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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第12期
新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种
重要的人体条件致病性真菌，首度于 1984 年被发
现［1］。该真菌感染多发生于细胞免疫功能严重受损
人群，接受抗肿瘤化疗药物及大量皮质激素治疗的
病人，长期使用抗排斥药物的器官移植病人以及艾
滋病患者［2］。已有的研究发现新型隐球菌高毒性菌
株 H99（血清型 A）的 VPS41 基因的定向敲除导致
突变株 ：（1）致病性完全丧失 ；（2）抗氮源饥饿能
力丧失（在缺氮源的 YNB 培养液中培养 10 h 后存
收稿日期 ： 2013-05-25
基金项目 ：国家自然科学基金项目（31070125）
作者简介 ：宋瑛瑾，女，硕士研究生，研究方向 ：微生物与生化药学 ；E-mail ：853462601@qq.com
通讯作者 ：刘晓光，男，教授，博士，研究方向 ：微生物与生化药学等 ；E-mail ：liu.xg @tust.edu.cn
隐球酵母 vps41Δ 菌株转化条件优化及突变体库构建
宋瑛瑾  刘晓光
（工业发酵微生物教育部重点实验室 工业酶国家工程实验室 天津市工业微生物重点实验室
天津科技大学生物工程学院，天津 300457）
摘 要 ： 新型隐球酵母（Cryptococcus neoformans）是一种重要的条件致病性真菌。前期试验证实 VPS41 基因参与隐球酵母
的氮源饥饿应答反应并影响其致病性。系统研究了影响农杆菌介导的 vps41Δ 饥饿应答缺陷型菌株关键因素，并利用优化的农杆菌
转化体系构建了包含 5 000 多个转化子的 vps41Δ 菌株的 T-DNA 插入突变体库，为下一步筛选鉴定隐球酵母 VPS41 饥饿应答信号通
路中的其他相关基因提供了基础材料。
关键词 ： 新型隐球酵母 根瘤农杆菌 vps41Δ T-DNA 突变体库
Optimization of Agrobacterium-mediated Transformation of
Cryptococcus neoformans vps41Δ and Construction of a
Insertional mutagenesis Library
Song Yingjin Liu Xiaoguang
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Industrial
Enzymes，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，the College of Biotechnology，
Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457）
Abstract:  Cryptococcus neoformans is a major human opportunistic fungal pathogens. The previous work has shown that VPS41
gene contributes to virulence by mediating nitrogen starvation response. In this study, major factors affecting the efficiency of Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation of vps41Δ were systematically investigated, and optimized parameters were used to construct an insertional
metagenesis library of the deletion mutant containing over 5 000 transformants. The availability of this insertional library could facilite the
screening and identification of other genes involved in the signaling pathway of starvation response of C. neoformans.
Key words:  Cryptococcus neoformans Agrobacterium tumefaciens vps41Δ T-DNA Mutant library
活率 < 20%，而野生型对照存活率 > 84%）；（3）在
