
极大提高，可反映单个细胞所含化学成分的多维信
息。 Christian 等［7］通过共焦显微拉曼探测单个贝氏
梭状芽胞杆菌的生理状态，在显微镜下可观察到在
相同培养条件下的一些细胞变异（体积变大）和多
聚糖细菌淀粉粒聚集，变异细胞的拉曼光谱中出现
481 cm-1，941 cm-1 和 1 080 cm-1-1 130 cm-1 峰，这
些峰都属于细菌淀粉颗粒的信号峰。同时，与正常
细胞相比，表征苯丙氨酸的 1 005 cm-1 峰减弱，归
属酰胺Ⅲ的 1 220 cm-1-1 290 cm-1 峰逐渐消失，显示
相关蛋白质含量减少。归属糖类的 1 050 cm-1 峰一
直保持稳定，表明此物质可能是细胞壁的组成成分。
共焦显微拉曼光谱还可在单细胞水平研究微生物种
群内的表型异质性。Hermelink 等［8］通过共焦显微
拉曼光谱反映即使在实验室条件下培养的菌落在单
细胞水平也存在光谱差异，显示明显的细胞异质性。
2 增强拉曼光谱术
由于拉曼散射效应的强度弱，在低浓度和微量
试样的检测与分析时遇到困难。增强拉曼光谱术能
有效克服这个弱点，根据增强原理不同，可分为两类：
共振拉曼光谱和表面增强拉曼光谱。
2.1 共振拉曼光谱技术（resonance raman spectro-
scopy，RRS）
共振拉曼散射是当激发光波长与分子的电子
跃迁波长相等时发生的，其强度比常规散射要高出
约 106 倍，灵敏度极大增高，使其能够获得比常规
拉曼光谱丰富得多的光谱信息，适用于生物大分子
试样检测［9］。许多生物分子的电子吸收区位于紫
外，利用紫外共振拉曼光谱技术在蛋白质、核酸和
丝状病毒粒子的研究已取得显著成果［10-12］。深紫外
244 nm 可选择性增强芳香族氨基酸与核酸的信号，
Neugebauer 等［13］用深紫外共振拉曼研究短小芽孢杆
菌的生长过程以及对常见抗生素丙环沙星的抗药性。
当采用 244 nm 激发光时，发现细菌在经历迟滞期、
对数期、稳定期的生长过程中，表征核酸的 1 480
cm-1 峰蓝移且强度略有降低，表征蛋白质的 1 607
cm-1 峰显著增强，同时说明深紫外共振拉曼光谱适
合于 DNA、蛋白质变化的检测。他们还比较了加入
不同剂量的环丙沙星（0.9 μg/mL，5.0 μg/mL）与对
照细胞的拉曼光谱发现，1 480 cm-1 和 1 620 cm-1 峰
附近区域发生变化，且差异明显，结合聚类分析和
主成分分析能够较好地区分经过不同剂量抗生素处
理的细胞，此方法可用于细菌的抗药性的研究。由
于共振拉曼光谱使用的紫外波长激光能量较高，其
热效应、光化学作用可能损伤试样，可以通过减少
积分时间和降低激光强度等相应措施减小对试样的
影响。
2.2 表面增强拉曼光谱技术（surface-enhanced
raman spectroscopy，SERS）
在金、银等贵重金属胶粒或粗糙金属表面作用
下，材料的拉曼横截面可以增大 107 倍，这种效应称
为表面增强拉曼效应［9］。表面增强拉曼光谱已成为
拉曼光谱研究中一个活跃的领域，可以获得常规拉
曼光谱所不易得到的结构信息。金属表面与细胞表
面相互作用的强度取决于细胞壁的生化结构，Sayin
等［14］采用 SERS 光谱识别酵母细胞壁的生化结构，
发现 -SH 和 -NH2 的含量在某些酵母细胞壁中可能
会更高，可用于遗传特性相差较小的酵母菌种的鉴
定。Liu 等［15］将 SERS 用于探索细菌细胞壁的精
细结构，可快速区分革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性
细菌及分支杆菌等不同细菌的细胞壁。他们还比较
了结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的拉曼信息，发
现分支杆菌属细菌细胞壁中存在分枝菌酸以及其他
特有物质。尽管表面增强拉曼目前仍存在要求试样
与金属颗粒相接触以及信号稳定性较差等应用限制，
2012年第10期 65孙美娟等 ：拉曼光谱技术在微生物学中的应用
但由于其极高的灵敏度和在获取表面和界面信息方
面的突出优势，仍然发展成一种强大的分析技术。
表面增强共振拉曼光谱（surface enhanced reso-
nance raman spectroscopy，SERRS）是将表面增强技
术与共振拉曼光谱增强联合使用，拉曼横截面增大
高达 1014 倍 -1015 倍，进一步提高了拉曼光谱的灵
敏度，使得对单分子的检测成为可能［16］。Lee 等［17］
通过表面增强共振拉曼散射检测了经 pH 诱导变性
