全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第10期
伴侣蛋白是一大类在生物大分子折叠、组装及
降解过程中起着重要的协同作用，但自身并不发生
任何变化的存在于生物体内的蛋白质分子［1］。热休
克蛋白 60（HSP60）是 HSPs 类分子伴侣，是一种与
细胞应激损伤关系密切的蛋白质，广泛存在于原核
及真核细胞中。HSP60 在正常细胞中表达很低，但
收稿日期 ：2014-02-20
基金项目 ：国家自然科学基金项目（81160204，81360254），贵州省科技厅基金项目（黔科合［2010］3160），高校博士点学科专项科研基
金项目（20105215120001）
作者简介 ：赵学军，男，硕士研究生，研究方向 ：医学寄生虫的分子免疫 ；E-mail ：383657226@qq.com
通讯作者 ：国果，女，博士，副教授，硕士生导师，研究方向 ：昆虫免疫 ；E-mail ：guoguojsc@163.com
家蝇伴侣蛋白 TCP-1 基因的序列分析、克隆及
诱导表达
 赵学军  国果  吴沁怡  陶如玉  吴建伟
（贵阳医学院基础医学院，贵阳 550004）
摘 要 ： 旨在对 EST 筛选得到的家蝇伴侣蛋白 TCP-1（MD-TCP Ⅰ）基因进行序列分析，克隆其 cDNA 序列并在大肠杆菌中
诱导表达。采用 EST 测序技术从已构建的家蝇幼虫 cDNA 质粒文库中筛选到 MD-TCP Ⅰ基因，对其进行序列测定和分析。以该基
因的 cDNA 文库质粒为模板，通过 PCR 的方法进行扩增，以 pET-28a（+）为载体构建重组质粒，再转化到表达宿主大肠杆菌 BL21
（DE3）中，IPTG 诱导表达。表达产物通过 SDS-PAGE 进行鉴定。结果显示，MD-TCP Ⅰ基因 ORF 全长 753 bp，编码 250 个氨基酸，
理论分子量 27.07 kD；等电点 5.92，该序列编码的蛋白属于热休克蛋白 60 家族的 TCP。构建了正确基因序列 MD-TCP Ⅰ重组表达质
粒，重组蛋白在大肠杆菌 BL21（DE3）中诱导表达。
关键词 ： 家蝇 TCP 序列分析 基因克隆 表达
Sequence Analysis，Cloning and Induced Expression of Chaperonin
Gene in Housefly（Musca domesitca）
Zhao Xuejun Guo Guo Wu Qinyi Tao Ruyu Wu Jianwei
（School of Basic Medical Sciences，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）
Abstract: The aim of this study is to analyze and predict the structural and characteristics of genes and encoding proteins of MD-TCP
Ⅰ（Musca domesitca Chaperonin TCP- 1（MD-TCP Ⅰ））, with the methods of cloning and expressing that gene. Sequence analysis indicated
that the open reading frame was 753 bp, encoding a putative protein consisting of 250-amino acids, which no signal sequence and NCBI-BLAST
showed acid sequence identify with other insect TCP-1 were 89%. The protein, with a predicted molecular weight of 27.07 kD, and pI of 5.92,
which acid sequence as tcp-1 belong to HSP60 family. The gene coding for MD-TCP Ⅰ was amplified by polymerase chain reaction（PCR）,
and then was ligated into vector pET-28a（+）and transformed into Escherichia coli BL21（DE3）competent cell, induced with IPTG. The
fusion protein in the expression vector was analyzed by SDA-PAGE. The results indicated that the recombinant plasmid with the correct target
gene was constructed, and the fusion protein was expressed in E. coli BL21（DE3）.
