全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2014年第8期
动物乳腺生物反应器是指通过转基因动物乳腺
大规模生产供治疗人类疾病和保健用的药用蛋白或
其它生物活性物质［1］。转基因动物的乳腺可代替细
菌和细胞等生物发酵，对所生产的蛋白质进行翻译
后有效地加工和修饰。因而，动物乳腺生物反应器
被国际上公认为是转基因动物研究中最具有发展前
景的方向之一，也是实现基因工程制药的重要途径。
多年来对乳腺生物反应器的研究已积累了许多方法
和经验，并在研究中产生了约 100 种药物的乳腺生
收稿日期 ： 2014-01-18
基金项目 ：国家自然科学基金资助项目（31060304），内蒙古高等学校科学研究项目（NJ10184）
作者简介 ：虞飞，男，硕士研究生，研究方向 ：基因工程 ；E-mail ：1012058164@qq.com
通讯作者 ：张学明，男，副教授，研究方向 ：重组药物蛋白 ；E-mail ：byzhxm@126.com
重组人 gdnf 乳腺特异表达载体转染牛胎儿
成纤维细胞的研究
虞飞  李斌  张晶晶  丁海麦  张学明
（内蒙古科技大学包头医学院，包头 014040）
摘 要 ： 为了制备重组人 GDNF 牛乳腺生物反应器，采用组织块贴壁法分离培养雌性牛胎儿成纤维细胞，连续继代培养 75
d，进行形态观察和染色体分析，在此基础上，转染带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双重筛选标记的重组人 gdnf 乳腺特异表达载
体 pNR-GDNF，G418 筛选阳性抗性克隆，进行 PCR 法鉴定。结果表明，分离培养的牛胎儿成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖
特性和染色体数目 ；目的基因已整合到转基因细胞的染色体上。
关键词 ： 牛胎儿成纤维细胞 分离培养 转基因 GDNF
Transfection of Bovine Fetal Fibroblast with the Vector for Expressing
Human GDNF Specifically in Mammary Gland
Yu Fei Li Bin Zhang Jingjing Ding Haimai Zhang Xueming
（Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014040）
Abstract:  In order to prepare bovine mammary gland bioreactor for production of human recombinant GDNF, the female bovine fetal
fibroblast cells were successfully isolated using tissue bulk attachment. The fibroblast cells were cultured consecutively for 75 days for further
morphologic observation and chromosome analyzing. The plasmid vector pNR-GDNF, which contained the Neor gene and the DsRed2 gene as
positive selection marker genes and human GDNF cDNA gene regulated by bovine beta-casein promoter for specific expression in mammary
gland, was transfected into the bovine fetal fibroblast cells by electroporation. After selection with G418 for 7 days, resistant cells expressing red
fluorescence protein were isolated, cultured, expanded and cryopreserved by standard procedures. The transgenic cells were indentified by PCR.
The results showed that bovine fetal fibroblast cells possessed normal morphology, multiplication characteristics and chromosome number and
the foreign gene was integrated into the genome.
