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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2012年第10期
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称
Bt）是一种革兰氏阳性细菌，在营养琼脂上的菌落
形态为圆形、乳白色、平坦表面干燥，边缘不整齐
并有光泽。其主要特征在芽胞形成的过程中，菌体
内一端或两端产生一个或多个伴胞晶体（parasporal
crystal）［1］，已报道的伴胞晶体形态主要有菱形、
正方形、长方形、球形及不规则形状等。伴胞晶
收稿日期 : 2012-03-02
基金项目 : 国家高技术研究发展计划课题（2011aa10a2O3），转基因生物新品种培育科技重大专项（2009ZX08009-031B）
作者简介 : 李玉红 , 女 , 硕士 , 研究方向 : 生物防治微生物功能基因的发掘、研究和利用 ; E-mail: liyuhong1114@163.com
通讯作者 : 高继国 , 男 , 教授 , 研究方向 : 生物大分子的分离纯化 , 苏云金芽胞杆菌抗性机理、生物安全性 ; E-mail: gaojiguo1961@hotmail.com
苏云金芽胞杆菌 cry2Ab、cry9Ea基因的
表达及活性分析
李玉红 李海涛 高继国 赵世源 张春鸽 赵灿
（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）
摘 要： 旨在为农业害虫防治提供更多的苏云金芽胞杆菌基因资源，从中国吉林市龙潭山土壤样品中分离得到野生菌株命
名为 Bt LTS-7，扫描电镜显示该菌株产生晶体形状为双锥体和正方体，聚丙烯酰胺凝胶电泳显示该菌株产生 130 kD和 71 kD的晶
体蛋白，通过 PCR鉴定出该菌株中含有 cry2Ab和 cry9Ea基因，并成功克隆到了这两个新基因，并被 Bt国际命名委员会正式命名
为 cry2Ab28和 cry9Ea9，将两个基因分别在大肠杆菌 Rosetta（DE3）中表达，并进一步对其表达蛋白进行杀虫活性测定。结果显示，
Cry2Ab28蛋白对棉铃虫（Helicoverpa armigera）初孵幼虫具有杀虫活性，LC50为 32.45 μg/mL。Cry9Ea9蛋白对小菜蛾初孵幼虫（Plutella
xylostella）具有较高杀虫活性，LC50为 0.77 μg/mL。
关键词： 苏云金芽胞杆菌 杀虫晶体蛋白 cry2Ab基因 cry9Ea基因 生物活性
Expression and Insecticidal Activity of Gene cry2Ab and cry9Ea from
Bacillus thuringiensis Strain
Li Yuhong Li Haitao Gao Jiguo Zhao Shiyuan Zhang Chunge Zhao Can
（Northeast Agricultural University，College of Life Science，Harbin 150030）
Abstract: In order to provide more gene resources for the insect pest biocontrol, Bacillus thuringiensis strain LTS-7 was isolated from
soil samples at Longtan Mountain in Jilin of China. The strain formed the bipyramidal and square crystal which observed by scanning electron
microscopy. SDS-PAGE analysis revealed molecular weight of insecticidal crystal protein was 130 kD and 71 kD in this strain. By use of
PCR identification method, cry2Ab and cry9Ea genes were found in the Stain. The genes from strain Bt LTS-7 were identified and cloned，
respectively. The two genes were designated as cry2Ab28 and cry9Ea9 by International Nomenclature Committee of Bt. Furthermore, two genes
were respectively transformed into Escherichia coli Rosetta（DE3）strain and the toxicity of the two genes was evaluated. The bioassay results
indicated that the Cry2Ab28 toxin had insecticidal activity against Helicoverpa armigera with LC50 32.45 μg/mL, and the Cry9Ea9 toxin had high
insecticidal activity against Plutella xylostella with LC50 0.77 μg/mL.