巨噬细胞中的存活能力丧失（和 J773.16 巨噬细胞
株共培养 10 h 后，其存活率 < 8%，而野生型对照 >
90%）。此外，在氮源饥饿的条件下，vps41Δ 突变株
在体外培养表现为细胞周期停滞程序失控，即在饥
饿条件下细胞周期继续进行（DNA 继续复制），而
野生型 H99 的细胞周期则能及时停滞在 G2。以上
结果表明新型隐球菌在氮源饥饿的环境下细胞周期
的及时停滞以及存活能力依赖于 vps41 基因产物的
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期152
功能。但有关 VPS41 在饥饿应答通路中的具体功
能仍不清楚。研究 VPS41 及其相关基因在饥饿反
应中的具体功能的有效方法之一就是筛选在遗传上
和 VPS41 的互作基因。基于这种思路，本研究以
vps41Δ 突变株为出发菌株，通过农杆菌介导（ATMT）
的随机插入突变来筛选抑制或增强 vps41Δ 饥饿应答
缺陷表型的突变体。
与 PEG-法、醋酸锂法、电击法及基因枪法等真
菌遗传转化方法相比，农杆菌介导法（ATMT）具有
操作简便，遗传稳定，转化效率高，重复性好等优点，
因此它成为应用最广的遗传转化方法之一［3-5］。本
研究利用 ATMT 法，对隐球酵母 vps41Δ 进行遗传转
化，并对影响转化效率的关键因素进行研究。利用
优化的农杆菌转化条件构建突变体库，旨在为深入
研究隐球菌抗饥饿相关基因及其分子机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefacie-
ns）LBA4404 本实验室保存，此菌含有 pPzp-HYG 质
粒含有卡那霉素抗性基因和潮霉素基因 ；新型隐球
菌（Cryptococcus neoformans）vps41Δ 缺 陷 性 菌 株 本
实验室保存。
1.1.2 培养基 新型隐球酵母 ：YPD 培养基 ；根癌
农杆菌 LBA4404 ：LB 培养基用于液体培养 ；YEB 培
养基用于固体培养 ；共培养 ：IM 培养基 ；筛选培养
基 ：在 YPD 培养基中加入终浓度为 200 μg/mL 的潮
霉素 B 和终浓度为 40 μg/mL 的头孢霉素。
1.2 方法
1.2.1 农杆菌转化新型隐球菌 vps41Δ 缺陷性菌株
根癌农杆菌介导的遗传转化方法主要参照已经报道
酿酒酵母的方法［6］进行，并作少许修改。
1.2.2 新型隐球菌 vps41Δ 缺陷性菌株对潮霉素的敏
感性检测 将等浓度等体积的隐球菌 vps41Δ 涂布于
含不同浓度潮霉素 B 的 YPD 培养基，使培养基中的
终浓度分别为 0、100、150、200、250 μg/mL，30℃
培养，记录长出菌落数，试验重复 3 次。
1. 2. 3 影响转化率的各种因素
（1）根癌农杆菌浓度 ：在 IM 培养基中取出菌
液进行测定使农杆菌的 OD600 值，分别为 0.2、0.4、
0.6、0.8，进行共培养，分析农杆菌浓度对转化率的
影响［7］。
（2）新型隐球菌 vps41Δ 缺陷性菌株菌体浓度 ：
制备菌悬液使其浓度分别达到 105、106、107、108
个 /mL，进行共培养，分析隐球菌浓度对转化率的
影响［8］。
（3）诱导剂乙酰丁香酮（AS）浓度 ：使 IM 培
养 基 中 的 AS 浓 度 分 别 达 到 50、100、150、200、
250 μmol/L，研究诱导剂乙酰丁香酮（AS）浓度对
转化率的影响［9］。
（4） 共 培 养 温 度 ：将 农 杆 菌 与 新 型 隐 球 菌
vps41Δ 缺陷性菌体混合液均匀涂于 IM 培养基上的滤
膜表面，于 20、22、24、26、28℃共培养，分析共
培养温度对转化率的影响［10，11］。
（5） 共 培 养 时 间 ：将 农 杆 菌 与 新 型 隐 球 菌
vps41Δ 缺陷性菌体分别共培养 12、24、36、48、60 h，
分析共培养时间对转化率的影响［12］。
（6）共培养膜类型 ：分别将农杆菌与新型隐球
菌 vps41Δ 菌体混合涂布在普通纸、定性滤纸、滤膜
上进行共培养，分析膜类型对转化率的影响［13］。
1.2.4 转化子的稳定性分析 随机选取 30 株已获得
的转化子，接种到不含潮霉素 B 的 YPD 平板上，30℃
培养，同样条件下连续转接 10 次后，同时接种出发
菌株作为对照，最后转接到含有潮霉素的平板上。
观察菌落生长情况，计算其稳定性，计算公式如下：
转 化 子 稳 定 性（%）=（ 潮 霉 素 B 抗 性 平 板
上 菌 落 数 / 不 含 潮 霉 素 B 的 YPD 平 板 上 的 菌 落
数 ×100%）。
1.2.5 转化子的 PCR 鉴定 采用裂解法提取新型隐
球菌 vps41Δ 基因组 DNA。根据 pPzp-HYG 质粒上的
潮霉素基因序列设计引物 HYG-F 和 HYG-R，引物