Key words:  Bovine fetal fibroblast Isolation and culture Gene transfer GDNF
物反应器［2］，其中最具有标志性的成果是 GTC 公
司用转基因山羊乳腺生物反应器生产的人抗凝血酶
ATryn® 于 2006 年经欧洲医药评价署批准进入治疗
应用［3］。
胶质细胞系源性神经营养因子（Glial cell line-
direved neurotrophic factor，GDNF） 是 一 种 分 泌 性
糖蛋白，属于 TGF-β 超家族成员［4］。GDNF 对多巴
胺能神经元具有营养及保护作用，在帕金森病及其
它神经损伤疾病的治疗方面显示出了巨大的应用前
2014年第8期 103虞飞等 ：重组人 gdnf 乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究
景［4-9］。基于动物试验的成功研究，GDNF 用于帕金
森病的治疗已进入二期临床研究［9-13］。然而 GDNF
在人和动物体中含量很低，从动物体中制备 GDNF
用于疾病动物模型和临床试验研究是不现实的［14］。
因而，应用生物反应器大量生产重组人 GDNF 用于
疾病动物模型和临床试验研究具有潜在的重大社会
效益和经济效益。
本研究采用组织块贴壁法分离培养了雌性牛
胎儿成纤维细胞，用电击转染法将以 neo 基因和
DsRed2 作为双筛选因子的牛 β-casein 基因 5 端调控
序列驱动的重组人 gdnf 乳腺特异表达载体转入体外
培养的牛胎儿成纤维细胞，为进一步应用体细胞核
移植法制备重组人 gdnf 牛乳腺生物反应器的研究奠
定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 活体材料 1-3 月龄牛胎儿取自本地屠宰场。
1.1.2 质粒载体 重组人 gdnf 乳腺特异表达载体
pNR-GDNF（图 1），本实验室构建。
1.2 方法
1.2.1 组织块法分离和培养牛胎儿成纤维细胞 采
自屠宰场的牛子宫（含胎儿）于 37℃灭菌生理盐
水中带回实验室，无菌操作挑选雌性胎儿，PBS
清洗。参照文献［15］方法，取胎儿耳部组织于
DMEM/F12 + 10% FBS 中剪成约 1 mm3 小块，用相同
培养液洗 3 遍，然后将组织块连同培养液一起转移
到培养瓶中，轻轻摇动使组织块成均匀分布，吸干
组织块周围的培养液，倒置放入培养箱中培养 3 h。
待组织块贴壁后，缓缓加入适量培养液，继续培养。
每天观察并记录细胞的生长情况。待生长的细胞铺
满瓶底时，去除组织块，传代扩大培养后，冷冻
保存。
1.2.2 牛胎儿成纤维细胞中期染色体数目分析 参
照文献［15-17］方法，待细胞生长至汇合度达到
70%-80% 时，于 4℃冰箱中放置 15 h 后，加入终
浓度为 0.1 μg/mL 秋水仙素，37℃处理 3 h ；收集脱
壁细胞，加入 37℃预热的 0.075 mol/L KCl 5 mL，于
37℃低渗处理 30 min 后，再加入 1 mL 4℃预冷的
固定液预固定 3 min，低速离心 10 min，去上清液 ；
加入固定液 6 mL，室温固定 30 min，低速离心 10
min，小心吸出大部分上清液，留少量固定液重悬细
胞进行滴片 ；室温自然干燥后，吉姆萨染色 30 min，
显微镜下观察拍照，分析核型。
1.2.3 牛胎儿成纤维细胞对 G418 耐受性的检测 将
培养至第 3 代的细胞以 5×104 个细胞 / 孔的密度接
种于两个 12 孔板中，当细胞生长至 80% 汇合度时，
更换培养液，同时在 12 孔板中分别加入 G418 至终
浓度为 0、100、200、300、400、500、600、700 和
800 μg/mL，每种浓度接种 2 孔细胞，每 2 d 换液 1 次，
每天观察细胞生长情况，记录培养在不同 G418 浓
度中的细胞全部被杀死的时间。试验重复 2 次。以
7-10 d 内杀死全部细胞的 G418 的浓度作为筛选时
的最适合浓度。
1.2.4 电穿孔法转染牛胎儿成纤维细胞 取对数生
长期的细胞，调整密度为 1×107/mL ；取 400 μL 细
胞悬液加入到间距 4 mm 电击杯中，加入 12 μg 线性
化的质粒 pNRTCNbG 使其终浓度为 30 μg/mL，轻轻
敲击杯底使 DNA 和细胞混匀，550 V 电压、50 μF
