全 文 ：·综述与专论· 2014年第3期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
近年来，随着基因工程和细胞工程技术的发展，
众多目的基因在原核和真核细胞中被克隆和表达出
来，以此提高外源蛋白的表达能力。长期以来，大
肠杆菌一直被用作表达外源基因的宿主菌，并成功
地表达了多种外源蛋白，但是它不能表达结构复杂
的蛋白质，且分泌型表达产量较低。而酵母作为一
种表达外源基因的宿主菌，既具有原核生物生长特
性、操作简单，又具有真核细胞的翻译后修饰加工
特性。在表达某些基因工程产品时，可以大规模生产，
从而有效地降低成本。其中，酿酒酵母是最早用来
作为异源蛋白基因表达系统并加以应用的酵母系统，
收稿日期 ：2013-09-27
基金项目 ：国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA021201）
作者简介 ：闵兆升，男，硕士，研究方向 ：酶工程及其关键技术 ；E-mail ：minzhaosheng@163.com
通讯作者 ：洪厚胜，男，博士，教授，研究方向 ：生物过程及生化反应设备 ；E-mail ：hhs@njut.edu.cn
巴斯德毕赤酵母（P. pastoris）高密度发酵研究进展
闵兆升1  郭会明1  颜旭2  洪厚胜2
（1. 南京工业大学理学院，南京 210009 ；2. 南京工业大学生物与制药工程学院，南京 210009）
摘 要 ： 高密度发酵已经成为提高毕赤酵母目的蛋白表达量的关键技术之一，而其中发酵工艺又是高密度发酵的一个重要
因素。主要从巴斯德毕赤酵母遗传学特性、表达宿主菌、表达载体、外源蛋白的表达方面进行了阐述，并从毕赤酵母工程菌的选择、
培养基的优化设计、发酵过程关键参数调控以及甲醇诱导等方面阐述毕赤酵母的高密度发酵。最后，提出了巴斯德毕赤酵母高密
度发酵过程中存在的问题并进行展望。
关键词 ： 巴斯德毕赤酵母 表达系统 高密度发酵 过程参数 甲醇
Progress of Pichia pastoris Engineering Bacteria on High-Density
Fermentation
Min Zhaosheng1 Guo Huiming1 Yan Xu2 Hong Housheng2
（1. College of Sciences，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009 ；2. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering，
Nanjing University of Technology，Nanjing 210009）
Abstract:  High-density fermentation has been a key technique tache to improve the expression level of the protein, and fermentation
process is an important factor in high-density fermentation. The Pichia pastoris protein expression on its genetic characteristics, host strains,
expression vectors and the expression of heterologous proteins in the areas of basic researches were reviewed. In addition, we briefly discussed
high-density fermentation of Pichia pastoris in the selection of engineering bacteria, designation and optimization of culture medium, control