序列为 ：5-GTAAAACGACGGCCAGTC-3，5-ACAG-
GAAACAGCTATGAC-3。
进行 PCR 扩增，反应体系（50 μL）：模板 1 μL，
dNTP（10 mmol/L）1 μL，Mg2+（25 mmo l/L）3 μL，
10×（Taq 缓冲液）5 μL，引物（10 mol/L）各 1 μL，
Taq 酶（5 U/L）1 μL，ddH2O 37 μL。扩增条件：94℃
3 min，94℃ 40 s，59℃ 40 s，72℃ 2 min，30 个循环，
72℃ 延伸 10 min。产物经 1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测。
2013年第12期 153宋瑛瑾等 ：隐球酵母 vps41Δ 菌株转化条件优化及突变体库构建
2 结果
2.1 转化前新型隐球菌vps41Δ缺陷性菌株潮霉素
的敏感性
将新型隐球菌 vps41Δ 缺陷性菌株接种于含有不
同浓度潮霉素 B 的 YPD 培养基上，30℃培养 2 d 后，
经过菌落计数，结果如表 1 所示，潮霉素 B 浓度在
200 μg/mL 时可以抑制隐球菌的生长。
表 1 潮霉素 B 对隐球菌 vps41Δ 生长的抑制作用
潮霉素 B 的浓度（μg/mL） 隐球菌落数（个） 致死率（%）
0 103 0
50 47 54.4
100 16 84.5
150 2 98.1
200 0 100
250 0 100
2.2 影响转化率的各种因素
2.2.1 根癌农杆菌浓度对转化率的影响 如图 1 所
示，农杆菌浓度的升高，转化子数目会随着增加。
但是，如果农杆菌浓度过高，农杆菌的后续生长就
会不易控制，最终会导致污染，选择了 OD600 值 0.6
为农杆菌的最适浓度。
培养基中的终浓度达到 200 μmol/L 时，转化子数目
最多且达到了 61 个 / 平板。再随着 AS 的浓度增高，
转化子的个数反而有所下降，所以，选择了 AS 最
佳浓度为 200 μmol/L。
0
10
20
30
40
50
60
70
0.2
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0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
农杆菌浓度 OD600
图 1 农杆菌浓度对转化率的影响
2.2.2 新型隐球菌 vps41Δ 菌株菌体浓度对转化率的
影响 如图 2 表明，当菌体浓度为 106 个 /mL 时，
转化子数目达到 55 个 / 平皿，虽然在 107、108 个 /mL
也有较高的转化率，但是，在试验中发现高浓度的
受体菌会对转化子的挑选造成困难。所以选择了 106
个 /mL 为受体菌的最适浓度。
2.2.3 诱导剂乙酰丁香酮（AS）浓度对转化效率的
影响 如图 3 所示，在一定范围内，随着诱导剂的
浓度增高，转化子的数量也增多，当 AS 在共培养
0
10
20
30
40
50
60
70
4321 䳀⨳㧼⎃ᓖњ/mL
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1-4 ：分别表示菌体浓度为 105、106、107、108 个 /mL
图 2 隐球菌菌体数对转化率的影响
0
10
20
30
40
50
60
70
80
50 100 150 200 250
AS⎃ᓖμm/L
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图 3 AS 浓度对转化率的影响
2.2.4 共培养温度对转化效率的影响 如图 4 所示。
共培养温度为 24℃时，每个平板可以得到 62 个转
化子，而随温度的继续上升转化子数目有下降的趋
势。这可能是由于促进转化的农杆菌 vir 基因在过高
或过低的温度下表达效率较低，从而使得转化效率
降低。
0
10
20
30
40
50
60
70
80
20 22 24 26 28ޡษޫ⑙ᓖć
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图 4 共培养温度对转化率的影响
2.2.5 共培养时间对转化效率的影响 图 5 结果所
示，在一定的共培养时间内，时间越长得到的转化
子越多。但在共培养的时间达到 60 h 时，转化率存
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第12期154
在下降的趋势，同时在试验中发现共培养时间过长
会导致假阳性的增多。所以，选择的共培养的最佳
时间为 48 h。
提取基因组 DNA 后，进行 PCR 扩增 HYG 基因（图
6），除出发菌株没有扩增出目的条带，5 个转化子
都可以扩增出与 HYG 基因大小一致的目的条带。
0
10
20
30
40
50