图 1 pNR-GDNF 载体图谱
Promotor
Apa I
Kan
Amp
Hind III
gdnf
SV40polyA
PGK
neo
polyA
BamH I
DsRed2
LoxP
pNR-GDNF
11 507 bp
1.1.3 主要试剂及耗材 DMEM/F12，G418，胰蛋
白酶（Trypsin）购自 Sigma 公司 ；Taq DNA 聚合酶，
限制性内切酶购自 TaKaRa 公司 ；标准胎牛血清为
TBD 产品 ；无机盐类为日本和光试剂 ；无内毒素质
粒提取试剂盒、DNA 纯化试剂盒购自 QIAGEN ；培
养瓶，培养皿均为 Corning 公司产品 ；细胞培养板为
Nunc 产品 ；PCR 引物由上海生工生物工程技术服务
有限公司合成。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期104
电容条件下电击转染，电击完成后，电击槽中静置
1 min，冰浴 2 min，然后将细胞以 1×106 密度接种
于 100 mm 培养皿中，于 37℃、5% CO2、饱和湿度
条件下培养。
1.2.5 稳定转染细胞的筛选 转染的细胞培养 48 h
后，收集细胞，重新以 3×105 个细胞密度接种于
100 mm 培养皿中，加入 G418 至终浓度 500 μg/mL，
继续培养，每 2 d 换液 1 次，8-10 d 后，在荧光显
微镜下标出红荧光细胞克隆 ；用克隆杯法分离红荧
光克隆细胞，接种于 6 孔板中扩大培养，待细胞生
长至基本汇合时，冷冻保存。
1.2.6 转基因细胞的鉴定 提取稳定转染细胞基因
组 DNA，PCR 检测 gdnf cDNA 是否整合到细胞基因
组 DNA 中。PCR 上游引物 ：5-GACCTCGAGATGAA
GTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3，下游引物：5-GA
GCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3 ；反应
条件为 ：94℃变性 45 s，58℃复性 45 s，72℃延伸 1
min，共 35 个循环。
1.2.7 数据分析 使用 SPSS11.0 软件对数据进行 x2
检验分析，P < 0.05 为显著差异。
2 结果
2.1 组织块分离培养牛胎儿成纤维细胞的形态学
观察
组织块贴壁培养 3-4 h，加入培养液后仅有极
少数组织块漂浮，大部分组织块已贴壁 ；培养 1 d
后，部分组织块边缘开始游离出少许成纤维细胞（图
2-A）；培养 2 d 后，多数组织块周围已有均匀的成
纤维细胞迁出（图 2-B）；培养 4 d 后，组织块周围
的成纤维细胞生长旺盛，数量明显增多，向四周扩
散（图 2-C）；培养 6 d 后，组织块周围的细胞已生
长至完全汇合，且铺满了瓶底（图 2-D）；去除组织块，
胰蛋白酶消化，转至 T75 培养瓶中继续培养，待细
胞生长至 80% 汇合时，冷冻保存，留少量细胞继续
传代培养 ；随着传代次数的增多，绝大部分细胞呈
纤维状，高度汇合的细胞呈旋涡状生长（图 2-E）；
说明在细胞生长过程中，成纤维细胞呈优势生长且
在细胞群中占主导地位 ；传代培养 75 d 后，细胞呈
衰老状态，生长变得极缓慢，细胞体积增大，扁平化，
有空泡出现等现象（图 2-F）。
2.2 牛胎儿成纤维细胞的染色体数目分析
取传代培养 15 d 和 60 d 的牛胎儿成纤维细胞进
行分裂中期相染色体制片，其中选择分散良好、轮
廓清晰的分裂相进行染色体形态观察和数目统计。
结果（图 3）表明，绝大多数细胞染色体为 2n=60，
58 条常染色体为端部着丝粒，2 条性染色体为中部
着丝粒。染色体倍型分析结果表明，培养 15 d 的牛
胎儿成纤维细胞染色体成二倍性的比例为 83.3%，
培养 60 d 的细胞二倍体比例为 77.8%，经 x2 检验，
二者之间无显著差异（表 1）。染色体组型分析表明
体外长期培养的牛胎儿成纤维细胞能够进行正常的
染色体复制和分裂。
2.3 牛胎儿成纤维细胞对G418的耐受性检测
利用不同浓度的 G418 筛选，结果发现，G418
的浓度在 200-900 μg/mL 的范围时，对牛胎儿成纤
维细胞有明显的毒害作用，细胞全部被杀死的培养
时间随 G418 浓度的增大而缩短。G418 浓度为 500
μg/mL 时，细胞培养 7 d 被全部杀死 ；G418 浓度为