of the key biochemical parameters of fermentation process, and methanol induction. In the end, the problems existing in industry high-density
fermentation progress were put forward, and the development trend was prospected.
Key words:  Pichia pastoris Expression system High-density fermentation Process parameters Methanol
然而研究表明，其并不是表达外源基因的理想宿主
菌［1，2］。直至 1969 年，Ogata 等首次发现一种嗜甲
醇酵母—巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris），它可以
在甲醇为唯一碳源的条件下生长，其中，醇氧化酶
（Alcoholoxidase，AOX）是甲醇代谢途径中的第一个
酶，它可以将甲醇氧化成甲醛和过氧化氢，在以甲
醇为唯一碳源的条件下，AOX1 可占到细胞分泌总
蛋白的 30%。经过近几十年的发展，目前，巴斯德
毕赤酵母已成为最广泛的外源蛋白表达系统之一。
它具有其他表达系统所无可比拟的优越性 ：生长速
度快，表达量高，能对外源基因进行正确翻译和修
2014年第3期 43闵兆升等 ：巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）高密度发酵研究进展
饰，克服了大肠杆菌表达蛋白结构简单，表达量低
的缺点，也克服了酿酒酵母系统缺乏强有力的启动
子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易
于丢失等缺点并且自身分泌的背景蛋白少，糖基化
程度低，对营养要求低，可采用廉价的培养基，可
实现高密度发酵［3-5］。郝晶［6］利用毕赤酵母生产重
组蛋白 A，经 68 h 的诱导后，rSPA 产量可达 8.8 g/L，
占发酵液中总蛋白的 80% 以上，较大肠杆菌表达系
统有明显提高。Ma 等［7］对来自大肠杆菌和毕赤酵
母的 rLTB 的特性作了比较，其结果表明，rLTB 在
毕赤酵母中的表达量是其在大肠杆菌中的 6 倍且具
有更高的活性，具有显著的优势。正是由于这些优
点，使得巴斯德毕赤酵母迅速发展成为分子生物学、
医学、生物工程学等领域中的研究热点。
1 P.pastoris 表达系统
1.1 P.pastoris的遗传学特性
P.pastoris 之所以能够利用甲醇作为碳源，是因
为甲醇能够诱导 AOX 的基因表达，产生 AOX1 和
AOX2，使其含量高达总细胞蛋白的 30%-40%。而
当以葡萄糖、甘油等作为碳源时，反而会受到抑制，
使得 AOX 几乎不表达。研究表明，AOX 的表达是
受转录水平调控的，其强诱导型启动子 PAOX 能非
常有效地控制外源基因的表达［8］。如今，研究者已
经在巴斯德毕赤酵母染色体中鉴定到了 2 种 AOX 基
因， 即 AOX1 和 AOX2。 虽 然 AOX2 与 AOX1 各 自
编码的蛋白质有 97% 的同源性和几乎相同的特异性
催化活性。但是 AOX1 基因的启动子（PAOX1）却
受甲醇强烈诱导，而 PAOX2 则很弱［9］。毕赤酵母
的另一个遗传学特点是甲醇代谢所需的醇氧化酶被
分隔到过氧化物酶体（Peroxisome）中，形成区域
化。当以葡萄糖为碳源时，菌体中的过氧化物酶体
的量微乎其微，而在以甲醇作为碳源时，过氧化物
酶体几乎占到整个细胞的 80%。因此，可以利用同
源重组方式在 AOX 基因前插入外源蛋白基因，即
可获得大量表达。同时，根据甲基营养型酵母这种
可以形成过氧化物酶体的特性，使得利用该系统表
达一些毒性蛋白和易被降解的酶类，以及用于研究
细胞特异区域化的生物发生机制和功能变得更加
容易［8，10］。
1.2 P.pastoris表达系统的构成
1.2.1 表达宿主菌 目前，常见的 P.pastoris 表达
宿 主 菌 有 GS115、KM71、X-33、MP-36、MC100-3、