Key words: Musca domestic TCP Sequence analysis Gene cloning Express
是在高温、缺氧、感染、创伤等因素刺激下表达增强，
对提高细胞耐受应激的能力，维持细胞内环境的稳
定具有重要作用［2］。TCP 属于 HSP60 家族，是一种
广泛存在于细胞浆中的异型寡聚蛋白，也是迄今为
止真核细胞胞浆中发现的唯一一个伴侣素［3］。研究
发现正常条件下，HSP60 以稳定状态存在于细胞质
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期152
和线粒体基质中 ；应激条件下，HSP60 迅速从胞质
中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋
白［4］，并且 TCP 能与蛋白因子结合形成目标蛋白［5］。
家 蝇 Musca domesitca 是 世 界 性 广 泛 分 布 的 卫
生昆虫，从幼虫到成虫均生活在肮脏的环境中，表
现出较强的环境适应能力，所以家蝇必然具有完善
而高效的免疫防御机制，我们对此产生了极大的兴
趣。目前对家蝇热休克蛋白的研究报道主要是热休
克蛋白 70［6］和小分子量热休克蛋白［7］，对其 TCP
蛋白的研究尚未见报道。本研究克隆 MD-TCP Ⅰ基
因，并对其序列进行生物信息学的分析，同时建立
MD-TCP Ⅰ体外表达系统，旨在为进一步研究 MD-
TCP Ⅰ特性和有效利用功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 文库、菌种及质粒 家蝇 3 龄幼虫全长 cDNA
质粒文库的构建和 EST 测序及 Unigene 分析由北京
华大合作完成。原核表达质粒 pET-28a（+）和大肠
杆菌 BL21（DE3）由中山大学引进本实验室保存。
1.1.2 主要试剂及工具酶 Ex Taq 酶（含 dNTP），
EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA 连接酶，DNA 标准（DL
2 000 Marker）均购自大连宝生物工程公司 ；异丙硫
代 β-D 半乳糖苷（IPTG）购自美国 Promega 公司 ；
DNA 凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京鼎
国生物。
1.1.3 引物合成和 DNA 测序 基因扩增引物合成
由 Invitrogen 上海生物技术有限公司完成，重组质粒
DNA 测序上海生工生物工程有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 家蝇 TCP 基因Ⅰ（MD-TCP Ⅰ）的识别及序
列测定 对测定得到的家蝇 3 龄幼虫 EST 序列进行
Blastx 分析，从中筛选获得编码家蝇 TCP Ⅰ基因的
文库质粒（编号为 004-E08），命名为 MD-TCP Ⅰ。
1.2.2 MD-TCP Ⅰ基因的生物信息学分析 利用瑞
士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（Expert
protein analysis system，ExPASy）提供的生物信息学
工具，分析预测蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜区、
二级结构及三级结构。
1.2.3 MD-TCP Ⅰ基因的扩增 根据已获得的 MD-
TCP Ⅰ编码序列，利用 DNA Club 和 Primer5.0 设计
引物。上游引物 ：5-GCGGAATTCATGGCTTCAATT
AGTTTATTGAATC-3（下划线为 EcoR Ⅰ酶切位点）；
下游引物 ：5-CCGAAGCTTTTATAGAAGAAACCCAG
AGTT-3（下划线为 Hind Ⅲ酶切位点）。
以 家 蝇 3 龄 幼 虫 cDNA 文 库 中 MD-TCP Ⅰ 基
因的质粒为模板，PCR 扩增程序为 ：94℃预变性
5 min ；94℃ 1 min，59℃ 1 min，72℃ 1 min， 共 35
个循环 ；72℃延伸 10 min。PCR 产物经 1% 琼脂糖
凝胶电泳回收。
1.2.4 重组原核表达质粒（pET-28a（+）-MD-TCP Ⅰ）
的构建及鉴定 将 PCR 产物和原核表达质粒 pET
28a（+）经 EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 双酶切后回收，连接
并转化大肠杆菌 BL21/DE3 感受态细胞，卡那霉素
筛选阳性克隆，对阳性克隆提取质粒进行 PCR，双
酶切和测序鉴定。
1.2.5 MD-TCP Ⅰ基因在大肠杆菌 BL21/DE3 中的诱
导表达 取 1 mL 培养过夜的阳性克隆菌液，加入含
有卡那霉素的 100 mL LB 培养基中（菌液 / 培养基
为 1/100），37℃ 220 r/min 振摇至 OD600=0.4-0.6 时，
加入 IPTG 至终浓度 4 mmol/L，诱导表达 6 h。离心
收集菌体，进行超声破碎。超声破碎沉淀和上清各
自取 20 μL，各加入 50 μL 1×SDS- PAGE 上样缓冲液，
煮沸 5 min，13 000 r/min 离心 1 min，取沉淀和上清
5 μL 进行 SDS -PAGE 电泳分析。
2 结果
2.1 序列分析
MD-TCP Ⅰ基因与葱蝇的同源基因氨基酸序列
的一致性可达 89%，ORF 全长 753 bp，编码 250 个
氨基酸（图 1），预测分子量为 27.07 kD，理论等
电点（pI 值）5.92。Inter ProScan 分析显示其具有
TCP-1 家族的氨基酸保守结构域（图 2）。
信号肽预测 将 MD-TCP Ⅰ氨基酸序列在丹麦技
术大学生物序列分析中心（CBS）的网站（http：//www.
