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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2013年第5期
版纳微型猪主要分布于云南西双版纳傣族自治
州境内的拉祜族、哈尼族，布朗族和瑶族等少数民
族居住地区，是我国珍贵的地方品种资源。主要特
点表现为体型矮小，生长速度缓慢而性成熟早，是
培育医学试验动物理想的素材。版纳微型猪近交系
收稿日期 ：2012-10-16
基金项目 ：云南农业大学动物科学技术学院科研基金项目（SW000126）
作者简介 ：信吉阁，女，博士研究生，实验师，研究方向 ：胚胎生物技术 ；E-mail ：synlelovely@yahoo.com.cn
版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞的分离培养及
性别鉴定
信吉阁1，2  肖晶2  查星琴1，2  成文敏1，2  卿玉波1，2   
潘伟荣1，2  曾养志2  魏红江1，2
（1. 云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201 ；2. 云南省版纳微型猪近交系重点实验室，昆明 650201）
摘 要 : 旨在建立版纳微型猪近交系猪胎儿成纤维细胞分离培养及性别鉴定的技术方法，采用胶原酶消化法分离版纳微型
猪近交系猪胎儿成纤维细胞，同时根据 GenBank 上猪的 SRY 基因序列设计合成一对引物，并以 β-actin 基因为内参基因，利用多重
PCR 进行胚胎性别鉴定，并优化了 PCR 反应条件。结果表明，经胶原酶消化能成功分离版纳微型猪近交系猪胎儿成纤维细胞，2 号、
3 号胚胎提取的 DNA 经多重 PCR 能扩出 309 bp 的 SRY 基因片段和 132 bp 的内参基因片段，为雄性胚胎，1、4、5、6、7 号只扩
增出内参基因，为雌性胚胎。PCR 产物经测序与 NCBI 上发表的 SRY 基因序列比对，同源性为 99%，进一步说明了性别鉴定结果
的正确性。为转基因、基因敲除试验特定性别供体细胞的选择提供可靠的技术依据。
关键词 : 版纳微型猪近交系 胎儿成纤维细胞 SRY 基因
Porcine Fetal Fibroblast Culture and Sex Identification of Banna
Mini-pig Inbred Line
Xin Jige1，2 Xiao Jing2 Zha Xingqin1，2 Cheng Wenmin1，2 Qing Yubo1，2 Pan Weirong1，2
Zeng Yangzhi2 Wei Hongjiang1，2
（1. Animal Science and Technology College，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201 ；2. Key Laboratory of Banna Mini-pig Inbred
Line of Yunnan Province，Kunming 650201）
Abstract:  The present study was designed to culture fetal fibroblast of Banna mini-pig inbred line and built sex identification method.
Experiments were conducted to isolate fetal fibroblast of Banna mini-pig inbred line from embryos by collagenase digestion and identify their sex
using multiplex PCR through optimizing conditions, in which two pairs of primer were designed relatively according to specific fragments in SRY
gene and β-actin gene （as internal control）. The results demonstrated that it could successfully isolate fetal fibroblast of Banna mini-pig inbred
line and the embryo of number 2, 3 were male that could amplify specific DNA sequences of SRY gene （309 bp） and reference gene （132 bp）
by multiplex PCR, and the number 1, 4, 5, 6, 7 were female with only reference gene. The PCR products were sequenced and aligned with SRY
gene sequence published in NCBI. It shared 99% homology and this made to further verify the validity of results. The study provided a reliable
technical basis for the culture of special sex fetal fibroblast in transgene and gene knock-out research.