Key words: Bacillus thuringiensis Insecticidal crystal protein cry2Ab gene cry9Ea gene Insecticidal activity
体的主要成份是杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal
Proteins，ICPs），该蛋白主要由 cry 和 cyt 基因编
码，以蛋白质晶体的结构形式存在于胞内，并随芽
胞释放到细胞外，并具有广谱的杀虫活性［2］，对包
括鳞翅目（Lepidoptera）、双翅目（Diptera）、鞘翅目
（Coleoptera）、膜翅目（Hhymenopterans）在内等多
种农业害虫以及动植物寄生虫线虫、螨虫等具有生
2012年第10期 101李玉红等 ：苏云金芽胞杆菌 cry2Ab、cry9Ea 基因的表达及活性分析
物防治作用［3-5］，而对人和家禽家畜无害，无残留，
并且不污染环境。目前在世界几十个国家，Bt 制剂
被注册登记生产，广泛应用于农业、林业、仓储、
卫生的害虫防治中［6］。
自 1981 年，Schnepf［7］从苏云金芽胞杆菌中克
隆得到第一个 cry 基因以来，根据 1995 年 Crickmore
等［8］在第 28 届国际无脊椎动物病理学会年会（SIP）
上提出新的分类系统，按照氨基酸序列的同源性来
确定其分类，截止到 2012 年 3 月已报道苏云金芽胞
杆菌第一等级杀虫晶体蛋白有 73 类，其中 70 类 Cry
蛋白和 3 类 Cyt 蛋白。目前报道的 cry2 类模式基因
共 9 类，分别为 cry2Aa、cry2Ab、cry2Ac、cry2Ad、
cry2Ae、cry2Af、cry2Ah、cry2Ai 和 cry2 类 基 因 编
码大约 70 kD 蛋白，大部分菌株形成方形晶体。已
报道的 cry9 类模式基因共 11 类分别为 cry9Aa、
cry9Ba、cry9Bb、cry9Ca、cry9Da、cry9Db、cry9Ea、
cry9Eb、cry9Ec、cry9Ed、cry9Ee 和 cry9 类 基 因 编
码大约 130 kD 的蛋白，产生球形或菱形晶体（http：//
www.lifesci.sussex.ac.uk/home/NeilCrickmore/Bt.）。
随着 cry1 类基因的广泛应用，在实验室条件下
发现了多种昆虫对 Bt 亚种或单个毒素产生抗性，在
田间条件下农业害虫产生抗性的风险也不断增加，
因此对新基因的发掘也受到国内外的重视［9］。同时，
长期以来，Bt 新基因的收集、挖掘以及开发转 Bt 杀
虫基因植物，一直是世界上众多国家研究的热点。
因此充分发掘我国丰富的 Bt 杀虫基因资源，为构建
高效工程菌、转抗虫基因植物、解决昆虫对杀虫基
因抗性问题提供新的基因来源，已成为一项极有价
值的工作。为此，本研究从土壤中分离的 Bt 菌株筛
选克隆杀虫基因，以期获得具有较高杀虫活性的新
型 cry 基因。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株和质粒 菌株及质粒，见表 1。
表 1 菌株与质粒
菌株与质粒 特点描述 来源
Rosetta（DE3） F-ompT hsdSB（RB- mB-）gal dcm λ［DE3（lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5）］pLysSRARE（CamR） 实验室保存
JM109 Rpsl thr leu endA dcm supE44 proAB 实验室保存
Bt LTS-7 含有 cry2Aa 和 cry9Ea 基因的野生 Bt 菌株 本研究
pMD19-T Vector multiple cloning site，lacZ operator，Ampr TaKaRa（大连）
pEB lac operator，T7 promoter，multiple cloning site，His·Tag，HSV·Tag，lacZ start codon，E. coli promoter，Ampr 实验室保存
pEB2Ab28 pEB 载体和 cry2Aa28 基因重组质粒，Camr，Ampr 本研究
pEB9Ea9 pEB 载体和 cry9Ea9 基因重组质粒，Camr，Ampr 本研究
1.1.2 培养基 液体 LB 培养基 ：1.0% 胰蛋白胨、
0.5% 酵母提取物、1.0% 氯化钠，pH7.0。固体 LB
培养基：在液体LB培养基中加1.3%琼脂。固体1/2LB