A B
C D
E F
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
50 μm 50 μm
A ：组织块培养 1 d，已有少量成纤维细胞细胞迁出 ；B ：组织块培养 2 d 后，
组织块周围已有均匀的成纤维细胞生长 ；C ：组织块培养 4 d，成纤维细胞
生长旺盛 ；D ：组织块培养 6 d，各组织块周围的成纤维细胞已生长至完全
汇合 ；E ：传代培养 30 d 的成纤维细胞 ；F ：传代培养 75 d 的成纤维细胞
图 2 牛胎儿成纤维细胞的体外培养
2014年第8期 105虞飞等 ：重组人 gdnf 乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究
600 μg/mL 时，细胞培养 6 d 被全部杀死（图 4）。因
此后续转染试验中使用的 G418 浓度为 500 μg/mL。
图 4 牛胎儿成纤维细胞对不同浓度 G418 的耐受性
A ：相差显微镜，Bar=50 μm ；B ：荧光显微镜，Bar=50 μm
图 5 转基因牛胎儿成纤维细胞
A B
A ：培养 15 d 的细胞 ；B ：培养 60 d 的细胞
图 3 体外培养的牛胎儿成纤维细胞的染色体图
0
5
10
15
20
100 200 300 400 500 600 700 800 900
G418 ⎃ᓖμg/mL㓶㜎ޘ䜘㻛ᵰ↫Ⲵᰦ䰤d
2.4 稳定转染细胞的筛选及PCR鉴定
电击转染的牛胎儿成纤维细胞，用 G418 筛选 7
d 后，用克隆杯分离形态正常、生长旺盛的红荧光
抗性克隆，接种到 6 孔板中生长至基本汇合度时（图
5），胰蛋白酶消化，冷冻保存。取少量扩培细胞，
提取基因组 DNA，PCR 法检测，得到了 576 bp 预期
条带（图 6）表明，目的基因已整合到转基因细胞
的染色体上。
3 讨论
自 1997 年体细胞克隆羊多莉［18］诞生以来，对
体细胞进行遗传修饰后作为核移植供体细胞制备转
基因动物已成为乳腺生物反应器研制的一种理想策
50 μm
A B
50 μm
576750
bp
1 2 3 4 5 6
bp
500
1 ：DNA 分子量标准 DL2000 ；2 ：H2O（阴性对照）；3 ：非转基因细胞（阴
性对照）；4，5 ：转基因细胞 ；6 ：pNR-GDNF（阳性对照）
图 6 转基因细胞的 PCR 检测
略。用于体细胞核移植的供体细胞种类非常广泛，
包括来自胎儿或成体的成纤维细胞、乳腺上皮细胞、
颗粒细胞、肌肉细胞、输卵管上皮细胞、睾丸生殖
细胞、支持细胞、肝细胞、神经细胞等［19］。由此可
见，多种分化的体细胞甚至是分化终端的体细胞，
其细胞核在卵母细胞质的作用下经重编程后仍具有
全能性。但由于受到转基因技术的要求，外源基因
稳定转染后用于核移植的供体细胞的种类却很少。
对于转基因体细胞克隆动物的制备，从细胞的转染
到阳性克隆的获得再到扩大培养至少需要 30-40 d，
再加上原代细胞培养及细胞纯化，到转基因细胞核
移植时，细胞在体外培养至少需要 50-60 d，远比大
多数体细胞核移植所用的供体细胞在体外培养的时
间长［15］。胎儿成纤维细胞具有易分离、易培养、传
代次数较多、体外培养时间长、核型较稳定等优点，
可以满足筛选时体外培养时间长的要求，是目前最
理想的可用于遗传修饰的供体细胞。已成功的转基
因克隆绵羊［20，21］、山羊［22］、猪［23］、牛［24，25］都是
使用基因打靶胎儿成纤维细胞作为核供体细胞而制
备的。本研究分离培养的牛胎儿成纤维细胞呈典型
的纤维状，生命力旺盛，可连续传代培养达 75 d，
对连续培养 60 d 的细胞进行初步的核型分析表明细
表 1 牛胎儿成纤维细胞染色体标本分析
细胞培养的
时间（d）
观察染色
体标本数
染色体正常的
细胞数（2n=60）
核型正常
比率（％）
15 48 40 83.3（40/48）
60 45 35 77.8（35/45）
经 x2 检验，二组核型正常率无明显差异（P>0.05）
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2014年第8期106
胞仍具有稳定的遗传特性，可以满足体外遗传修饰
的要求。
研究者［26，27］认为，用混合的转基因细胞克隆
进行随机整合转基因克隆动物的制备可以避免将研
究集中于少数几个发育潜能未知的单细胞克隆而导