Key words:  Banna mini-pig inbred line Fetal fibroblast SRY gene
是曾养志教授利用云南特有地方猪种资源，采用连
续高度近交加严格选择的科学方法，历经了早期世
代中存在的严重近交衰退现象，经过 30 多年的连续
高度近交，培育成功的基因高度纯合、遗传背景清
楚而又具有遗传多样性的大型哺乳类试验动物近交
2013年第5期 117信吉阁等 ：版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞的分离培养及性别鉴定
系，在生物医学研究、异种器官移植、转基因动物
研究以及生命科学研究有着广泛的应用前景，并有
望逐步发展形成特有的生物技术产业［1-3］。近年来
云南农业大学魏红江教授建立了动物转基因和体细
胞克隆技术平台，并于 2010 年 1 月得到了世界首只
版纳微型猪近交系克隆猪，并陆续得到了多头克隆
猪和转基因猪，突破了近交系猪克隆技术和转基因
技术［4，5］。
胎儿成纤维细胞是克隆技术和转基因技术中
最常用的供体细胞［6-8］，体细胞克隆技术在动物育
种、制备转基因动物、基因治疗和器官移植等方面
具有重大的作用和广阔的应用前景。而确定克隆和
转基因试验中使用的供体细胞的性别，对下一步的
克隆动物，转基因动物的鉴定、研究和利用有很重
要的意义。目前，其中最为常用的就是 SRY-PCR
法，即通过扩增位于 Y 染色体上的性别决定区（Sex-
Determination Region）的基因片段来判定胚胎或者细
胞的性别［9］，具有特异性强、敏感性高、操作简便、
快速高效等特点，而成为目前应用较为广泛的方法。
本研究采用胶原酶消化法对同胎妊娠 35 d 的 7 只
版纳微型猪胎儿进行成纤维细胞分离培养，并利用
SRY-PCR 法鉴定猪胎儿的性别，旨在建立一种快速、
准确的版纳微型猪近交系猪胎儿性别鉴定方法，为
进一步的转基因、基因敲除研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物 剖腹产手术采集发育到约 35 d 的
版纳微型猪近交系猪胎儿，共 7 头（编号 1、2、3、4、
5、6、7），放入到含 10% FBS 的 DMEM 中，用冰盒
中带回实验室细胞间。
1.1.2 试剂 DMEM/F12 培养基、青霉素、链霉素、
血 清 购 自 Gibco 公 司 ；胶 原 酶、 配 置 PBS 所 用 的
试剂购自 Sigma 公司 ；细胞培养所用的耗材为 JET
BIOFIL（广州）产品。细胞基因组提取试剂盒购自
于天根公司，引物由上海生工公司合成，Taq 酶、
Marker 等分子试剂购自 TaKaRa 公司；M（公猪）、F（母
猪）这 2 头已知性别猪的基因组 DNA 由实验室提供。
1.2 方法
1.2.1 胎儿成纤维细胞的分离培养 小心剥离胎儿
及胎衣，将胎儿放置在 PBS（含 100 IU/mL 青霉素，
100 μg/mL 链霉素）中，去除头，四肢，内脏等组织，
清洗 3 遍后剪碎整个胎儿组织，加入 1 mg/mL 胶原
酶消化液 10 mL，放入 37℃培养箱消化 2-4 h，其间
吹打几次并观察消化情况 ；消化完毕后，将其转移
到 15 mL 的离心管中，1 000 r/min，5 min，收集细胞，
弃上清后将细胞用 DMEM/F12+10% FBS 清洗两次，
用含 15% 的 FBS，100 IU/mL 青霉素，100 μg/mL 链
霉素的 DMEM/F12 培养细胞。第 2 天观察细胞贴壁
情况，并换液，细胞形成细胞单层（80%-90% 汇合）
后进行传代培养。
1.2.2 胎儿成纤维细胞基因组的提取 取 6 孔板中
的一孔细胞，用 0.05% Trysin-EDTA 消化 3 min，离
心收集细胞沉淀，按照天根公司基因组提取试剂盒
的操作说明提取 7 个细胞系的 DNA，使用紫外分光
光度计检测提取到的基因组 DNA 浓度。
1.2.3 引 物 设 计 与 SRY-PCR 参 照 GenBank 中 猪
SRY 基 因（GenBank 登 录 号 ：U49860.2） 和 β-actin
基因（GenBank 登录号 ：XM_003124280.2）的基因
序列，使用引物设计软件 Primer Premier5.0，设计 2
对 PCR 扩增引物，引物序列为 ：SRY-Forward Primer
（SRY-F）：5-GCTCTCATTGTGTGTTCTCGT-3，SRY-
Reverse Primer（SRY-R）：5-CTTAGCGACTGTGTAT-
GTGTAG-3，β-actin-Forward Primer（β-actin-F）：5-
CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3，β-actin-Reverse
Primer（β-actin-R）：5-GTGATCTCCTTCTGCATCCT-
GT-3，扩增片段大小分别为 309 bp 和 132 bp。其
中 β-actin 基因作为内参基因，并以已知性别的公猪
（M）为阳性对照，母猪（F）为阴性对照，进行多
重 PCR。
采用 20 μL 反应体系，Ex Taq 0.5 μL，25 mmol/L
dNTP Mix buffer 2 μL，10× Ex Taq Buffer 2 μL，10
pmol/μL 引 物 SRY-F、SRY-R、β-actin-F、β-actin-R
各 1 μL， 基 因 组 DNA 模 板 1 μL（2.5 ng），ddH2O
10.5 μL。反应采用 Touchdown 程序，条件为 ：95℃
预变性 3 min ；95℃变性 30 s，65℃退火 30 s，72℃