培养基 ：1.0% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、1.0%
氯化钠、1.3% 琼脂，pH7.0。
1.1.3 主要生化试剂 PCR 扩增相关试剂、限制
性 内 切 酶、DNA Marker、pMD19-T Vector、 蛋 白
Marker、均购自 TaKaRa 公司 ；KOD 高保真 DNA 聚
合酶购自 TOYOBO 公司 ；DNA 回收试剂盒、提取大
肠杆菌质粒试剂盒购自 Invitrogen 公司 ；鉴定引物及
全长引物均由上海生工合成。
1.1.4 供试昆虫 小菜蛾（Plutella xylostella）初孵
幼虫、棉铃虫（Helicoverpa armigera）初孵幼虫均由
中国农业科学院植物护研究所提供。
1.1.5 PCR 扩增引物 鉴定引物与全长引物均由上
海生工合成。引物（序列见表 2）由上海生工合成。
表 2 PCR-RFLP鉴定引物名称［10］及全长引物序列
引物名称 引物序列（5-3）
S5un2 GGAAGAACTACTATTTGTGATGC
S3un2 AATAGTTTGAATTACCGCGAGC
S5un9 AGGACCAGGATTTACAGGAGG
S3un9 CCCAATGCGAAAGAACTAAG
Q2ab F ATGAATAGTGTATTGAATAGCGGAAGA
Q2abR ATAAAGTGGTGAAATATTAGTTGGTACAAG
Q9eaF ATGAATCGAAATAATCCAAATGAATAT
Q9eaR CTACTCTTGTGTTTCAATGAACTCAAT
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期102
1.2 方法
1.2.1 晶体形态观察及 SDS-PAGE 分析 将 Bt 菌株
接种于 1/2LB 培养基中，于 30℃培养 48 h，显微镜
下观察晶体释放后，刮取培养物 100 mg 用灭菌蒸馏
水洗 3-4 遍，悬浮于 1 mL 无菌水中，将芽胞和晶体
混合液滴于玻璃片上，待其干燥，经锇酸固定后酒
精梯度脱水，临界点干燥，离子溅射喷金（2 nm），
HITACHI S-3400N 扫描电镜观察拍照。将 50 mg Bt
菌体悬于 100 μL 0.2 mol/L NaOH，室温反应 5 min，
加入 50 μL 3×SDS 样品缓冲液混匀，100℃水浴 10
min，12 000 r/min 离心 3 min，吸取上清进行 SDS-
PAGE 分析。
1.2.2 PCR 鉴定及测序 参照宋福平等［11］方法，应
用通用引物 S5un2/S3un2、S5un9/S3un9（表 2），以
Bt LTS-7 基因组为模板，利用 Taq聚合酶进行 PCR
扩增，PCR 反应体系为模板 1 μL，引物对各 1 μL，
MgSO4 2 μL，dNTPs 5 μL，10×Buffer 5 μL，Taq 聚
合 酶 1 μL，ddH2O 补 至 50 μL。PCR 反 应 程 序 ：
94℃，8 min ；94℃，1 min，56℃ 1 min，72℃ 4 min，
30 个循环 ；最后 72℃延伸 10 min。将 PCR 产物回收
与 pMD19-T 载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌
JM109，筛选出阳性转化子。送于上海生物工程技术
服务有限公司测序。
1.2.3 cry2Ab 和 cry9Ea 全长基因的 PCR 反应 按
照已经发表的 cry2Ab、cry9Ea 基因序列，参照文献
设计了扩增全长 cry2Ab、cry9Ea 开放阅读框的引物
Q2abF/Q2abR、Q9eaF/Q9eaR，引物序列见表 2。以
Bt LTS-7 菌株的基因组为模板，利用 KOD 高保真
DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。
PCR 反应体系为模板 1 μL，引物对各 1 μL，
MgSO4 2 μL，dNTPs 5 μL，10×Buffer 5 μL，KOD 酶
1 μL，ddH2O 补 至 50 μL。PCR 反 应 程 序 ：94℃ 8
min；94℃ 1 min，52℃ 1 min，68℃ 4 min，30 个循环；
最后 68℃延伸 10 min。
1.2.4 cry2Ab 和 cry9Ea 基因的克隆、序列测定和分
析 将回收的 PCR 产物与用限制性内切酶 Ecl136II
处理 pEB 载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌感
受态 JM109，以载体表达区正向引物和全长基因反