的酵母异 -1-细胞色素 C 蛋白的光谱变化，他们发
现当 pH<3 时，酵母异 -1-细胞色素 C 中甲硫氨酸
和组氨酸配体解离，引起分子结构的明显改变。在
中碱性条件下，氧化标志峰 1 375 cm-1，1 498 cm-1，
1 592 cm-1 和 1 640 cm-1 出现，表明在低自旋态下
酵母异 -1-细胞色素 C 与血红素 Fe3+ 结合。在 pH<3
时这些峰分别红移到 1 372 cm-1，1 489 cm-1，1 571
cm-1 和 1 602 cm-1，表明在高自旋态下，酵母异 -1-
细胞色素 C 的第 80 位甲硫氨酸和第 18 位组氨酸配
体破裂。试验结果显示在低浓度的检测中，SERRS
比普通的共振拉曼光谱具有更高的灵敏度。
3 拉曼成像
拉曼成像是指测量与像的每个像素相对应的拉
曼光谱再用多元统计分析方法制作得到光谱图像，
可直观反映细胞内物质的组成、分布和变化。拉曼
成像能收集到细胞中微观结构的信息，在一些直径
较大细胞的分析研究中具有很好的针对性，克服了
一般拉曼技术可能导致信息缺失的缺点。相比于传
统的荧光成像方法，拉曼成像无需标记就能进行化
学特异性的成像，避免了因标记对分子的功能和微
环境造成影响。Huang 等［18］通过拉曼光谱成像研究
单个活裂殖酿酒酵母细胞中细胞器的物质组成和结
构，不同细胞周期的拉曼图像说明细胞核中蛋白质
含量最高 ；其次为核酸。单个裂殖酵母细胞中部的
光谱图像显示从一个分开的核到细胞质、线粒体最
后到隔膜的持续变化，与传统的荧光染色方法所观
察到的细胞周期的转变一致。细胞营养状态良好时
还可观察到很强的 1 602 cm-1 峰，而加入呼吸抑制
剂 KCN 后该峰迅速消失，同时代表磷脂的谱峰形状
和强度也发生变化，说明 1 602 cm-1 峰可作为反映
生命活性的特征峰。该研究表明，拉曼成像不仅能
够从分子水平直观显示细胞内物质的分布，还能够
可视化细胞周期内细胞器的物质变化及代谢活动。
由于逐点扫描存在激发光功率高和数据采集
时间长等问题，人们发明了拉曼线成像用以克服点
成像的上述不足，在线成像中激光束聚焦于细胞上
一直线上的各个像素，将该直线的拉曼散射成像于
光谱仪的入射狭缝，直到入射于 CCD 探测器，可
同时测定一直线上许多点的光谱［9］。与点成像相
比，线成像测量时间明显缩短，在保证成像像素点
n 不变的情况下，试验持续时间可缩短至点成像的
1/ n，线成像技术在生物学的研究及应用已有相关
综述［19， 20］。
4 相干反斯托克斯拉曼光谱（coherent anti-
stokes raman spectroscopy，CARS）
相干反斯托克斯拉曼散射是一种三阶非线性光
学过程，入射激光之间的频差与具有拉曼活性的分
子的振动频率匹配时，激发产生共振增强，大大提
高了单分子探测的灵敏度，提供较高的信号光强或
亮度，具有化学特异性强和信号采集时间短等特点。
Pestov 等［21］采用频率分辨率和时间分辨率相结合
的 CARS 技术，在单个信号激光照射下便可获取枯
草芽孢杆菌样品（约 104 个孢子）的拉曼光谱，信
号采集时间明显缩短，能够用于细菌内孢子的实时
监测，结果显示出该技术在生化危机（如炭疽芽孢
杆菌）快速检测方面的潜力。CARS 显微成像技术
是将 CARS 与传统的光学显微成像技术结合在一起，
利用待测样品中特定分子所固有的分子振动光谱信
号作为显微成像的对比度，有选择性地快速获取样
品中特定分子的空间分布图像以及分子之间相互作
用的功能信息［22］。在微生物应用方面，通过把入射
激光的中心频率调至对应伸缩键的振动频率，CARS
显微成像技术可对细胞内脂类、蛋白质及激素等分
子进行非侵入式显微成像和追踪［23-25］。
5 激光镊子拉曼光谱（laser tweezers raman
spectroscopy，LTRS）
细胞代谢过程中物质变化极其复杂，为了更适
合细胞学的研究，人们将拉曼光谱检测技术与众多
细胞研究手段相互结合，衍生出许多分支技术。光
镊是由一束高度聚焦的激光微束形成的三维光学势
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期66
阱［26］。激光镊子拉曼光谱技术是将光镊与显微拉曼
光谱技术相结合，可以俘获并长时间固定处于溶液
中的单个细胞，减少细胞运动及布朗运动的干扰，
在接近自然的生理状态下研究掩盖在群体平均信息
下的单个细胞的实时生化变化的信息［27-29］。Chen
等［29］通过 LTRS 对在 TSB 培养液中的苏云金芽孢