PMAD16、SMD1168 及 SMD1165 等， 根 据 编 码
AOX1 或 AOX2 基因的缺失造成对甲醇的利用能力
的差异，可将其分为 3 种表型 ：宿主菌 GS115、X-33
及 SMD1168 等大多数菌株，因其具有完整的编码
AOX1 和 AOX2 基因，在含有甲醇的培养基上能够
迅速生长，故表型为 Mut+（甲醇利用快速型），其中
GS115 宿主菌目前应用最广泛 ；而宿主菌 KM71 则
缺少 AOX1 基因，只能依赖 AOX2 产生 AOX，因此
与 GS115 这类菌株相比，其利用甲醇的能力有所降
低，故表型为 Muts（甲醇利用缓慢型）；最后一种类
型 MC100-3 菌株则由于其编码 AOX1 和 AOX2 基因
均被剔除，所以在含有甲醇的培养基上完全不能生
长，故其表型为 Mut-（甲醇不利用型）［11，12］。
1.2.2 表达载体 由于 P.pastoris 本身没有稳定的附
加载体，故使用整合型载体，通常也称之为穿梭载体。
它可以通过先在原核细胞大肠杆菌中保存、扩增和
构建，然后线性化后转入酵母细胞［13］。常见的胞
内表达载体有 pPIC3、pPICZA、pPSC3k 和 pAO815
等，分泌型表达载体有 pPIC9、pPIC9K、pHIL-S1p、
YAM7SP6 和 pGAPZα 系列等［14］。此类载体都以组
氨醇脱氢酶基因（His4）作为选择标记，具有共同
的一般结构（表 1）。一般包含易于在大肠杆菌中扩
增的原核启动子，同时含有 AOX1 基因的 5AOX1
启动子、3AOX1 终止子、编码 N 端分泌信号（SIG）、
抗氨苄青霉素基因（Amp）、多克隆位点（MCS）、C
末端聚组氨酸标签、还有一些特定的限制性内切酶
位点。这样的方式不仅便于外源基因通过质粒整合
到酵母基因组并进行筛选、表达，同时也有利于外
源蛋白的检测和纯化［14，15］。
因此，在表达载体的选择上，应首先考虑异源
蛋白需要的是胞内表达还是胞外表达，然后选择哪
一类表达载体 ；其次，根据启动子是否需要诱导可
进一步选择是如 pPCZ、pPIC9k 等这类诱导型质粒，
还是如 pGAPZ、pAOS1 等这类组成型表达质粒，但
针对特定蛋白、特定应用体系更适合哪种质粒目前
还尚无定论。目前，随着 Zeocin 抗性的 Shble 基因
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期44
的研究使用，具有 Zeocin 抗性系列质粒如 ：pPICZ、
pGAPZ 等不仅解决了传统质粒碱基数多、不便遗传
操作及转化子不够稳定等的问题，而且根据 Zeocin
浓度进行高拷贝筛选技术较传统技术要容易的多，
所以 Zeocin 抗性系列质粒在现今的科研应用中变得
越来越广泛［16］。
1.3 外源蛋白在P.pastoris中的高效表达
1.3.1 外源蛋白在 P.pastoris 中的表达过程 毕赤酵
母发酵表达外源蛋白的过程大致可分为 3 个阶段 ：
首先是合成或克隆目的基因，一般常选用分泌型表
达载体，因此外源基因的阅读框架和信号肽的阅读
框架必须保持一致 ；其次，将重组载体线性化，然
后转化酵母菌，一般选用原生质球法或电击转化法，
目前，后者较为常用，且效果好 ；最后，对转化子
进行筛选，检测外源蛋白是否表达，然后对优良的
转化子进行扩大培养，以便于工业化生产［17］。
1.3.2 影响外源基因在 P.pastoris 中表达水平的主要
因素 虽然目前已经有众多外源基因在毕赤酵母中
成功表达，且分泌表达量也比较高，如刘逸寒等［18］
的毕赤酵母表面展示磷脂酶 T 高密度发酵优化研究
中，菌体量达到了 67.4 g/L。但是随着应用体系的增
加，也会出现蛋白表达量很低的情况。而其中，影
响目的蛋白产量的最主要因素就是其自身特性，另
外还包括具体的发酵工艺和发酵参数等。即使如此，
研究人员发现仍然可以通过对外源基因的内部结构
改造，调整优化培养基的成分、培养条件、诱导方
式等发酵工艺和发酵参数这样的技术来降低蛋白酶
降解作用，增加外源蛋白的表达量及提高产物稳定
性。以下就这些因素做一点总结［19-26］。
1.3.2.1 目的基因的特性 目的基因的特性是决定