向引物进行 PCR 鉴定，筛选出连接方向正确的阳
性转化子。方向正确的阳性转化子送于上海生物工
程技术服务有限公司测序，DNA 及氨基酸序列采用
DNAMAN 软件、GenBank 数据库进行分析。
1.2.5 cry2Ab 和 cry9Ea 基因诱导表达及 SDS-PAGE
分析 将鉴定正确的重组质粒转入表达菌株 Rosetta
（DE3），以含有空载体 pEB 质粒的表达菌株 Rosetta
（DE3）为对照，在 37℃，220 r/min 培养 1.5-2 h 至
OD600 约为 0.6 时，加入 IPTG 在 20℃，180 r/min 诱
导培养 8 h，8 000 r/min 离心 3 min 收集菌体，弃掉
上清液后，用 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）悬浮菌体
并对悬浮菌液进行超声波破碎 5 min 后，12 000 r/min
离心 10 min 收集沉淀，并加入适量 10 mmol/L Tris-
Cl 溶解沉淀获得粗提表达蛋白，将沉淀组分进行
SDS-PAGE（8%）电泳检测分析。蛋白电泳样品制
备与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测方法参见分子克隆实
验指南［12］。
1.2.6 生物活性测定 采用饲料混合法进行杀虫生
物活性测定。将 10 mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶解的
粗提蛋白制备成 7 个浓度梯度蛋白样品溶液，将粗
提蛋白溶液与饲料搅拌混匀，分装于经过消毒的培
养皿中，挑选活跃的初孵幼虫接于饲料上，进行生
物活性测定，每个处理重复 3 次，小菜蛾每个重复
为 20 头试虫，棉铃虫每个重复为 24 头试虫。将 10
mmol/L Tris-Cl（pH8.0）溶液作为阴性对照，利用同
样的方法处理 Cry1Ac 蛋白作为阳性对照。试虫的
饲养条件为 28℃、相对湿度为 70%-80% 的光照培
养箱中培养，小菜蛾初孵幼虫饲育 48 h、棉铃虫初
孵幼虫饲育 168 h 后调查死、活虫数量［13，14］。采用
POLO 软件计算 LC50 值和 95% 置信区间。
2 结果
2.1 晶体形态观察及SDS-PAGE分析
扫描电镜下观察到 Bt LTS-7 菌株的芽胞为长圆
棒状，晶体形状为方形和菱形（图 1）。SDS-PAGE
分析结果显示，Bt LTS-7 在约 130 kD 和 71 kD 的位
置有丰富的蛋白条带（图 2）。
2.2 PCR鉴定及全长基因的扩增
PCR 鉴定发现 Bt LTS-7 菌株中含有 cry2 类和
cry9 类基因，应用通用引物 S5un2/S3un2 和 S5un9/
S3un9 对 Bt LTS-7 菌株的基因组进行 PCR 扩增结果，
2012年第10期 103李玉红等 ：苏云金芽胞杆菌 cry2Ab、cry9Ea 基因的表达及活性分析
见图 3。参考测序结果，登录 NCBI 进行序列比对，
发现该菌株含有 cry2Ab、cry9Ea 类基因。利用全长
引物 Q2abF/Q2abR 和 Q9eaF/Q9eaR 扩增 Bt LTS-7 菌
株中的 cry2Ab、cry9Ea 基因，PCR 扩增结果，见图 3。
2.3 cry2Ab和cry9Ea全长基因的克隆和表达
利 用 全 长 引 物 Q2abF/Q2abR 和 Q9eaF/Q9eaR
扩增 Bt LTS-7 菌株中的 cry2Ab、cry9Ea 基因，将
扩增产物分别克隆到 pEB 载体并筛选平末端连接
正确的重组质粒 pEB2Ab28 和 pEB9Ea9。对重组质
粒 pEB2Ab28 和 pEB9Ea9 基因的测序结果显示，Bt
LTS-7 菌株中的 cry2 类基因为 cry2Ab，全长基因大
小为 1 899 bp，编码 633 个氨基酸，将序列提交 Bt
国际命名委员会命名为 cry2Ab28（GenBank 登录号
为 JN651494）。该菌株中 cry9 类基因为 cry9Ea，全
长基因大小为 3 453 bp，编码 1 151 个氨基酸，将序
列提交 Bt 国际命名委员会命名为 cry9Ea9（GenBank
登录号为 JN651495）。
按上述方法对 cry2Ab28 和 cry9Ea9 基因进行诱
导表达，对表达产物进行的 SDS-PAGE 电泳分析结
果（图 4）显示，两种表达蛋白被检测均在沉淀组
分中，转入重组质粒 pEB2Ab28 的 Rosetta（DE3）
菌株中检测到 71 kD 的目的蛋白，在转入重组质粒