cbs.dtu.dk/servies/SingnaIP/）进行在线分析，结果显
示，氨基酸序列无信号肽。
TMHMM（Http ：//www.cbs.dtu.dk/services/
TMHMM-2.0）预测 MD-TCP Ⅰ基因无跨膜区。
利用 SOPMA 网站预测 MD-TCP Ⅰ基因编码蛋
2014年第10期 153赵学军等：家蝇伴侣蛋白 TCP-1 基因的序列分析、克隆及诱导表达
1
61
121
181
240
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081
1141
图 1 MD-TCP Ⅰ开放阅读框 cDNA 序列及对应编码的氨基酸序列
IPR017722
IPRO17998
IPRO27409
IPRO27410
IPRO27413
moIPR
IPROD2423
IPROD2194 IPROD2194
IPROD2194
IPROD2194
IPROD2194
IPROD2194
IPROD2194
IPROD2194
IPROD2194
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
P00750
Intorpro match
1 250
Descrl perh
TCP3-1
TCP1-3
CHAHECMN
CHAHECMN
CHAHECMN
CHLhp
TCOWMEITCP1
TCOWMEITCP1
TCOWMEITCP1
TCOWMEITCP1
TCOWMEITCP1
Query sequeres
图 2 MD-TCP Ⅰ结构域预测
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第10期154
白的二级结构，发现其二级结构主要有 4 种类型，
分 别 为 α-螺 旋 占 42.40%，β-折 叠 占 7.20%， 延 伸
链占 21.60%，无规则卷曲占 28.80%（图 3）。利用
ExPASy 网站上提供的 SWISS-MODEL 对该基因的编
码蛋白进行三级结构的预测，可清楚地看到该蛋白
具有丰富的 α-螺旋结构，延伸链和无规则卷曲也较
明显（图 4），从而验证了 SOPMA 网站对其二级结
构的预测。
2.2 MD-TCPⅠ基因扩增及原核重组质粒的鉴定
MD-TCP Ⅰ基因经 PCR 扩增后，获得了 750 bp
左右的特异条带（图 5 泳道 1）。将重组质粒进行双
酶切鉴定，产物进行 1% 琼脂糖凝胶电泳。电泳结
果（图 5 泳道 3）显示，重组质粒双酶切后，在 750
bp 左右有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相
符，提示重组质粒构建成功。将挑选的阳性克隆子
送上海生工生物工程有限公司，进一步以 pET-28a（+）
的通用引物对重组质粒测序，结果表明相应的插入
序列与目的基因 cDNA 序列一致，证明 MD-TCP Ⅰ
基因原核表达重组质粒构建成功。
50 100 150 200
图 3 MD-TCP Ⅰ二级结构分析结果
图 4 MD-TCP Ⅰ的三级结构
2000
bp
M 1 2 3
1000
750
500
250
100
2.3 目的基因表达产物的SDS-PAGE鉴定
取重组菌诱导前后的表达产物和超声破碎沉淀、
