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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第9期
金龙胆草为菊科白酒草属植物苦蒿 Conyza blinii
Lévl. 的干燥地上部分，分布于云南中、南部，四川
攀西地区及贵州部分地区。系 20 世纪 70 年代四川
省发掘的民间草药，具有清热化痰，止咳平喘，解
毒利湿，凉血止血的功效，近年来的研究报道其更
具有一定的抗肿瘤活性［1］。金龙胆草已收录于中国
药典 2010 年版一部及《四川省药品标准》［2］。全
草含萜类、生物碱、皂苷、黄酮及微量的挥发油
收稿日期 ： 2013-05-30
基金项目 ：四川省科技创新苗子工程资助项目（2012ZZ046），攀枝花学院校级科研项目（2012YB03）
作者简介 ：刘姗，女，讲师，博士研究生，研究方向 ：应用分子生物学 ；E-mail ：chuannong2010@126.com
通讯作者 ：陈惠，女，博士，教授，博士生导师，研究方向 ：生物化学与分子生物学 ；E-mail ：chenhui@sicau.edu.cn
野生金龙胆草遗传多样性的 RAPD 分析及总黄酮
成分在局群间的分布特征
刘姗1，2  孙蓉1  唐自钟1  高静雷1  胡洪利1  陈惠1
（1. 四川农业大学生命科学与理学院，雅安 625014 ；2. 攀枝花学院生物与化学工程学院，攀枝花 617000）
摘 要： 探索来自 18 个采集地的金龙胆草 RAPD 遗传性分析及总黄酮成分在局群间的分布特征。采用筛选的 10 个随机引物，
用 NTSYSpc2.1 软件计算材料间的 Jaccard 遗传相似系数（GS），并建立各种间的亲缘关系树形图，并利用紫外分光光度法测试各样
品中总黄酮的含量。10 个引 物共扩出 71 个 DNA 片段，多态性 DNA 片段 68 个，占总扩增数的 97.14%。18 个金龙胆草种源可明
显聚为 2 大类。总黄酮含量以攀枝花市范围的样品含量最高。不同种源金龙胆草间具有丰富的遗传多样性，总黄酮含量分布却与
遗传聚类的分类有差异，提示今后在金龙胆草选育和道地药材研究上应该从多方面进行考虑。
关键词 ： 金龙胆草 RAPD 聚类分析 总黄酮
Genetic Diversity of Wild Populations of Conyza blinii Lévl. and
Extraction of Total Flavonoids
Liu Shan1，2 Sun Rong1 Tang Zizhong1 Gao Jinglei1 Hu Hongli1 Chen Hui1
（1.College of Biology and Science，Sichuan Agricultural University，Ya’an 625014，2.Department of Biological and Chemical Engineering ；
Panzhihua University，Panzhihua 617000）
Abstract:  The genetic relationship of Conyza blinii Lévl. was analyzed in molecular level and the distribution characteristics of total
flavonoid constituents. The RAPD method was applied to the study on Conyza blinii Lévl. from different germplasms by use of 10 random
primers about 10 bp, and the parameters were calculated by NTSYSpc2.1 and the relationship was constructed based on UPGMA. Use UV
spectrophotometry to test total flavonoids in each sample. 10 primers screened out from 100 primers were used for RAPD amplification. A total
of 71 bands were generated, of which 68 bands were polymorphism bands. According to RAPD analysis, 18 germplasms of Conyza blinii Lévl.
were classified into two categories. The genetic diversity of the 18 species in Conyza blinii Lévl. is high and the total flavinoids was related of
geographic distribution.
