全 文 ：收稿日期:2012-03-05; 修订日期:2012-06-14
基金项目:河北省自然科学基金( No． 08B032; C2010000489) ;
河北省卫生厅科研基金( No． 08053) ;
河北医科大学教育科学研究重点项目( No． 09zd － 17)
作者简介:张嫚丽( 1978-) ，女( 汉族) ，黑龙江五常人，现任河北医科大学
副教授，博士学位，主要从事天然产物活性成分研究工作．
* 通讯作者简介:史清文( 1964-) ，男( 汉族) ，河北沧州人，现任河北医科
大学教授，博士学位，主要从事天然产物活性成分研究工作．
异土木香内酯的微生物转化研究
张嫚丽1，高 洁2，王于方1，霍长虹1，李力更1，史清文1*
(1．河北医科大学药学院，河北 石家庄 050017;
2．石药集团中诺药业有限公司研发一部，河北 石家庄 050091)
摘要:目的 对异土木香内酯进行微生物转化研究。方法 从 47 株真菌中筛选出对异土木香内酯转化能力强的菌株进行
转化。采用色谱法及波谱技术对转化产物进行分离和结构鉴定。结果 得到 3 个转化产物，分别鉴定为: 3α －羟基异土
木香内酯 ( 1) ，3α －羟基 － 11，13 －二氢异土木香内酯( 2) 和 2α －羟基异土木香内酯 ( 3) 。结论 化合物 1 ～ 3 为首次通
过微生物转化得到的产物。
关键词:异土木香内酯; 微生物转化; 刺囊毛霉; 黑曲霉
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 09． 025
中图分类号:R284． 1 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2012) 09-2171-02
Microbial Transformation Research of Isoalantolactone
ZHANG Man-li1，GAO Jie2，WANG Yu-fang1，HUO Chang-hong1，LI Li-geng1，SHI Qing-wen1*
( 1． School of Pharmacological Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017; 2． Department of R＆D，
CSPC Zhongnuo Pharmaceutical，Shijiazhuang 050091，China)
Abstract: Objective To investigate the macrobial transformation of isoalantolactone． Methods Forty － seven strains of fungi
were screened for their capabilities to transform isoalantolactone． The biotransformation products were isolated by silica gel column
chromatography and their structures were elucidated according to the spectral data． Results Three biotranformation products were
obtained and identified as 3 － hydroxy － isoalantolactone ( 1) ，3 － hydroxy － 11，13 － dihydroisoalantolactone( 2) and 2 － hydroxy
－ isoalantolactone ( 3) on the basis of their spectral data． Conclusion Compounds 1 － 3 were obtained through biotransformation
of isoalantolactone by fungi for the first time．
Key words: isoalantolactone; Macrobial transformation; M． spinosus; Spergillus niger
微生物转化，即指外源性化学物或称底物在微生物体内经
过多种酶催化的代谢转化过程，具有选择性强、反应效率高、条件
温和、反应多样性好等特点。目前，微生物转化技术已广泛应用
到天然药物的研究中，通过微生物转化反应可以对天然药物中的
活性成分进行结构修饰，得到一系列的衍生物，丰富天然产物库，
并从中寻找或开发出先导化合物或新药。另外也可以通过生物
转化反应将一些在植物体内含量比较大、廉价易得的成分定向的
转化为其他活性成分，从而实现工业化生产。
异土木香内酯(Isoalantolactone )属桉烷型倍半萜内酯类化