表达成败的首要因素。诸多 A + T 含量高的基因在
P.pastoris 表达时因在成熟前终止而不能有效转录，
特定的 A + T 富含区可作为多腺苷酸或转录终止信
号，导致仅产生低水平或截短的 mRNA。共有序列
ATTATTTATAAA 就是一个典型的转录终止信号。目
的基因特性对表达的影响被认为是一种具有种属特
异性的现象。因此对 A+ T 含量丰富的基因最好是重
新设计序列，在某些情况下，可通过定点突变去除
成熟前终止结构域或替换稀有密码子，使 A + T 含
量控制在一个理想的理论范围之内。
1.3.2.2 mRNA 5 端 非 翻 译 区（untraslated region，
UTR）外源基因序列中的 mRNA 5-UTR 的核苷酸
序列和长度是影响外源基因能否高效表达的又一重
要因素。mRNA 5-UTR 的长度与核糖体 40S 亚基识
别有着密切关联，太长或太短都会造成识别障碍，
只有适当的 mRNA 5-UTR 的长度才能极大地促进
mRNA 的有效翻译。
1.3.2.3 密码子 外源基因的表达量还与密码子的
选择密切相关。在酵母中表达量较高的基因往往采
用的都是酵母所偏爱的密码子，在 61 个密码子中，
有 25 个是酵母所偏爱的密码子，高表达的基因几
乎毫无例外地使用这 25 个偏爱的密码子，而稀有密
码子密集区往往制约外源蛋白的翻译速率。张宇婷
等［22］研究将 aiiaB546 基因中所有低偏爱性密码子
及大部分中等偏爱性密码子替换为高偏爱性密码子，
结果表明其在毕赤酵母中的表达量和活性分别提高
了 12.4% 和 9.53%。
1.3.2.4 拷贝数（基因剂量） 虽然目前基因拷贝数
对表达量的影响是仍然无法预测，而高表达菌株的
筛选也只以表达蛋白量的大小为唯一标准。但是不
可否认的是外源基因的拷贝数对 P.pastoris 高效表达
是有重要影响的。大多数情况下，外源蛋白的表达
量会随着拷贝数的增加而相应增加。龚香艺等［24］
通过增加毕赤酵母拷贝数使得胰岛素前体的产量提
高了 2.7 倍，且没有出现因为高拷贝数而表现出生
长不良的现象。但有些基因的高拷贝数反而会降低
其表达水平，这可能是因为过高的表达会使得分泌
效率低的蛋白对分泌途径形成负反馈抑制。
1.3.2.5 蛋白酶的降解 对于表达分泌型外源蛋白
来说，蛋白酶降解对其影响及其重要。是因为蛋白
表 1 P.pastoris 表达载体的结构与功能
结构 功能
5AOX1 含 AOX1 启动子的 1kb 左
右的 DNA 片段
介导质粒与基因组整合和
甲醇诱导下高效表达
3AOX1 醇氧化酶基因片段 介导整合
SIG 编码 N 端分泌信号 介导外源蛋白分泌
Amp 抗氨苄青霉素基因 筛选标记
MCS 多克隆位点 外源基因的整合
His4 编码组氨醇脱氢酶基因 遗传标记
ColE1 大肠杆菌复制起点 复制
2014年第3期 45闵兆升等 ：巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）高密度发酵研究进展
酶降解不但会引起目的蛋白表达水平的下降、还会
造成生物活性的降低，同时，还会增加后续的分离
纯化过程的难度，以及容易造成产物污染等。目前，
常通过以下几种方法来减少蛋白酶的影响 ：（1）找
出并选择能够避开蛋白酶作用的最适培养 pH 和温
度，从而减少对外源蛋白的降解 ；（2）通过增加适
量的如蛋白胨、酪蛋白水解物和胃蛋白酶水解物这
类富含氨基酸和多肽的蛋白酶水解底物来减少外源
蛋白的降解作用 ；（3）通过添加抑制剂，如天冬氨
酸型蛋白酶、半胱氨酸型蛋白酶及丝氨酸型蛋白酶
等这类特异性蛋白酶，也可减少外源蛋白的降解 ；
（4）构建适宜的蛋白酶缺陷型菌株 ；（5）通过共同
表达来抑制蛋白酶活性，即将外源蛋白与另一种能
够在毕赤酵母中稳定的蛋白伴侣融合表达，减少目
的蛋白降解，提高稳定性［25，26］。（6）外源蛋白的表
达还与具体的发酵工艺、参数和应用体系有着密切
的关联。
2 毕赤酵母基因工程菌的高密度发酵
在毕赤酵母表达外源蛋白的大规模高密度发酵
过程中，由于其耗氧较高，对发酵罐有特别的要求，
往往需采用高溶氧发酵罐进行发酵。其发酵过程分
为两个阶段，即菌体生长增殖阶段和诱导外源蛋白