Key words:  Conyza blinii Lévl. RAPD Cluster analysis Total flavonoids
等次生代谢物［3-8］。由于该植物的系统研究时间较
短，目前尚未有报道涉及到种内遗传关系及遗传多
样性。
本研究以攀西云南两地 18 个个体为对象，采用
RAPD 分子标记技术，结合超声波辅助提取方法测
定这些产地金龙胆草总黄酮的含量，分析金龙胆草
植物种间及种内的遗传多样性及遗传关系，为资源
的可持续利用提供理论依据。
2013年第9期 85刘姗等 ：野生金龙胆草遗传多样性的 RAPD 分析及总黄酮成分在局群间的分布特征
1 材料与方法
1.1 材料
野生金龙胆草植物 18 个样品于 2011 年 7 月由
攀枝花米易县金龙胆草人工种植基地种植农户协助
采集，部分移植于四川农业大学生命理学院农场。
经鉴定为金龙胆草。
1.2 方法
1.2.1 DNA 提取及检测 本研究分别就其新鲜叶片
及硅胶快速干燥的叶片在王珍等［8］的改良 SDS 法基
础上稍作改动，进行基因组 DNA 的提取。取约 0.15
g 新鲜叶片（干样取 1/3 重）置于研钵中以液氮快速
研磨为粉末，将粉末快速转移至 1.5 mL Eppendorf 管
表 1 供试试验材料
序号 材料采集地 供试方式 序号 材料采集地 供试方式
1 四川攀枝花米易县撒莲镇 硅胶干燥叶片 10 四川凉山州会理县彰冠乡马尖峰 新鲜叶片
2 四川攀枝花米易县傈僳族自治乡 新鲜叶片 11 四川凉山州会东县姜州乡弯德村 新鲜叶片
3 四川攀枝花米易县坪山乡 硅胶干燥叶片 12 四川凉山州会东县新云乡猫猫迎 新鲜叶片
4 四川攀枝花盐边县踏蚱村 硅胶干燥叶片 13 四川凉山州德昌县角半沟村
硅胶干燥
叶片
5 四川攀枝花仁和区总发乡板桥村 新鲜叶片 14 四川凉山州德昌县阿月乡仁寿村 新鲜叶片
6 四川攀枝花仁和区拉鲊村 新鲜叶片 15 四川凉山州德昌县前山乡标水岩七队二台坡 新鲜叶片
7 四川攀枝花仁和区平地镇迤沙拉村 新鲜叶片 16 四川凉山州冕宁县
硅胶干燥
叶片
8 四川凉山州会理县龙泉乡龙肘山 新鲜叶片 17 云南省永仁县
硅胶干燥
叶片
9 四川凉山州会理县凤营乡邓家山 新鲜叶片 18 云南省方山胜景
硅胶干燥
叶片
中，加入 800 μL 提取缓冲液（1.4%SDS，100 mmol/L
Tris-HCl，50 mmol/L EDTA，500 mmol/L NaCl，临用
前加入 0.1% 14.4 mol/L β-巯基乙醇及 2%PVP），65℃
水浴 40 min 至溶液变为土黄色，加入 150 μL KAc，
充 分 混 匀， 冰 浴 30 min 以 沉 淀 蛋 白 质 ；室 温 下
12 000 r/ min 离心 15 min，上清液加入 200 μL 氯仿 / 异
戊醇（24∶1）混匀，12 000 r/ min 离心 10 min，反
复操作 2-3 次；上清液加入 0.6 倍体积异丙醇（-20℃
预冷），-20℃冷却 30 min ；离心 5 min 收集沉淀。用
1% 的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 分子量，以 λDNA/
Hind III 为 Maker，核酸蛋白仪（Bio-Rad 公司）测
定 DNA 浓度和蛋白质残留。
1.2.2 RAPD 引物的筛选 PCR 反应所用的试剂购
自天根生化科技（北京）有限公司，10 碱基引物由
英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。共从 100 个
随机引物（10 bp）中筛选出 10 个扩增条带清晰、
多态性明显、反应稳定的引物用于 18 个产地的 PCR
扩增，每个选定的引物重复扩增 2 次。
1.2.3 RAPD-PCR 扩增与产物检测 RPAD 反应体
系由本实验室预先优化的方法进行，即 ：25 μL 体系
中含有 Mg2+ 2.5 mmol/L，dNTPs 4.5 mmol/L，Primer 3.5
μmol/L，DNA 模 板 60 ng，Taq 酶 1.5 U。PCR 扩 增
在 Bio-Rad S1000 Thermal Cycler PCR 仪上进行。扩
增程序为 94℃预变性 4 min，然后进行 40 个循环 ：
94℃变性 1 min、36℃复性 1 min、72℃延伸 2 min，
循环结束后 72℃延伸 10 min，4℃保存。扩增产物
在含 goldview（1%）的 1.8% 的琼脂糖凝胶电泳检测