杆菌孢子进行实时监测。比较实时的拉曼光谱信
息，得出 2,6-吡啶二羧酸钙盐（Ca2+-DPA）随时间
变化的关系，可用于追踪孢子萌发的过程。该研究
小组还研究了大肠杆菌单细胞裂解的复杂动力学过
程［30］，当采用溶菌酶裂解大肠杆菌细胞时，随着裂
解反应的进行，归属于核酸的 668 cm-1，725 cm-1，
783 cm-1，813 cm-1，1 100 cm-1，1 480 cm-1，1 574
cm-1 峰强度逐渐降低，说明细胞内部 RNA 相关物
质从破损的细胞释放到胞外。在温度温和诱导噬菌
体过程中，归属核酸的 813 cm-1，1 574 cm-1 和其他
相关峰（除了 783 cm-1，1 100 cm-1）的强度开始有
小幅下降然后回升，这些峰的下降可能由于核糖体
部分解离或者核糖体中的 rRNA 以及细胞中的其他
RNA 双链结构的部分消失，随后回升则可能由于噬
菌体 DNA 和蛋白质的合成使得核糖体 RNA 数量的
增加，与 RNA 结构无关的 783 cm-1，1 100 cm-1 峰
未发生变化验证了这个推测。LTRS 可反映两个裂解
过程中完全不同的变化，是监测细胞内复杂动态变
化的有力工具。
6 Raman-FISH
Raman-FISH 是分析复杂微生物群落单细胞结
构功能的一个新工具，可在原位直接识别和量化微
生物中标记化合物的代谢，由 Huang 等［31］于 2007
年发明，其原理是将 3 种已有的技术，即稳定同位
素探针（stable isotope probing，SIP），拉曼显微技
术、荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，
FISH）结合在一起，以此技术建立地下水细菌细胞
和特定碳源代谢的联系。这 3 种技术的结合显示出
明显的优势 ：SIP 能富集被 13C 稳定同位素标记的的
微生物，显微拉曼光谱定量分析单个微生物细胞成
分中 13C 稳定同位素的掺入量（如 DNA、RNA 和氨
基酸），FISH 则可以证实相同细胞的进化背景［32］。
早期的 Raman-FISH 分析集中应用于以低生物多样
性为基础的环境，然而最近研究发现它能够对土壤
中微生物细胞进行检索和排序［33］，表明该技术几乎
可以扩展到与环境监测相关的任何领域。目前绝大
多数自然细菌还不能在实验室中进行培养，环境微
生物学的主要目标仍是实现原位监测微生物活动，
Raman-FISH 作为一种不断发展的能够原位检测微生
物活动的实用工具将倍受关注。
7 结语
不同拉曼光谱技术具有各自独特的优势，共焦
显微拉曼光谱具有较高的横向及纵向分辨率，可以
获得微生物所含化学成分的多维信息 ；共振增强拉
曼光谱适用于特殊物质的检测，如深紫外共振拉曼
光谱适用于检测芳香族化合物和核酸物质 ；表面增
强拉曼光谱极大增加拉曼散射强度，可检测到常规
拉曼光谱难以检测到的信息 ；拉曼成像包含丰富光
谱信息，能直观反映细胞内部物质成分的空间分布、
结构及变化，反斯托克斯拉曼成像通过共振激发提
供较高的信号和光强，能够快速获得细胞内特定分
子的分布及相互作用 ；激光镊子拉曼光谱可实时监
测单细胞的动力学过程，在探索微生物生命规律方
面具有巨大潜力 ；Raman-FISH 最主要的优点是在单
细胞水平原位直接识别和量化微生物中标记化合物
的代谢。
激光及检测技术的进步推动了拉曼光谱仪向小
型化、高性能和低成本方向发展，使拉曼光谱的原位、
快速、无损检测性能更加完善，拉曼光谱在微生物
科学研究领域正显示出更广泛的应用前景。拉曼光
谱可实现微生物生化动力学过程的实时跟踪，从而
能深入了解细胞内生物大分子的活动规律，反映微
生物细胞内化学成分的分布和变化，为基础微生物
学研究提供依据。利用拉曼光谱技术可有效地监测
微生物发酵的动态过程，获取底物消耗、产物生成
及胞内其他成分变化等信息，是研究发酵微生物学
的新兴技术［28，34］。快速和准确地诊断致病菌是控
制细菌感染关键，拉曼光谱技术凭借高速检测已成
为微生物诊断的新方法［35-38］，基于拉曼光谱的诊断
可以应用到单个细菌，使直接分析临床标本而而无
需对细菌进行纯培养成为可能，随着多技术的高效
集成化，拉曼光谱将在微生物探测、识别、分选及
2012年第10期 67孙美娟等 ：拉曼光谱技术在微生物学中的应用
动力学的研究上，甚至在生理生化研究、药理实验、
医学诊断方面发挥越来越大的作用。
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（责任编辑 狄艳红）