合物，是中药土木香中的主要活性成分，含量高达 1． 2% ～
5． 6%［1］。药理学研究表明异土木香内酯具有较强的驱虫、抗原
虫、抗菌等活性。在体外抗真菌活性试验中，异土木香内酯可抑
制 5 种致病真菌 Aspergillus flavus、A． niger、Geotrichum candidum、
Candida tropicalis和 C． albicams 的生长，最低抑菌浓度(MIC)分
别为 50，5，25，25 和 25 μg /ml［2］。但该成分也具有一定的毒性，
且由于其极性较小，在进行抗肿瘤活性筛选时因溶解度较差而不
能有效地评价其对肿瘤细胞增殖的抑制活性。故本研究以真菌
作为生物体系对异土木香内酯进行微生物转化研究，改善其溶解
性并制备出一定的转化产物用于活性评价，为这一资源丰富、廉
价易得的单体成分的开发利用做基础研究。
1 仪器与试药
1． 1 仪器与试剂 MLS － 3020 高压灭菌器(日本三洋) ，SW － CJ
－ 2FD双人净化工作台(江苏净化设备有限公司) ，HZQ － X100
振荡培养箱(哈尔滨东联仪器公司) ，Waters高效液相色谱仪(美
国) ，配有 2695 泵和 2996 二极管阵列检测器，EYELA 旋转薄膜
蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司) ，SB － 2 型紫外光探测仪(天津
市分析仪器厂)。
柱色谱所用硅胶为 300 ～ 400 目(青岛海洋化工厂) ，制备液
相所用流动相试剂均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，异土木香
内酯对照品(自制，NMR 鉴定结构) ，PDA 培养液自制(方法:将
250 g去皮土豆切成小块，加适量水煮沸 30 min 后，用纱布将过
滤，滤液中加入 50 g葡萄糖，定容至 1 L)。
1． 2 菌株 短刺小克银汉霉 AS 3． 970(Cunninghamella blakeslee-
ana Lendner) ，雅致小克银汉霉 AS 3． 1207(Cunninghamella ele-
gans) ，雅致小克银汉霉 AS 3． 2028(Cunninghamella elegans) ，黑
曲霉 AS 3． 1858(Aspergillus niger) ，黑曲霉 AS 3． 739(Aspergillus
niger) ，黑曲霉 AS 3． 795(Aspergillus niger) ，多型孢毛霉 AS 3．
3443(Mucor polymorphosporus) ，刺囊毛霉 AS 3． 3450(M． spino-
sus) ，刺囊毛霉 AS 3． 3447(M． spinosus) ，刺囊毛霉 AS 3． 2450(M．
spinosus) ，细孢毛霉 AS 3． 2454(Mucor subtilissimus) ，葡枝根霉 AS
3． 2050(Rhizopus stolonofer) ，链格孢 AS 3． 4578(Alternaria alter-
nate) ，侧孢霉 AS 3． 2882(Sporotrichum sp．) ，总状共头霉 AS 3．
264(Syncephalastrum racemosum) ，燕麦镰孢 AS 3． 4594(Fusarium
avenaceum) ，球孢白僵菌 AS 3． 4273(Beauveria bassiana) ，梅林青
霉 AS 3． 4474(Penicillium melinii) ，蓝色犁头霉 AS 3． 3389(Ab-
sidia coerulea) ，灰葡萄孢 AS 3． 3790(Botrytis cinerea) ，藤仓赤霉藤
仓变种 AS 3． 4748(Gibberella fujikuroi var． fujikuroi) ，灰绿犁头霉
AS3． 3385(Absidia glauca) ，少根根霉 AS 3． 2896(Rhizopus arrhi-
zus)等 23 株真菌购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。编号
1 ～ 24 株真菌由华北制药集团新药研究开发有限责任公司生物
资源研究室提供。
2 方法
2． 1 异土木香内酯转化菌株的筛选试验 挑取生长良好的试管
斜面菌种的少量菌丝接种于装有 50 ml PDA培养基的 150 ml 摇
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL ． 23 NO． 9 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 9 期
瓶中，200 r /min、25 ～ 18℃下振荡预培养 2 ～ 3 d。
2． 1． 1 底物的添加与转化［3］ 用甲醇溶解异土木香内酯配成 10