上清进行 SDS-PAGE，结果发现诱导的重组菌约在
31 kD 左右出现表达条带，与目的蛋白预测的分子
量（27.07 kD）加上所带 His 标签分子量（约 3 kD）
基本相符，而未诱导菌无此条带。超声破细胞后显
示该蛋白在包涵体大量表达箭头所指（图 6）。
M ：DL2000 Marker ；1 ：PCR 产物 ；2 ：pET-28a（+）；3 ：重组质粒酶切
图 5 MD-TCP Ⅰ的克隆及酶切签定
M1 2 3 4 5 6 7
97.2
kD
66.4
44.3
29.0
20.1
14.3
M：蛋白质分子量标准；1：未诱导的表达产物；2，3：IPTG 诱导的表达产物；
4，5 ：破细胞沉淀 ；6，7 ：破细胞上清
图 6 重组质粒 pET-28a（+）- MD-TCP Ⅰ在大肠杆菌的
表达产物 SDS-PAGE 电泳分析
3 讨论
分子伴侣不仅使胞内蛋白折叠、组装与转运帮
助蛋白［8］，还可以成为感染性疾病中的免疫优势
抗原，激发宿主体内的体液免疫反应和细胞免疫反
应，已经证实在细菌或寄生虫感染中具有免疫保护
作用，表明分子伴侣有可能用作疫苗来抵抗微生物
感染，或者用来治疗肿瘤和自身免疫性疾病［9］。分
子伴侣与肿瘤有着密切的联系，在肿瘤发生中扮演
着很重要的角色，既可以促进肿瘤细胞的自主增殖，
又可以抑制细胞的凋亡［10］。食管癌的侵袭转移了能
力与 HSP27 呈负相关，HSP27 高表达的食管癌其侵
袭转移能力受到抑制［11］。研究发现，TCP 伴侣蛋白
2014年第10期 155赵学军等：家蝇伴侣蛋白 TCP-1 基因的序列分析、克隆及诱导表达
是进化上最为保守的蛋白质之一，由“背靠背”堆
叠的双环状亚基构成，每个环有 8 个不同的亚基［5］。
TCP 伴侣蛋白在肌动蛋白、微管蛋白的组装和折叠
中发挥着重要的作用，TCP 伴侣蛋白翻译机制中的
促进其它蛋白正确折叠，为细胞环境如细胞信号介
导、细胞增殖等密切关系提供了佐证［12］。TCP 的异
常会导致细胞骨架蛋白发生改变，甚至影响细胞骨
架的形成与聚集［13］。葱蝇的蛹期冷驯化，TCP-1 基
因会明显的上调，使蛹对环境温度有更高的耐受性，
增强昆虫的抗寒的能力［14］。对二化螟幼虫热胁迫时，
可引起二化螟幼虫体内产生氧化应激反应，显著提
高子幼虫血淋巴细胞内热休克蛋白水平［15］。CCT6A
下调表达能显著抑制结肠肿瘤细胞的迁移和侵袭能
力［16］。此外，TCP 伴侣蛋白在视网膜感觉神经元的
形成和生成扮演着重要的功能，是神经系统退行性
病变的一个潜在的因素［17］。TCP 伴侣蛋白在卵泡生
长发育中也起着重要的作用［18］。
4 结论
将 家 蝇 TCP Ⅰ 基 因 片 段 克 隆 到 原 核 表 达
载体 pET-28a（+）中，构建重组质粒 pET-28a（+）/
MD-TCP Ⅰ，获得的重组质粒经过酶切、PCR 和测
序鉴定，证实含有目的基因片段，重组质粒转化入
大肠杆菌 BL21/DE3，IPTG 诱导表达，电泳显示重
组蛋白条带清晰，表明重组蛋白得到了高效表达。
参 考 文 献
［1］ Nie ZQ, Wu YG, Meng JZ. The function and application of molecular
chaperonin［J］. Chinese Bull Life Sci, 2006, 18（1）：84-89.