pEB9Ea9 的 Rosetta（DE3）菌株中检测到 130 kD 的
目的蛋白，与推导的蛋白大小一致。以空质粒 pEB
转入 Rosetta（DE3）菌株为阴性对照，未发现表达
的 130 kD 或 71 kD 的蛋白，以上结果说明在大肠杆
菌中成功的表达了上述蛋白。
图 1 野生菌株 Bt LTS-7扫描电镜图片
图 2 Bt LTS-7菌株 SDS-PAGE分析结果
M. 1 kb DNA ladder ；1. S5un2/S3un2 PCR 扩增产物 ；2. S5un9/S3un9 PCR 扩
增产物 ；3. Q2abF/Q2abR PCR 扩增产物 ；4. Q9eaF/Q9eaR PCR 扩增产物
图 3 Bt LTS-7菌株 PCR扩增电泳图谱
M. 高分子量蛋白 Marker ；1.pEB ；2.Cry9Ea9 ；3.Cry2Ab28
图 4 cry2Ab28和 cry9Ea9基因在大肠杆菌中的表达
2.4 Cry2Ab和Cry9Ea蛋白杀虫活性的测定
提取 Cry2Ab28 蛋白，并用 BCA 蛋白浓度测定
试剂盒进行定量，对小菜蛾和棉铃虫的初孵幼虫进
行生物活性测定，结果显示，Cry2Ab28 蛋白对棉
铃虫初孵幼虫有较高的杀虫活性，LC50（95% 置
信区间）为 32.45 μg/mL（24.30-41.06），同时对照
Cry1Ac 蛋白杀虫活性测定结果 LC50（95% 置信区
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2012年第10期104
间）为 42.54 μg/mL（25.37-64.62），说明 cry2Ab28
蛋白对棉铃虫有较好的毒力效果。应用同样的方法
提取 Cry9Ea9 蛋白对小菜蛾和棉铃虫初孵幼虫进行
生物活性测定结果显示，Cry9Ea9 蛋白对小菜蛾初
孵幼虫具有较高活性，LC50（95% 置信区间）为 0.77
μg/mL（0.73-0.81），同时对照 Cry1Ac 蛋白对小菜蛾
初孵幼虫的杀虫活性测定结果 LC50（95% 置信区间）
为 6.55 μg/mL（5.34-7.79），说明 Cry9Ea9 蛋白对小
菜蛾具有较好的毒杀作用。
3 讨论
通过扫描电镜观察到 Bt LTS-7 菌株同时产生
菱形和方形的晶体，对于伴孢晶体中含有多种晶体
蛋白的菌株来说，虽为预测其杀虫活性提高了难
度，却为防止昆虫产生抗性提供了良好的菌株资源。
SDS-PAGE 电泳检测到该菌株大量的表达 130 kD 和
71 kD 的蛋白，为其 cry 基因型检测提供了依据，通
过应用鉴定引物 PCR 扩增发现菌株含有 cry2 类和
cry9 类基因。随着一些 cry1 类基因在广泛应用中产
生抗性问题的出现，挖掘其他类的新型 cry 基因具
有重要意义，由于 Bt 杀虫晶体蛋白杀虫作用方式与
昆虫的中肠上的受体有关，而不同的杀虫蛋白在昆
虫中肠细胞膜上的结合位点和作用机制不同［15］。因
此，其他类基因与 cry1 类基因的混用可能有效地延
缓害虫抗性的产生，同时也利于延长转基因抗虫作
物的有效使用期。故对新型 cry 基因的克隆与分析
表达蛋白的生物活性显得十分重要。本研究成功对
Bt LTS-7 菌株中的 cry2Ab 和 cry9Ea 基因进行克隆及
原核表达，初步测定其 Cry2Ab28 蛋白对棉铃虫初孵
幼虫表现出一定的生物活性，LC50 为 32.45 μg/mL，
与国内外报道的 Cry2Ab 类蛋白对棉铃虫的活性相
近。而 Cry9Ea9 蛋白对小菜蛾初孵幼虫表现出较高
的生物活性，LC50 为 0.77 μg/mL，高于国内外报道
的对小菜蛾初孵幼虫具有活性的 Cry9Ea 类蛋白。目
前已报道 Cry2A 类蛋白对鳞翅目害虫烟草天蛾、武
毒蛾、小菜蛾、亚洲玉米螟，双翅目害虫黑翅伊蚊
等具有活性［16-18］，Cry9E 类蛋白已对鳞翅目害虫粉
纹夜蛾、小菜蛾、家蚕等具有活性［19-21］。因此应该
扩大 Cry2Ab28 和 Cry9Ea9 蛋白对靶标害虫的生物活
性检测，以期获得其完整的杀虫谱。
4 结论
本研究从 Bt LTS-7 菌株中克隆得到新基因
cry2Ab28 和 cry9Ea9，并测其表达蛋白 Cry2Ab 对棉
铃虫初孵幼虫具有生物活性，Cry9Ea 蛋白对小菜蛾
初孵幼虫具有生物活性，为进一步研究转基因植物、
克服延缓害虫抗性以及构建工程菌等工作提供了基
因资源。
致谢：感谢中国农科院植物保护研究所病虫害
生物学国家重点实验室生物技术组、棉花害虫组对
于本实验生测方面提供的实验条件和无私帮助。
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（责任编辑 狄艳红）