表达阶段。在菌体增殖阶段，细胞通常以甘油或葡
萄糖为碳源进行扩大培养，在获得所需要的菌体密
度后，再进入外源蛋白诱导表达阶段。外源蛋白表
达阶段是以甲醇作为唯一碳源并且诱导目的蛋白表
达。另外，在工业生产中，不但需要通过诸如菌株
表型、启动子的选择、培养基及培养条件等的改良
优化来获得高产量，同时也要注重发酵批次之间的
可重复性。因此需要在成熟稳健的自动化的条件下
进行发酵控制，这些发酵控制的策略主要包括 ：发
酵参数监控、甲醇流加方式等［27，28］。
2.1 菌种的选择与改良
目前用于高密度大规模发酵的毕赤酵母菌株主
要是这 2 种表型 ：mut+ 和 muts。这主要根据具体的
外源蛋白来选择，如根据表达产物的分子大小、降
解产物的多少、蛋白折叠程度等性质选择工程菌的
表型。一般选用无基因缺陷的 mut+ 菌株，对外源蛋
白适用性好，便于发酵控制以及后续产品的制备 ；
如果是胞内表达，则一般选用 muts 菌株，这样得到
的蛋白产物中 AOX 较少而目的蛋白量则相对较多，
约占毕赤酵母总分泌蛋白量的 30%-90%，且使得下
游的分离纯化更容易进行［29］。
因此，为了获得高表达量的表达菌株，需要对
大量转化子进行筛选，这就要求选择和构建基因工
程菌株时，不仅要考察菌体对表达产物的表达水平，
还要考虑到该表达系统对表达产物的影响。即如果
工程菌表达系统中表达产物易降解或易受培养基成
分的影响，则需要考虑表达产物是选择分泌表达还
是细胞内表达。
2.2 培养基的选择与优化
培养基的组成是高密度发酵的基础，其直接影
响细胞的生长和外源基因的表达。目前，在毕赤酵
母高密度培养时，大多采用的还是 BMGY/BMMY、
BMG/BMM 和 BSM 这类 Invitrogen 公司提供的复合培
养基，也有部分使用 MGY/MMY 培养基。其中基础
盐培养基（BSM）是一种低成本的标准的发酵培养
基，一般用于发酵罐发酵，其提供了高浓度的基础
元素，在高 pH 值条件下往往容易产生盐沉淀，因此，
在生产时，一般会对其主要盐分的最优范围进行确
定，从而得到优化后的培养基。而 BMGY/BMMY、
BMG/BMM 培养基中由于包含能够起到稳定组分 pH
值作用的 PBS 缓冲液，因此特别适用于那些对 pH
敏感的表达产物的表达，但是在使用这类培养基时，
发酵时需要流加 PTM 盐，在发酵的过程中，还要严
格控制 PTM 盐的添加量，若浓度过高，也会使培养
基中产生沉淀，给发酵及后序的工作带来麻烦。另
外，此类培养基的成分较多，步骤增多，容易增加
污染的机会，成本也比较高［27，30］。田运佳等［31］在
利用毕赤酵母产植酸酶时，使用麦芽汁-麦麸培养基，
不仅满足了菌体生长所必需的营养物质，还能提供
了微量元素和维生素，进而使得优化后酶活提高了
近 1 倍。因此，在毕赤酵母高密度发酵生产中，培
养基的优化仍然是不可或缺的一步。
2.3 补料培养基的补加方式
毕赤酵母发酵过程中的补料培养基主要成分为
葡萄糖和甘油。葡萄糖作为碳源性价比较高，适合
工业化生产需要 ；而以甘油为碳源，虽然效果要优
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期46
于葡萄糖，但其成本较高，且需要严格控制其浓度，
过高或过低的甘油浓度都会菌体的生长产生抑制作
用。另外，就补料方式来说，目前主要有以下 3 种
方式 ：间歇式补料发酵、恒速流加补料发酵及指数
流加发酵［30，34］。间歇式补料发酵即按照一定的时间
间隔进行补料，是一种最常见的流加发酵方式 ；恒
速流加补料发酵，即在菌体增殖过程中始终维持恒
定的流速进行补料，直至诱导阶段开始 ；指数流加
发酵是指根据酵母菌的生长特性，即利用菌体量在
其生长范围内呈指数方式增殖的特性，控制流加补
料也随时间以指数形式增加，但是这种流加方式的
前提是需要对菌体的生长速率及特性有准确的把握，
才能保证菌体的正常生长和产物的高效表达。近些
年，研究者探讨出了新的补料方式——恒细胞密度
发酵策略，即通过不同的甲醇流加方式，实现发酵
过程细胞密度的合理控制。王辉林等［35］在重组毕
赤酵母生产碱性果胶酶的研究中通过恒细胞密度发