致灾难性后果，而且短期抗性筛选得到的混合转基
因克隆细胞比转染后长期药物筛选得到的单克隆细
胞更适合于核移植 ；同时，这种策略可以增加后代
中基因插入位点的可能性，从而有可能筛选出高表
达的转基因系。本研究使用重组人 gdnf 乳腺特异表
达载体以 neo 基因和 DsRed2 作为双筛选因子，电击
转染的牛胎儿成纤维细胞，用 G418 筛选 7 d 后，用
克隆杯分离形态正常、生长旺盛的红荧光抗性克隆，
接种到 6 孔板中生长至基本汇合度时，冷冻保存，
避免了长时间抗性筛选对核供体细胞带来的不利影
响 ；同时使用 DsRed2 作为筛选因子，选用表达红荧
光蛋白的细胞作为核供体可排除非转基因细胞用于
核移植的风险。
4 结论
本研究采用组织块贴壁法分离培养了雌性牛胎
儿成纤维细胞，用重组人 gdnf 乳腺特异表达载体
pNR-GDNF 转染细胞，经抗性筛选及 PCR 鉴定，获
得了稳定转染重组人 gdnf 的转基因细胞，为进一步
应用体细胞核移植法制备重组人 GDNF 牛乳腺生物
反应器的研究奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Clark AJ. The mammary gland as a bioreactor ：expression,
processing, and production of recombinant proteins［J］. J
Mammary Gland Biol Neoplasia, 1998, 3（3）, 337-350.
［2］Houdebine LM. Use of transgenic animals to improve human health
and animal production［J］. Reprod Dom Anim, 2005, 40 ：269-
281.
［3］Bösze Z, Baranyi M, Whitelaw CB. Producing recombinant human
milk proteins in the milk of livestock species［J］. Adv Exp Med
Biol, 2008, 606 ：357-393.
［4］Kitagawa H, Hayashi T, Mitsumoto Y, et al. Reduction of ischemic
brain injury by topical application of glial cell line-derived
neurotrophic factor after permanent middle cerebral artery occlusion
in rats［J］. Stroke, 1998, 29（7）：1417-1422.
［5］Li L, Wu W, Lin LF, et al. Rescue of adult mouse motoneurons from
injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic
factor［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92 ：9771-9775.
［6］Kim BT, Rao VL, Sailor KA, et al. Protective effects of glial cell line-
derived neurotrophic factor on hippocampal neurons after traumatic
brain injury in rats［J］. J Neurosurg, 2001, 95 ：674-679.
［7］Tomac A, Lindqvist E, Lin LF, et al. Protection and repair of the
nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo［J］Nature,
1995, 373 ：335-339.
［8］Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in
parkinsonian monkeys treated with GDNF［J］. Nature, 1996,
380 ：252-255.