mg /ml的储备液，加入到预培养后的菌液摇瓶中，每瓶菌液中加
入 0． 4 ml，相当于 4 mg 底物，同时每种菌株设一个空白对照组，
加入等体积的甲醇。菌液继续培养 4 d。
2． 1． 2 产物的提取与分离 培养结束后，减压滤取各菌株的发酵
液，发酵液用等体积乙酸乙酯萃取 3 次，合并 3 次萃取液，减压浓
缩，空白对照组用相同方法处理。将每个菌株的给药组与空白对
照组，及底物点样于硅胶 GF254薄板上，以石油醚 －乙酸乙酯(7∶
3)系统展开，紫外 254 nm 下观察暗斑，365 nm 下观察荧光后，
10%浓硫酸乙醇溶液加热显色。对比是否有新的斑点以推测是
否出现转化产物;同时采用高效液相色谱进行检测(甲醇 －水 40
∶ 60→100∶ 0，219． 5 nm) ，对比添加底物组发酵液和对照组发酵
液液相色谱图。
2． 2 刺囊毛霉 AS 3． 3450 对异土木香内酯的转化 用装有 300
ml培养液的 1000 ml三角瓶作为摇瓶进行转化反应，共 10 瓶;每
个摇瓶中加入 1 ml浓度为 10 mg /ml的异土木香内酯甲醇溶液，
继续培养 4 d。最后所得转化后发酵液的乙酸乙酯萃取物约
1． 0 g，进行硅胶柱色谱分离，石油醚 －乙酸乙酯(8∶ 2)等度洗
脱，每 15 ml为 1 个流份，共收集 30 个流份。其中 Fr． 15 ～ 18 析
出白色粒状结晶，记为 Z － 1;Fr． 22 ～ 24 析出白色粒状结晶，记为
化合物 3。经制备高效液相色分离(色谱条件为流动相:甲醇 －
水(65∶ 45)、检测波长 219． 5 nm、流速 3． 0 ml·min －1) ，固体 Z －
1 分离的到化合物 1 和 2。以上 3 个转化产物的结构式见图 1。
图 1 异土木香内酯及其代谢产物 1 ～ 3 的结构式
3 结果
3． 1 菌株筛选实验 考察 47 株真菌对异土木香内酯的转化能
力，结果表明:刺囊毛霉 AS 3． 3450 和黑曲霉 AS 3． 1858 两株真
菌对底物异土木香内酯具有转化能力，见图 2。考虑到菌株的转
化能力及转化产物的多样性，我们最终选择 AS 3． 3450 作为本研
究的转化菌株放大试验。
a －异土木香内酯 b －菌株 AS 3． 3450 空白菌液
c －菌株 AS 3． 3450 转化菌液 d －菌株 AS 3． 1858 空白菌液
e －菌株 AS 3． 1858 转化菌液
图 2 菌株 AS 3． 3450 和 AS 3． 1858 菌液的 HPLC色谱图
3． 2 转化产物的结构鉴定
3． 2． 1 化合物 1 白色粒状结晶。EI － MS m/z:249 ［M +
H］+。1H － NMR谱可见:δ6． 14(1H，br． s) ，5． 60(1H，br． s)与 δ5．
00(1H，br． s) ，4． 61(1H，br． s)为两对环外双键端基氢信号;δ4．
33(1H，t，J = 1． 8)和 4． 52(1H，m)为连氧氢信号。与底物异土木
香内酯氢谱相比，化合物 1 多了一个连氧氢信号，且分子量相差
16，推测可能在异土木香内酯的结构上取代一个羟基。1HNMR
(CDCl3，600 MHz) :δ1． 80(1H，m，H －1a) ，1． 30(1H，m，H － 1b) ，
1． 78(2H，m，H －2) ，4． 33(1H，t，J = 1． 8Hz，H － 3) ，2． 42(1H，br．
d，J = 13． 2Hz，H － 5) ，1． 74(1H，m，H － 6a) ，1． 34(1H，m，H －
6b) ，3． 01(1H，qui，J = 6． 0Hz，H － 7) ，4． 52(1H，m，H － 8) ，2． 21
(1H，br． d，J = 7． 2Hz，H －9a) ，1． 58(1H，dd，J = 15． 6，4． 8Hz，H －
9b) ，6． 14(1H，br． s，H － 13a) ，5． 60(1H，br． s，H － 13b) ，0． 82
(3H，s，H － 14) ，5． 00(1H，br． s，H － 15a) ，4． 61(1H，br． s，H －
15b)。13CNMR(CDCl3，600MHz) :δ35． 7(C － 1) ，29． 0(C － 2) ，73．
3(C － 3) ，150． 2(C － 4) ，40． 3(C － 5) ，27． 1(C － 6) ，40． 7(C －
7) ，77． 2(C － 8) ，41． 0(C － 9) ，34． 1(C － 10) ，142． 1(C － 11) ，
170． 6(C － 12) ，120． 2(C － 13) ，16． 9(C － 14) ，109． 9(C － 15)。
以上数据与文献［4］报道一致，故确定化合物 1 为 3α －羟基异土
木香内酯(isotelekine)。