酵策略使得最终单位发酵液体积生产强度比传统高
密度发酵提高了 42.1％，且该策略还具有提高细胞
活性和降低蛋白酶降解作用等优势。总的来说，工
业化生产中的补料方式的选择要综合考虑生产成本
和目的产物的产量。
2.4 发酵过程参数控制
2.4.1 溶氧浓度（DO）的调控 高密度发酵需要消
耗大量的氧气，尤其对于毕赤酵母而言，甲醇诱导
阶段的溶解氧往往成为生长表达的限制性因子。若
供氧不足，不仅会抑制菌体呼吸作用，限制菌体生
长繁殖，而且会积累甲醇及其代谢产物甲醛和过氧
化氢，从而对菌体产生毒害，进而降低蛋白表达量，
且带来安全性问题。培养基中溶解氧的提高主要受
通气量、搅拌速度、罐压的直接影响，以及温度、
补料速度等的间接影响。为了尽可能地提高 DO 的
浓度，生产上开始采用通入按一定比例混合纯氧和
空气这种通气方式来提高供氧能力，以解决由于缺
氧带来的限制。但是，也有研究表明氧浓度太高同
样会抑制菌体的生长和繁殖［36，37］。目前，针对不同
的应用体系，毕赤酵母高密度发酵所需溶氧浓度仍
然没有一个定量的阐述，还有待进一步研究。
2.4.2 温度的调控 温度对菌体的生长和发酵的影
响也可以说是发酵动力学的影响，是各种因素综合
表现的结果。具体表现为 ：温度对发酵产物的活性、
生物合成方向以及发酵液的物理性质——溶氧量、
基质的新陈代谢速率等都有影响。通常来说，温度
的适当升高，有利于细胞的生长代谢和蛋白表达，
缩短发酵周期，但过高的温度也会使菌体过早衰老，
进而降低蛋白表达量和活性，使得表达产物的产量
受到影响［37］。因此，合理的温度调控应该基于不
同阶段的菌体生长特性调控不同的温度，即采用变
温发酵。一般而言，菌体生长最适温度为 28-30℃，
这有利于菌体大量而快速生长，但是菌体是最适生
长温度并不一定完全等同于菌体的诱导最适温度，
往往诱导温度要比生长温度低 2-3℃。因此，在诱
导阶段应适当降低温度，不仅可以缓减溶氧的压力，
还有利于新生肽链的正确折叠，提高蛋白稳定性和
表达量，同时，低温还可以提高 AOX 酶活性和转录
水平、减少菌体的凋亡以及保护目的表达产物不被
降解。
2.4.3 pH 的调控 pH 是整个生物发酵体系中的重
要化学参数，无论是对菌体的生长还是对目的产物
的诱导表达都有着极其重要的影响，尤其是诱导时
的 pH 会直接影响目的蛋白的表达、合成和活性。
虽然毕赤酵母具有比较宽的 pH 值，在 pH3-7 的条
件下均可以生长。但考虑到工程菌的生长过程会产
生各种代谢产物，而它们会对工程菌后期诱导表达
产生重要影响，且会增加后续分离纯化的难度，因此，
在发酵生产过程中一般控制 pH 在 4-6 之间，这样
既可以使菌体正常生长，又可以缓解代谢副产物对
菌体的抑制性影响。另外，在高密度发酵表达过程
中，为了保证目的表达产物的生物活性，防止被蛋
白酶降解，也必须选择合适的 pH 值。需要注意的是，
最适 pH 值的选择应尽量避免与目的表达产物的等
电点重合。在工业生产中一般选用氨水来调节 pH，
因为氨水可以作为补充菌体生长和表达目的产物所
需的氮源［37，38］。
2.5 诱导阶段甲醇流加方
在发酵过程中，由于过高浓度的甲醇会抑制细
胞的生长和产物的表达，因此通过合适的策略控制
甲醇的流加是提高外源蛋白表达量的关键。目前常
2014年第3期 47闵兆升等 ：巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）高密度发酵研究进展
采用以下 3 种方式来调控甲醇的流加 ：（1）根据溶
氧控制甲醇流加。（2）通过气相色谱控制甲醇流加。
（3）甲醇甘油混合流加［39］。
2.5.1 根据溶氧（DO）控制甲醇流加 微生物发酵
过程中，pH、溶氧（DO）等参数可以反映培养基中
碳源的消耗情况。当碳源消耗完时，DO 值会上升 ；
如果继续向其中添加碳源，由于微生物在利用碳源
时会消耗氧，就会使得 DO 值下降。依据这个原理，
就可根据 DO 值的变化来控制发酵过程中甲醇的流
加。但是利用溶氧控制甲醇流加并不能有效地控制
发酵液中甲醇的浓度。尤其是某一时刻如果甲醇流
加过量导致菌体的生长受到抑制，此时测得的 DO
值是上升的，但是实际上菌体的耗氧速率却是下降