延伸 30 s，10 个循环 ；95℃变性 30 s，56℃退火 30
s，72℃延伸 30 s，25 个循环 ；72℃延伸 8 min。取
5 μL PCP 产物进行 2% 琼脂糖凝胶电泳检测分析。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2013年第5期118
2 结果
2.1 猪胎儿成纤维细胞的分离培养
经胶原酶分离，镜下观察可见到大量单个细胞
悬浮在培养液中。接种培养 6 h 后观察到大部分细
胞贴壁，细胞呈圆形，尚未伸展。12 h 后观察，已
有许多细胞贴壁，并开始伸展，原来圆形细胞伸出
伪足，细胞形状不规则。培养 3-5 d 后，细胞伸展，
呈梭形、多角形等，为典型的成纤维细胞形态，胞
质近中央处有椭圆形细胞核，核仁清晰可见。细胞
生长旺盛，3-4 d 后，细胞已汇合成单层铺满培养瓶
底壁，可传代或冻存（图 1）。
泳道为单一的内参基因扩增公猪 M，母猪 F 的基因
组 DNA，扩增出 132 bp 的 β-actin 基因片段。
PCR 产物送上海生工生物工程股份有限公司测
序。测序结果与 NCBI 上发表的 SRY 基因序列比对，
具有 99% 同源性，进一步说明了性别鉴定结果的正
确性。
A
C
B
D
A ：分离消化得到的成纤维细胞 ；B ：培养 12 h 后贴壁的细胞 ；C ：48 h 后
伸展的细胞 ；D ：汇合成单层的细胞（100×）
图 1 猪胎儿成纤维细胞
2.2 PCR扩增及性别鉴定结果
共提取了 7 个版纳微型猪成纤维细胞系细胞的
基因组，经过紫外分光光度计的检测，其浓度和纯度
均符合扩增要求。图 2 显示，公猪 M（阳性对照）扩
增出了 2 条带，分别为 309 bp 的 Y 染色体特异 SRY
基因片段和 132 bp 的 β-actin 基因片段 ；母猪（阴性
对照）只扩增出 132 bp 的 β-actin 基因片段；在水（空
白对照）中，没有扩增出任何条带。2、3 泳道扩增
出 SRY 基因片段和内参基因片段，应为雄性胚胎，1、
4、5、6、7 泳道只扩增出内参基因，应为雌性胚胎，
8 泳道为公猪 M（阳性对照），9 泳道为母猪 F（阴
性对照），10 泳道为单一 SRY 基因引物扩增公猪基
因组 DNA，扩增出 309 bp SRY 基因片段，11、12
2000
bp
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Blank
1000
750
500
250
SRY
β actin
100
M ：Marker DL2000 ；1-7 ：1 号至 7 号猪胎儿 ；8 ：阳性对照 ；9 ：阴性对照 ；
10 ：单一 SRY 基因引物扩增公猪基因组 ；11，12 ：单一 β-actin 基因引物扩
增公猪、母猪基因组 ；Blank ：空白对照
图 2 胎儿成纤维细胞系 PCR 性别鉴定结果
3 讨论
本试验中采用胶原酶分离法成功获得了 7 只猪
胎儿的成纤维细胞，为后续的核移植研究、诱导性
多功能干细胞研究奠定了基础。试验中用到的胶原
酶一般是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，
主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。如消化的组织
较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，可采用胶
原酶解离细胞法，适用于消化分离纤维性组织、上
皮及癌组织，Ca2+、Mg2+ 和血清对其活性无抑制作
用，对细胞损伤小。使用时应选择适宜的浓度、温
度和作用时间［10］。多个研究报道采用胶原酶消化法
成功分离了猪胎儿成纤维细胞［11，12］。但试验中发现
因为胚胎组织细胞种类较多，虽然除去头、尾、四
肢、内脏等，但仍然可见到上皮样细胞（呈星型或
三角状）、神经细胞、游走型细胞。这些杂细胞会在
反复传代过程中被逐渐淘汰掉。随着培养时间的延
长，整个细胞群体呈现火焰状和旋涡状成群细胞呈
现放射状、漩涡状等形式。
家畜早期胚胎的性别鉴定是家畜胚胎移植的重
要内容，对实现动物性别的人为控制具有重要意义。
而在转基因动物生产以及基因敲除研究中，人为控
2013年第5期 119信吉阁等 ：版纳微型猪近交系胎儿成纤维细胞的分离培养及性别鉴定
制出生后代的性别，可以最大限度地利用其与性别
相关的性状，提高科研价值和经济效益。SRY 基因
是睾丸决定因子的最佳候选基因，普遍存在于哺乳
动物 Y 染色体中，SRY 基因的检测可以特异而快速
地判定性别。研究者李小平［13］，曹海峰［14］和尹智［11］
也采用了类似 PCR 的方法鉴定了猪胎儿的性别，本
试验采用的 SRY-PCR 方法，完成了 7 只版纳微型猪
胎儿的性别鉴定，避免了利用巢式 PCR 方法从核移
植胚胎中获得细胞对胚胎的损伤，解决了需进行两
轮 PCR，试验繁琐、时间长的问题。另外 PCR 反应
采用 Touchdown 程序，优化了扩增环境，避免了普
通多重 PCR 扩增只有一个退火温度，引物之间退火
温度不一致，影响扩增效率的问题，降低了试验难度。
同时与染色体核型分析法，抗原法，X 染色体相关
酶法，染色体特异 DNA 探针法等性别鉴定方法相比，
SRY-PCR 应用性更强，可在生产实践广泛地推广。
4 结论
采用胶原酶消化成功分离版纳微型猪胎儿进行
成纤维细胞，并利用 SRY-PCR 法鉴定了猪胎儿的性
别，建立了一种快速、准确的版纳微型猪近交系猪
胎儿性别鉴定的方法，为转基因、基因敲除试验特
定性别供体细胞的选择提供可靠的技术依据。
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（责任编辑 马鑫）