实验结果，并拍照记录。
1.2.4 数据的采集、统计 用 200 bp DNA ladder 作
分子量标记，对扩增结果，每个样品的扩增带按有
或无记录，有带赋值为 1，无带赋值为 0，得到“0、
1”矩阵。统计过程中只记录重复性好、显带清晰的
带，采用 POPGEN32 软件，计算多态位点数、多态
位点比例、Shannon 信息指数（Shannon’s Information
index，I）、Nei’s 基因多样性（Nei’s gene diversity，
H）及每位点有效等位基因数（Effective number of
alleles，Ne）；用 NTSYSpc2.1 软 件 计 算 材 料 间 的
Jaccard 遗传相似系数（GS），并建立各种间的亲缘
关系树形图 ；应用 SPSS 20.0 统计软件分析处理样品
的总黄酮含量并作出聚类分析。
1.2.5 总黄酮含量的测定 芦丁对照品购自中检所，
按照文献方法进行标准曲线的绘制及含量测定［9］。
供试溶液的制备 ：将金龙胆草全草置于 50℃烘箱中
烘至恒重，粉碎过 65 目筛，精密称取金龙胆草粉末
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第9期86
一定量置于 25 mL 烧杯中，乙醇超声波提取两次，
抽滤合并滤液，用石油醚洗涤 3 次，旋转蒸发后定容，
利用紫外可见光谱仪测定总黄酮吸光值并计算含量。
总黄酮含量的测定 ：分别取一定量的待测提取
液于 50 mL 容量瓶中，按照上述方法配置待测样品
溶液，并测定吸光度。根据回归方程式，求出相当
于样品吸光度的黄酮含量，按下式求出总黄酮含量。
总黄酮含量（%）=（C×V1×V2）/（G×
V3×1000）×100%
式中 ：C 为线性计算出的浓度（mg/mL）；V1 为提取
液定容量（mL）；V2 为测定时定容量（mL）；V3 为
吸取测定量（mL）；G 为称取药材量（g）。
2 结果
2.1 DNA提取结果比较
提取到的金龙胆草基因组 DNA，经琼脂糖凝
胶电泳检测，结果如图 1 所示，18 个样品的基因
组 DNA 在高分子量区均有 1 条清晰的条带，无拖
尾弥散现象，表明所提的 DNA 基本无降解 ；所提
18 个样品的基因组经检测 A260/A280 在 1.6-2.0 之间，
A260/A230 大于均 2.0，说明所提取的基因组 DNA 质量
较好，可满足后续 RAPD 扩增的试验要求。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
M ：λDNA/Hind III ；1-18 ：18 个金龙胆草样品
图 1 18 个样品基因组 DNA 凝胶电泳图谱
2.2 RAPD 扩增结果
在 100 条随机引物中筛选出 10 条对每一个样品
都具有良好扩增效果的引物，条带只记带型清晰的。
图 2 为引物 OPO-20 和 H13 的扩增结果。表 2 列出
了 10 个引物扩增的总带数及多态性条带数。RAPD
反应扩增片段大部分集中在 200-2 000 bp。10 个引
物共扩增出 70 条可区分的 DNA 条带，每个引物可
扩增出 4-11 条多态性带，平均每个引物产生 7 条多
态性带。这 70 条 DNA 扩增条中，有 68 条带呈多态
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
A
B
M ：200 bp DNA ladder ；1-18 ：金龙胆草样品
图 2 引物 OPO-20（A）、H13（B）扩增结果
性，占所观察到的总扩增带的 97.14%。
表 2 引物及其序列和扩增结果
引物 序列（5-3）
DNA 扩增
主带数
多态性带数
多态性带
比例（%）
OPO-5 CCCAGTCACT 6 6 100
OPO-20 ACACACGCTG 10 10 100
H13 ACCCGACACT 11 11 100
H19 GAGTCAGCAG 6 6 100
H29 CCGCATCTAC 6 6 100
H35 TGCGCTCCTC 4 3 75
H37 AGCGCCATTG 7 6 85.7
H38 ACCCGGTCAC 8 8 100
UBC356 GCGGCCCTCT 5 5 100
UBC362 CCCAAGGTCC 7 7 100
合计 - 71 68 -
平均 - 10.14 6.8 97.14
2.3 RAPD聚类及多样性分析结果