的，这样的一种假象就会使得生产者继续流加甲醇，
结果就会导致甲醇浓度过高，造成毒害，蛋白产量
显著下降。因此利用溶氧来控制毕赤酵母发酵过程
中甲醇的流加并不是一种有效的方法［39，40］。
2.5.2 通过气相色谱检测控制甲醇流加 通过气相
色谱检测控制甲醇流加是一种离线检测方式。通常，
在甲醇诱导开始时，要求每隔一定的时间进行取样，
用气相色谱离线检测甲醇浓度。若甲醇浓度超过设
定值，则降低甲醇的流加速率，使甲醇浓度尽可能
的控制在设定值以下。这样，整个过程中就会避免
出现甲醇过量导致菌体生长抑制的现象发生，相对
于通过溶氧控制流加的方式，通过气相色谱控制甲
醇流加会使产量提高不少。但是由于离线检测具有
滞后性，使得甲醇的流加很难精确控制，进而导致
甲醇浓度的波动较大，时高时低。而这样的变化容
易使得 AOX 失活，进而直接影响甲醇的诱导，严重
的甚至导致菌体死亡。由此可见，维持发酵液中的
甲醇浓度的恒定至关重要。另外，离线检测需经常
取样分析，这也限制了这种方法的实际应用［39，41］。
2.5.3 甲醇与其他碳源混合流加 甲醇还可与甘油
和山梨醇或甘露醇混合补料，增加碳源和能量供应，
提高菌体密度，从而提高表达量 ；并能降低产热和
耗氧速率，有利于高密度发酵。其中甘油是毕赤酵
母生长最有效的碳源，其最关键之处就在于控制好
甘油的流加速率，使甘油的量刚好能够满足菌体的
生长，又不会出现抑制 AOX 启动子现象。山梨醇或
甘露醇效果则更好，不仅没有阻遏作用，而且产热
和耗氧速率更低。但是同样存在着与利用甲醇和甘
油混合补料遇到的问题，即与甲醇混合的比例、浓度、
快速便捷准确的检测方式的问题，即在发酵装置中
需要有一个在线监控物料浓度的装置，能够实时监
测到培养基中甲醇、甘油或是其他碳源的浓度。例如，
当与甘油混合补料时，通过在线监测能够使甘油始
终处于限制性状态而不会抑制 AOX 启动子，并增
加能量的供应，从而增加外源蛋白的表达［39，42，43］。
沈伊娜等［44］通过双碳源流加的方式对重组毕赤酵
母高效表达葡萄糖氧化酶进行了优化，优化后的结
果表明当以甘露醇与甲醇混合流加后，菌体的产量
比单一流加甲醇策略提高了 66.3%，效果显著。Gao
等［45］利用甲醇、山梨糖醇双碳源策略重组毕赤酵
母表达 α-干扰素，与单一甲醇流加相比同样有显著
的提高。
总而言之，在毕赤酵母诱导表达阶段，甲醇浓
度的控制是至关重要的，有效的甲醇浓度检测手段
是其能否成功表达的关键技术之一。鉴于此，华东
理工大学的研究人员成功研制出了一种基于传感器
进而实现甲醇浓度在线监测从而控制甲醇流加的技
术。此种方法通过甲醇传感器的快速灵敏的反应，
有效地控制甲醇的流加速率，使得甲醇的浓度能够
始终维持在一个恒定值是目前为止一种检测甲醇浓
度的有效方法［39］。
3 结语
巴斯德毕赤酵母表达系统作为一种真核表达系
统，自 20 世纪 80 年代发展至今，已经显现出诸多
优势，使之越来越受到关注，其研究和商业价值亦
不断体现。在载体构建和新型菌株的开发方面，已
经取得卓有成效的研究成果，并且适合工业化大规
模的发酵生产。但目前还存在一些不足。例如，在
高密度发酵的条件下，发酵周期较长，易污染，且
过长时间的发酵容易使得目的产物发生降解反应，
这就需要研究者们考虑如何在提高目的产物高效表
达的同时，尽可能的找到有效防止目的产物降解的
办法 ；另外，利用甲醇作为诱导原料，不仅会给细
胞带来毒害，而且也会给生产带来安全隐患 ；其次，
采用怎样的补料方式，才能既能满足菌体的生长，
又能为产物表达提供足够的动力 ；再者，如何实现
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第3期48
方便快捷的低成本的检测甲醇浓度的方法以实现目
的产物的高效表达 ；最后，巴斯德毕赤酵母表达系
统并不是万能的蛋白表达系统，低表达或不表达的
例子也在增加。这些问题有待研究者继续深入的研
究。相信随着研究的深入和应用的广泛，其在分子
生物学、微生物学、生物制药、发酵工程等领域都
将发挥越来越重要的作用。
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（责任编辑 狄艳红）