3． 2． 2 化合物 2 白色粒状结晶。EI － MS m/z:251［M + H］+，
234［M － OH］+。1H － NMR 谱可见:5． 00(1H，br． s) ，δ4． 60(1H，
br． s)为一对环外双键端基氢信号;δ4． 33(1H，t，J = 1． 8)和 4． 72
(1H，qua)为连氧氢信号。比较化合物 2 与 1 的氢谱，化合物 2
少了一对环外双键端基质子信号，且二者相差 2 个分子量。推测
化合物 2 可能是 1 的 11，13 － 二氢衍生物。1HNMR(CDCl3，600
MHz) :δ1． 79(1H，m，H －1a) ，1． 30(1H，m，H － 1b) ，1． 77(2H，m，
H － 2) ，4． 33(1H，t，J = 1． 8Hz，H － 3) ，2． 36(1H，br． d，J =
12． 6 Hz，H －5) ，1． 64(1H，m，H －6a) ，1． 26(1H，d，J = 13． 2Hz，H
－6b) ，2． 11(1H，qui，H －7) ，4． 72(1H，qua，H － 8) ，2． 18(1H，br．
d，J = 6． 6Hz，H － 9a) ，1． 50(1H，dd，J = 15． 6，4． 8Hz，H － 9b) ，
2． 46(1H，br． d，J = 7． 8Hz，H － 11) ，1． 31(3H，d，J = 7． 8Hz，H －
13) ，0． 81(3H，s，H －14) ，5． 00(1H，br． s，H － 15a) ，4． 61(1H，br．
s，H －15b)。13CNMR(CDCl3，600MHz)δ:35． 8(C － 1) ，29． 0(C －
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时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 9 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL． 23 NO． 9
2) ，73． 3(C － 3) ，150． 3(C － 4) ，40． 5(C － 5) ，25． 9(C － 6) ，42． 5
(C － 7) ，77． 4(C － 8) ，41． 2(C － 9) ，34． 5(C － 10) ，44． 6(C －
11) ，180． 2(C － 12) ，14． 1(C － 13) ，17． 0(C － 14) ，109． 8(C －
15)。以上数据与文献［5］报道一致，故确定化合物 2 为 3α －羟
基 － 11，13 －二氢异土木香内酯(dihydroisotelekine)。该化合物
仅在 Telekiaspeciosa植物中得到过。
3． 2． 3 化合物 3 白色粒状结晶。EI － MSm/z:247［M － H］+，
221［M + H － CO］+。1H － NMR 谱可见:δ6． 06(1H，br． s) ，5． 55
(1H，br． s)与 δ4． 80(1H，br． s) ，4． 48(1H，br． s)为两对环外双键
端基氢信号;δ3． 75(1H，m)和 4． 44(1H，t)为连氧氢信号。与底
物异土木香内酯氢谱相比，化合物 3 多了一个连氧氢信号，且分
子量相差 16，推测可能在异土木香内酯的结构上取代一个羟
基。1HNMR(CDCl3，600MHz) :δ1． 82(1H，m，H － 1a) ，1． 12(1H，
m，H －1b) ，3． 75(1H，m，H － 2) ，2． 60(1H，dd，J = 12． 0，4． 8Hz，H
－3a) ，1． 93(1H，t，J = 11． 4Hz，H － 3b) ，1． 77(1H，br． d，J =
12． 6Hz，H －5) ，1． 72(1H，m，H － 6a) ，1． 25(1H，m，H － 6b) ，2． 94
(1H，m，H －7) ，4． 44(1H，t，H －8) ，2． 17(1H，br． d，J = 15． 6Hz，H
－9a) ，1． 47(1H，dd，J = 15． 6，4． 8Hz，H － 9b) ，6． 06(1H，br． s，H
－13a) ，5． 55(1H，br． s，H －13b) ，0． 75(3H，s，H － 14) ，4． 80(1H，
br． s，H － 15a) ，4． 48(1H，br． s，H － 15b)。13 CNMR(CDCl3，
600MHz) :δ50． 1(C － 1) ，66． 8(C － 2) ，46． 2(C － 3) ，146． 0(C －
4) ，45． 4(C － 5) ，27． 2(C － 6) ，40． 3(C － 7) ，76． 7(C － 8) ，40． 9
(C － 9) ，33． 8(C － 10) ，141． 8(C － 11) ，170． 6(C － 12) ，120． 5(C