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70
12 24 36 48 60ޡษޫᰦ䰤˄h˅
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њ/ᒣ
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图 5 共培养时间对转化率的影响
2.2.6 共培养膜类型的影响 为研究膜类型对转化
率的影响，将农杆菌与新型隐球菌 vps41Δ 混合液涂
布在贴有普通纸、定性滤纸、滤膜的 IM 培养基上进
行转化，发现在普通纸表面，转化子长不出来，而
定性滤纸在转膜时会将转化子遗留在 IM 培养基上。
只有在滤膜上进行共培养，才可以长出转化子同时
转膜时不会影响转化子的顺利长出，可能影响转化
效率的原因有孔径大小、膜厚度等。
2.3 突变株遗传稳定性的分析
在所获得的转化子中，随机选取 50 株突变株进
行稳定性研究。在传代之后进行潮霉素 B 抗性的检
验，结果显示，其中 48 株能在含有 200 μg/mL 潮霉
素 B 的 YPD 培养基上生长，稳定性高达 94%，表明
潮霉素 B 的抗性基因可以稳定遗传。
2.4 新型隐球菌vps41Δ缺陷性菌株转化子的获得
及初步鉴定
根癌农杆菌和新型隐球菌 vps41Δ 在含有 AS 的
培养基上共培养48 h后，去除滤膜，然后继续培养 3-4
d 当可以看到菌落出现时，将菌落挑取，转接至新
的含有 200 μg/mL 潮霉素的选择培养基上培养，再
将可以正常生长，重新转接到潮霉素 B 浓度为 200
μg/mL 的选择培养基上，仍然可以生长的，可初步
认定为突变菌株。经过几次转化统计，农杆菌对隐
球菌 vps41Δ 的转化效率约为 450-650 个转化子 /106
个菌体。
2.5 转化子的PCR验证
挑取隐球菌 vps41Δ 并随机选取 5 株转化子，接
种于 YPD 液体培养基中震荡培养 24 h 后，收集菌体
3.0
2.3
kbkb
1 2 3 4 5 6M
M ：10 kb DNA ladder ；1-5 ：转化子 PCR 结果 ；6 ：出发菌株 PCR 结果
图 6 农杆菌介导转化 PCR 验证
3 讨论
目前利用电转化法和化学转化法转化两种方法
转化新型隐球酵母细胞比较普遍，其中应用的比较
广泛的是电转化。因为电转化法转的转化效率较高，
方法简便易行，但是转化后所形成的转化子里导入
的外源基因会呈线性结构存在于染色体外，这样会
导致转化子不稳定。而 ATMT 法会克服转化子不稳
定的缺点，且此法的转化效率高。一种有效的转化
方法，可以为新型隐球酵母后面的研究工作减少不
必要的失败的同时带来很多便利。
本 研 究 以 隐 球 菌 vps41Δ 为 出 发 菌 株， 利 用
ATMT 法筛选隐球菌 vps41Δ 饥饿应答表型缺陷突变
体，分析了影响转化效率的主要因素后得出最优条
件为 ：农杆菌浓度为 OD600=0.6，隐球菌 vps41Δ 浓度
为 106 个 /mL，AS 浓度最佳为 200 μmol/L，24℃下
共培养 48 h。利用这个转化体系成功构建了一个有
5 000 多株转化子的突变体库，利用 PCR 初步验证
了所得到的转化子。目前现已报道 ATMT 法对隐球
酵母 JEC21（血清型 D）的转化，转化效率可以达到
1/5 600［14］，对 B4500FOA（血清型 D）的转化效率
可以达到 1/610［15］。而本研究以致病性最广泛的属
于血清型 A 的隐球菌 vps41Δ 作为受体菌，得到的转
化效率为 1/1 600。ATMT 产生的突变体存在随机性，
同时具有稳定性高和单拷贝等优点。采用 ATMT 法
可以构建出容量较大的突变体库，获得足够数量的
突变体才能容易的从中筛选出想要的突变表型。当
突变体库足够大时，可以筛选出目标的突变菌株，
通过对从突变体中克隆的相应目标抑制基因的结构
2013年第12期 155宋瑛瑾等 ：隐球酵母 vps41Δ 菌株转化条件优化及突变体库构建
和功能鉴定来明确目标抑制基因在新型隐球菌抗饥
饿信号通路中的功能以及和 vps41 基因功能的内在
联系。这些结果将有助于揭示新型隐球酵母中抗饥
饿信号通路的机制。
4 结论
农杆菌 LBA4404 介导的隐球菌 vps41Δ 的高效转
化体系 ：100 μL 新鲜的菌悬液（106 个 /mL）与等体
积浓度为 OD600=0.6 的农杆菌菌液于 24℃避光共培
养 48 h，在该体系下转化效率为 1/1 600。利用优化
的农杆菌转化体系构建了包含 5 000 多个转化子的
vps41Δ 菌株的 T-DNA 插入突变体库，为筛选鉴定隐
球酵母 VPS41 饥饿应答信号通路中的其他相关基因
提供了基础材料。
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（责任编辑 李楠）