［2］ 王芳 , 陈炯 , 史雨红 , 等 . 梅氏新贝尼登虫热休克蛋白 60 基因
的克隆、序列分析及应激表达分析［J］. 动物学研究 , 2012,
33（6）：603-608.
［3］ Horwich AL, Fenton WA, Chapman E, Farr GW. Two families of
chaperonin ：Physiology and mechanism［J］. Annu Rev Cell Dev
Biol, 2007, 23 ：115-145.
［4］ Itoh H, Komatsuda A, Ohtani H, et al. Mammalian HSP60 is quickly
sorted into the mitochondria under conditions of dehy2 dration［J］.
Eur J Biochem, 2002, 269（23）：5931-5938.
［5］ Boudiaf-Benmammar C, Cresteil T, Melki R. The cytosolic
chaperonin CCT/TRIC and cancer cell proliferation［J］. PLOS
ONE, 2013, 8（4）：e60895.
［6］ Tang T, Wu C, Li J, et al. Stress-induced HSP70 from Musca
domestica plays a functionally significant role in the immune
system［J］. Journal of Insect Physiology, 2012, 58 ：1226-1234.
［7］ 李显航 , 刘红美 . 家蝇小热休克蛋白的生物信息学分析［J］.
生物信息学 , 2013, 11（1）：66-71.
［8］ Cuéllar J, Martín-Benito J, Scheres SH, et al. The structure of CCT-
Hsc70 NBD suggests a mechanism for Hsp70 delivery of substrates
to the chaperonin［J］. Nature Structural & Molecular Biology,
2008, 15（8）：858-864.
［9］ Mansilla MJ, Montalban X, Espejo C. Heat Shock Protein 70 ：Roles
in multiple sclerosis［J］. Mol Med, 2012, 18 ：1018-1028.
［10］ 高霞 , 钱晓龙 , 付丽 . 热休克蛋白 27 在乳腺癌发生发展中的
作用［J］. 中国肿瘤临床 , 2013, 40（10）：612-614.
［11］薛林 , 杨蕾 , 刘冰 , 等 . 热休克蛋白 HSP27 抑制食管鳞癌细胞
的侵袭转移能力［J］. 现在肿瘤医学 , 2014, 22（1）：11-15.
［12］ Roobol A, Roobol J, Carden MJ, et al. The chaperonin CCT
interacts with and mediates the correct folding and activity of three
subunits of translation factor elF3 ：b, i and h［J］. Biochem J,
2014, 458（2）：213-224.
［13］ 段芳蕾 , 孙兴旺 , 曹灵 . 真核细胞伴侣素 CCT 及其与细胞骨
架的关系［J］. 中国细胞生物学学报 , 2011, 33 ：822-825.
［14］ Kayukawa T, Chen B, Miyazaki S, et al. Expression of mRNA
for the t-complex polypeptide-1, a subunit of chaperonin CCT, is
upregulated in association with increased cold hardiness in Delia
antique［J］. Cell Stress & Chaperones, 2005, 10（3）：204-210.
［15］ 崔亚东 , 陆明星 , 杜予州 . 二化螟热休克蛋白 70 基因的克隆
及热胁迫下的表达分析［J］. 昆虫学报 , 2010, 53 ：841-848.
［16］ 韩丁培 , 王蒲雄志 , 瞿顺 , 等 . 伴侣蛋白 CCT6A 参与结肠癌细
胞迁移及侵袭的作用研究［J］. 外科理论与实践 , 2011, 16（4）：
388-391.
［17］ Posokhov E, Song H, Belcastro M, et al. Disruption of the chaperonin
containing TCP-1 function affects protein networks essential for rod
outer segment morphogenesis and survival［J］. Molecular and
Cellular Proteomics, 2010, 10（1）：1-12.
［18］ Zhu G, Cui X, Kang L, et al. Expression of CCT6A mRNA in
chicken granulose cells is regulated by progesterone［J］. General
and Comparative Endocrinology, 2013, 189 ：15-23.
（责任编辑 马鑫）