－ 13) ，18． 7(C － 14) ，109． 1(C － 15)。以上数据与文献［6］报道
一致，故确定化合物 3 为 2α －羟基异土木香内酯(ivalin)。
4 讨论
三个转化产物均为已知化合物，其中 11，13 － dihydroisotele-
kine (2)为土木香植物中自然存在的化合物，isotelekine (1)和
ivalin (3)为土木香植物中首次发现。
Ivalin (3)文献［7］报道，具有剂量依赖性的降低脂多糖
(LPS)诱导的 RAW264． 7 细胞一氧化氮(NO)生成及诱生型一氧
化氮合酶(iNOS)mRNA 的表达，从而达到很好的抗炎效果。可
通过本研究中的微生物转化反应，以廉价易得的异土木香内酯为
原料定向的获得这一活性目标产物。
参考文献:
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Nitric Oxide Production in RAW264． 7 Macrophage Cells［J］． Chemical
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收稿日期:2012-02-05; 修订日期:2012-06-20
基金项目:河南省教育厅自然科学研究计划项目( No． 2010B320011)
作者简介:吴志燕( 1980-) ，女( 汉族) ，河南新乡人，现任新乡医学院第一
附属医院住院医师，学士学位，主要从事白血病的防治工作．
* 通讯作者简介:尹雅玲( 1980-) ，女( 汉族) ，河南平顶山人，现任新乡医
学院基础医学院讲师，硕士学位，主要从事白血病的防治研究工作．
黄芪多糖组分 － A3 对 HL60 白血病细胞
的抑制增殖和诱导分化作用
吴志燕1，贾岩龙2，赵繁荣2，李 鹏2，尹雅玲3*
(1．新乡医学院第一附属医院，河南 新乡 453003; 2．新乡医学院·药学院，河南 新乡 453003;
3．新乡医学院·基础医学院，河南 新乡 453003)
摘要:目的 研究黄芪多糖组分 － A3( APS － A3) 对 HL60 白血病细胞的抑制增殖和诱导分化作用。方法 用 10 －5 mol /L、
10 －6 mol /L和 10 －7mol /L APS － A3 作用 HL60 白血病细胞 5 d，采用液体培养，2，3 －双( 2 －甲氧基 － 4 －硝基 － 5 磺基苯)
－ 5 －［( 苯胺基) 羰基) ］－二氢 －四氮唑氢( XTT) 试验和集落形成抑制试验观察 HL60 细胞增殖能力;用流式细胞术检
测 HL60 细胞周期;通过 Wright － Giemsa染色和表面分化抗原 CD14 表达观察 APS － A3 对 HL60 细胞分化的作用。结果
XTT试验和集落形成抑制试验均显示 APS － A3 剂量依赖性地抑制 HL60 细胞增殖，与对照组比较有显著差异 ( P ＜
0． 01) ;细胞周期显示 APS － A3 剂量依赖性地将 HL60 细胞周期阻滞在 S 期( P ＜ 0． 01) ;形态学观察 APS － A3 处理后的
HL60细胞体积变大，核浆比例减少，趋向成熟分化;流式细胞术检测经过 10 － 5mol /L APS － A3 处理 5 d后的 HL60 细胞
膜上 CD14 表面标记表达阳性率为( 84． 67% ± 8． 87% ) ，显著高于对照组( P ＜ 0． 01) 。结论 APS － A3 对 HL60 白血病细
胞具有明显的抑制增殖和诱导分化作用。
关键词:黄芪多糖; 白血病; HL60; 分化
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2012． 09． 026
中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805( 2012) 09-2173-03
黄芪是豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的根，具有补气固
表、利水退肿、托毒排脓、生肌等功效。黄芪含多糖、皂苷、蔗糖、
多种氨基酸、叶酸及硒、锌、铜等多种微量元素，黄芪多糖组分 －
A3(APS － A3)是黄芪多糖的主要成分之一，可经萃取、分离而
得［1］。研究表明，黄芪多糖具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、
抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用［2 ～ 7］。本研究采用人
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2012 VOL ． 23 NO． 9 时珍国医国药 2012 年第 23 卷第 9 期