［9］Gill SS, Patel NK, Hotton GR, et al. Direct brain infusion of glial
cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease［J］. Nat
Med, 2003, 9 ：589-595.
［10］Love S, Plaha P, Patel NK, et al. Glial cell line-derived neurotrophic
factor induces neuronal sprouting in human brain［J］. Nat Med,
2005, 11 ：703-704.
［11］Patel NK, Bunnage M, Plaha P, et al. Intraputamenal infusion
of glial cell line-derived neurotrophic factor in PD ：a two-year
outcome study［J］. Ann Neurol, 2005, 57 ：298-302.
［12］Slevin JT, Gerhardt GA, Smith CD, et al. Improvement of bilateral
motor functions in patients with Parkinson disease through
the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived
neurotrophic factor［J］. J Neurosurg, 2005, 102 ：216-222.
［13］Patel NK, Pavese N, Javed S, et al. Benefits of putaminal GDNF
infusion in Parkinson disease are maintained after GDNF
cessation［J］. Neurology, 2013, 81 ：1176-1178.
［14］张学明 , 罗奋华 , 苏惠敏 , 等 . 人 gdnf 基因的克隆及其在牛
β-酪蛋白基因座定位整合载体的构建［J］. 生物技术通报 ,
2009（5）：113-118.
［15］尹明 , 章轶哲 , 多曙光 . 胎牛成纤维细胞的分离培养［J］. 实
验动物科学 , 2010, 27（3）：1-6.
［16］梁伟 , 肖红 , 高笑宇 , 等 . 小鼠 KGF 基因毛囊特异性表达载体
的构建及 mESC 脂质体悬浮转染条件的优化［J］. 生物技术
通报 , 2011（11）：107-117.
［17］Yan XR, Yang YH, Liu W, et al. Differentiation of neuron-like cells
from mouse parthenogenetic embryonic stem cells［J］. Neural
Regeneration Research, 2013（4）：293-300.
2014年第8期 107虞飞等 ：重组人 gdnf 乳腺特异表达载体转染牛胎儿成纤维细胞的研究
［18］Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, et al. Viable offspring derived
from fetal and adult mammalian cells［J］. Nature, 1997, 385
（6619）：810-813.
［19］Denning C and Priddle H. New frontiers in gene targeting and
cloning ：success, application and challenges in domestic animals
and human embryonic stem cells［J］. Reproduction, 2003, 126 ：
1-11.
［20］Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, et al. Human factor IX
transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected
fetal fibroblasts［J］. Science, 1997, 278（5346）：21.
［21］McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KHS, et al. Production of
gene targeting sheep by nuclear transfer from cultured somatic
cells［J］. Nature, 2000, 405 ：1066-1069.
［22］Baguisi A, Behboodi E, Melican DT, et al. Production of goats by
somatic cell nuclear transfer［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（5）：
456-461.
［23］Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, et al. Production of a-1,
3-galactosyl transferase knockout pigs by nuclear transfer
cloning［J］. Science, 2002, 295 ：1089-1092.
［24］Wells DN, Misica PM, McMillan WH, et al. Production of cloned
bovine fetuses following nuclear transfer using cells from a fetal
fibroblast cell line［J］. Theriogenology, 1998, 49 ：330.
［25］Kuroiwa Y, Kasinathan P, Matsushita H, et al. Sequential targeting
of the genes encoding immunoglobulinm and prion protein in
cattle［J］. Nat Genet, 2004, 36 ：775-780.
［26］Chen SH, Vaught TD, Monahan JA, et al. Efficient production of
transgenic cloned calves using preimplantation screening［J］.
Biol Reprod, 2002, 67 ：1488-1492.
［27］杨东山 , 杜晨光 , 高飞 , 等 . 牛胎儿成纤维细胞的组织块贴附
法分离培养与电穿孔法基因转染［J］. 动物学研究 , 2006, 27
（1）：41-47.
（责任编辑 李楠）