根据 PCR 条带进行分析，用 NTSYSpc2.1 软件
计算各样品的遗传距离，各种间遗传相似系数在
0.61-0.93 之间，同时绘制聚类分析树状图（图 3），
18 个样品可以清晰地分为两大类，其中 14、15 样
分为Ⅰ类，其余的样品聚为Ⅱ类。而在Ⅱ类下，除
3 样外其余的样品遗传距离都在 0.77-0.93 之间，说
明这些材料的亲缘关系比较近。
POPGEN32 软件对遗传多样性的分析显示，在
2013年第9期 87刘姗等 ：野生金龙胆草遗传多样性的 RAPD 分析及总黄酮成分在局群间的分布特征
胆草样品主谱带大多一致，说明品种间具有较大的
遗传相似性，但是不同的样品又不同程度存在谱带
间差异，其中攀枝花傈僳族自治乡与凉山州马尖峰
的遗传相似性系数最高为 0.929 577 5，表明两者的
亲缘关系最近。从地理位置来看，并非相近地点采
集的样品就有较高的亲缘关系，如凉山州冕宁县的
样品与采自云南永仁县的样品相隔距离最远，却在
聚类结果上显示了较高的亲缘关系。这有可能是因
为金龙胆草一直以野生为主，被人工驯化栽培［10， 11］
后养殖地点也仅在攀枝花市，因此大范围的野生品
种保留了母体亲本某些遗传特性的缘故。遗传聚类
分析结果显示，本试验结果并不是单纯以地理分布
聚类，如来源于凉山州的样品就有两个被单独聚类。
样品中总黄酮含量的测定显示金龙胆草品质的
分布与地理分布相接近，在 18 个样品中产于攀枝花
地区的样品总黄酮含量要高于其他地区，而云南样
品次之，除个别样品外，地理位置相近的个体，总
黄酮含量高低相类似。这说明植物体内次生代谢物
的产生依然受生长环境影响居多，品种影响次之，
这可能是由于次生代谢产物的产生受气温、海拔和
土壤元素等因素影响更深的原因，与黄璐琦［12］研
究道地药材的生物学模式相符合。
4 结论
首次报道了利用 RAPD 技术进行金龙胆草样品
的遗传多样性的分析研究，并以芦丁为指标含量，
对不同地点金龙胆草进行系统聚类分析。种内种质
资源间的遗传背景较为复杂，在遗传学上的分析结
Coefficient
0.61 0.69 0.77 0.86 0.94
ᬰ᷍㣡᫂㧢䭷
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图 3 聚类分析结果
金龙胆草 18 个居群样本中，14 对引物所检测位点的
平均有效等位基因数为 1.546 4，各居群内的有效等
位基因数介于 1.000 0-1.994 2 之间 ；Nei’s 基因多
样性变动范围为 0.000 0-0.498 5，平均值为 0.308 9 ；
Shannon 多样性指数的变异范围 0.000 0-0.695 8，平
均值为 0.461 0。可见，不同居群的遗传多样比较低。
2.4 总黄酮含量的测试结果
18 个金龙胆草总黄酮的含量及聚类分析，见表
3 和图 4 所示。样品中总黄酮的含量和 RAPD 聚类
结果有一定的相关性，在遗传点距相近的样本中，
总黄酮的含量高低趋势比较接近，但在分类上可以
看出，总的趋势仍然与地理位置分布有较大关系。
表 3 不同来源金龙胆草总黄酮含量
样品号 含量（%） 样品号 含量（%） 样品号 含量（%）
1 3.598 7 8.103 13 5.323
2 7.530 8 7.236 14 4.660
3 8.285 9 6.094 15 6.471
4 5.993 10 7.265 16 8.186
5 6.107 11 5.351 17 7.864
6 7.030 12 5.540 18 8.817
3 讨论
针对野生金龙胆草遗传多样性的 RAPD 分析，
为了排除个体差异，试验所用模板 DNA 都是混合
个体取样，PCR 试验都利用重复试验检查引物是否
扩增良好。从试验结果可以看出，不同种源的金龙
图 4 金龙胆草总黄酮含量聚类分析树状图
0 5 10 15 20 25
5
9
4
15
11
13
12
14
1
8
10
6
2
7
16
3
17
18
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果与其外观形态大体上相似，但是与地理分布却没
有一定的相关性。在进行金龙胆草人工栽培选育工
作时，可考虑分子标记得出的亲缘关系相近，且次
生代谢物含量高的居群进行研究，如攀枝花米易县
的种质资源。金龙胆草的主要药用成分还包含三萜
皂苷及二萜类的苦蒿素。
参 考 文 献
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（责任编辑 李楠）